李元元，周文靖，靳婕華，王福生

慢性乙型肝炎新型治療藥物研究進展

李元元，周文靖，靳婕華，王福生

慢性乙型肝炎（慢乙肝）治療的理想目標是功能性治愈。目前藥物抗病毒治療可以抑制病毒復制，減輕或消除肝臟病理損害，有效阻止向肝硬化和肝癌的進展，但不能清除HBsAg和病毒庫，所以難以達到臨床治愈（或功能性治愈）。 因此，須要針對HBV生命周期以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)研發(fā)新型抗病毒藥物。近年來，HBV受體的發(fā)現(xiàn)以及HBV感染細胞體外培養(yǎng)模型的初步建立有利于研發(fā)潛在的抗病毒表面抗原或提高病毒特異性細胞免疫等宿主抗病毒藥物，包括抑制HBsAg合成和病毒庫的清除等。由此相信未來慢乙肝的功能性治愈可以通過聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)、抗病毒（HBV DNA、HBsAg）和共價閉合環(huán)狀DNA抑制劑等治療方案來現(xiàn)實。

HBV；慢性乙型肝炎；治療；免疫調(diào)節(jié)

目前全球有2.5億HBV攜帶者，該類人群容易發(fā)生肝硬化、肝衰竭、肝癌等疾病[1]。當前有效的抗HBV藥物包括免疫調(diào)節(jié)劑聚乙二醇化干擾素（pegylated interferon, Peg-IFN）和核苷類似物[nucleos(t)ide analogues, NAs][2]。這些藥物雖然可以抑制HBV復制，甚至使HBsAg轉陰，但很難徹底清除肝內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）[3]，這就導致已出現(xiàn)HBsAg轉陰的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者仍會有發(fā)生肝癌的風險[4-5]。所以現(xiàn)有治療方法很難治愈CHB，功能性治愈成為目前最可行的治療終點。隨著醫(yī)學水平的不斷提高，今后治愈CHB的方案可能是：NAs或免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合一種宿主或病毒靶向藥物以及cccDNA抑制劑，目前已有多個針對病毒和宿主的靶向治療藥物正在研發(fā)中。本文針對當前CHB臨床治療存在的問題以及國際上最新抗HBