陳新華+萬煒+馮淑軍+段立清

摘 要：研究香茅油（Citronella oil）對(duì)枸杞蚜蟲（Aphis sp.）的毒力及乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）和Na+-K+-ATPase活性的影響，為尋找無公害防治枸杞蚜蟲的方法提供理論依據(jù)。采用玻璃管藥膜法進(jìn)行生物測(cè)定，評(píng)估其對(duì)枸杞蚜蟲的毒力。測(cè)定其對(duì)蚜蟲離體AChE和Na+-K+-ATPase活性的影響。香茅油的LC50為11.97mL/L，對(duì)枸杞蚜蟲離體AChE和Na+-K+-ATPase活性均有抑制作用，其中對(duì)Na+-K+-ATPase活性表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。香茅油對(duì)枸杞蚜蟲有觸殺毒力，對(duì)枸杞蚜蟲離體AChE和Na+-K+-ATPase活性均有抑制作用。

關(guān)鍵詞：香茅油；毒力；枸杞蚜；乙酰膽堿酯酶；Na+-K+-ATPase

中圖分類號(hào)：S482 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170833060

枸杞（Lycium barbarum L.）為茄科多年生落葉灌木，是著名藥用植物和出口產(chǎn)品（張宗山等，2007），又是國(guó)家衛(wèi)生部公布的藥食同源品種。枸杞蚜（Aphis sp.）是枸杞的重要害蟲之一，成蟲、若蟲刺吸危害枸杞嫩葉、花蕾、幼果、生長(zhǎng)點(diǎn)，在我國(guó)枸杞栽培區(qū)發(fā)生面積大、危害重，造成枸杞大量減產(chǎn)。且化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期大量的使用，使農(nóng)藥殘留日漸加重，嚴(yán)重破壞了枸杞的品質(zhì)，直接危害人體健康，加大了寧夏枸杞進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)的難度。因此，目前對(duì)高效、低毒、低殘留、對(duì)環(huán)境污染小的生物制劑的需求非常迫切，從植物中發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥活性物質(zhì)，開發(fā)新型無公害農(nóng)藥是新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要途徑。植物精油對(duì)昆蟲具有熏蒸、觸殺、驅(qū)避、抑制生長(zhǎng)發(fā)育的作用。Enan研究表明，精油主要作用于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，AChE和Na+-K+-ATPase均與昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。關(guān)于香茅油的趨避、抑菌、殺蟲作用已有報(bào)道，故探討香茅油對(duì)枸杞蚜蟲的毒力及對(duì)AChE及Na+-K+-ATPase的影響，為深入研究香茅油的殺蟲機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx

枸杞蚜蟲（Aphis sp.）采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)栽培的未經(jīng)任何農(nóng)藥處理的枸杞植株上。

1.2 試劑

香茅油（單方精油），ATPase測(cè)試盒（購(gòu)自南京建成生物工程研究所），丙酮、考馬斯亮藍(lán) G250、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸二鈉、蔗糖、氯化鈉。

1.3 生物測(cè)定

將香茅油用丙酮稀釋成經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)所得的不同濃度梯度，丙酮作為對(duì)照。用玻璃管藥膜法（魯艷輝等，2009）測(cè)定其對(duì)枸杞蚜蟲的觸殺作用。吸取300L藥液加入直徑1.5cm、高8cm的指形管內(nèi)，迅速轉(zhuǎn)動(dòng)，使藥液均勻涂布與指形管內(nèi)，待丙酮揮發(fā)后接入待測(cè)蚜蟲進(jìn)行毒力測(cè)定。每管接入大小一致的無翅成蚜30頭，室溫下4h、12h后開始觀察記錄死亡蟲數(shù)。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。死亡標(biāo)準(zhǔn)以毛筆撥動(dòng)蟲體，不動(dòng)者記為死亡。

1.4 酶液的制備及酶活性的測(cè)定

1.4.1 AChE酶液的制備及酶活性的測(cè)定

枸杞蚜蟲AChE酶液制備參見高希武的方法，將200頭未經(jīng)任何處理的健康蚜蟲置于玻璃勻漿器中，加入預(yù)冷的0.1mol/L pH值為7.6的磷酸緩沖液，冰預(yù)勻漿，勻漿液于12000rmp 4℃下離心15min，取上清液作為酶源，低溫保存待用。

取待測(cè)酶液0.1mL酶液與0.1mLASCh混合，30℃水浴保溫15min后，加入DTNB顯色劑顯色并終止反應(yīng)，于412nm下測(cè)定OD值。用丙酮將供試藥劑稀釋成所需濃度，向酶促反應(yīng)階段的反應(yīng)體系中加入酶液和藥劑，其他步驟同AChE酶活力測(cè)定。按下面的公式計(jì)算抑制率：

酶的抑制率（%）= ×100%

1.4.2 Na+-K+-ATPase酶液的制備及酶活性的測(cè)定

枸杞蚜蟲 Na+-K+-ATPase酶液制備參見Feng等的方法，并有改進(jìn)。將200頭未經(jīng)任何處理的健康蚜蟲置于玻璃勻漿器中，加2mLTris-HCl緩沖液，冰浴下勻漿。勻漿液于4℃，3000g下離心10 min，取上清液于10000g離心30 min，棄去上清液，沉淀用上述緩沖液溶解后作為酶源。按ATPase測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）說明測(cè)ATPase活性定。ATPase活力單位為μmolPi/mg prot/hour，試驗(yàn)重復(fù)3次。

用丙酮將供試藥劑稀釋成所需濃度，向酶促反應(yīng)階段的反應(yīng)體系中加入酶液和藥劑，測(cè)定藥劑對(duì)枸杞蚜 Na+-K+-ATPase活性的影響，計(jì)算抑制率。

ATPase活力=×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×6×7.8÷待測(cè)樣本蛋白濃度

注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度0.02μmol/ml； 6：定義上為每小時(shí)，實(shí)際操作10min反應(yīng)，所以必須乘以6；7.8：反應(yīng)體系中7.8倍稀釋。

1.5 酶液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照Bradford的考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定數(shù)據(jù)采用EXCEL和POLO軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)算致死中濃度（LC50）值以及抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 香茅油對(duì)枸杞蚜蟲的觸殺毒力

LC50值是用來衡量藥劑室內(nèi)毒力效果大小的指標(biāo)，LC50越小，表明毒力效果越好，處理4h、12h香茅油對(duì)枸杞蚜蟲的LC50分別為11.97（9.86～16.40）mL/L和3.35（2.53～4.04）mL/L（表1），說明香茅油對(duì)枸杞蚜蟲具有觸殺毒力。香茅油不同濃度對(duì)枸杞蚜蟲死亡率的影響見圖1，濃度與死亡率成正比例關(guān)系，即死亡率隨著濃度的增大而增大。濃度為10mL/L條件下，處理4h、12h的死亡率分別為48.45%和95.56%。

2.2 香茅油對(duì)AChE活性的影響endprint

在離體條件下，香茅油對(duì)枸杞蚜蟲AChE活力的影響見表2，可以看出，對(duì)照枸杞蚜蟲AChE活力最高，為1.44±0.01mmol/min·mgpro；香茅油濃度為10mL/L時(shí)，枸杞蚜蟲AChE活力最低。香茅油各濃度處理的枸杞蚜蟲AChE活力均與對(duì)照存在顯著差異（P<0.05）。精油濃度與抑制率呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，即隨著精油濃度的增加，對(duì)蚜蟲AChE抑制率增加。以對(duì)照的比活力值為1，香茅油濃度在2、4、6、8、10mL/L時(shí)，對(duì)應(yīng)的比活力比值分別為0.84、0.75、0.71、0.60、0.55。

2.3 香茅油對(duì)Na+-K+-ATPase活性的影響

香茅油濃度為2ml/L時(shí)，對(duì)枸杞蚜蟲Na+-K+-ATPase的抑制率為負(fù)值，說明香茅油濃度為2ml/L時(shí)對(duì)枸杞蚜蟲離體Na+-K+-ATPase活性表現(xiàn)為激活作用，香茅油濃度為4、6、8、10ml/L對(duì)枸杞蚜蟲Na+-K+-ATPase有抑制作用，且抑制作用隨著濃度的升高而增大。

3 結(jié)論與討論

香茅油對(duì)枸杞蚜蟲具有觸殺毒力，且死亡率隨著濃度的增大而增大，處理12h的死亡率達(dá)到95.56%。香茅油對(duì)枸杞蚜蟲AChE活性具有顯著抑制作用，且濃度與抑制率呈正相關(guān)。香茅油對(duì)枸杞蚜蟲Na+-K+-ATPase活性影響表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制。

萬樹青等研究發(fā)現(xiàn)11個(gè)多炔類化合物對(duì)美洲大蠊（Periplaneta americana）離體AChE活性抑制有抑制作用（萬樹青，2005），AChE 是有機(jī)磷殺蟲劑和氨基甲酸酯類殺蟲劑的靶標(biāo)。Na+-K+-ATPase對(duì)胞內(nèi)外的Na+、K+具有主動(dòng)運(yùn)輸?shù)墓δ?，是擬除蟲菊酯類殺蟲劑的靶標(biāo)位點(diǎn)之一，當(dāng)Na+-K+-ATPase活性被抑制，昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)功能出現(xiàn)紊亂，最終使昆蟲致死。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，香茅油對(duì)枸杞蚜蟲AChE和Na+-K+-ATPase均表現(xiàn)出了抑制作用，由此可以推斷，香茅油作為一種神經(jīng)毒劑作用于枸杞蚜蟲，影響昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)正常的信號(hào)傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。本實(shí)驗(yàn)為香茅油的殺蟲效果及機(jī)理，為香茅油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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作者簡(jiǎn)介： 陳新華（1989-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治。endprint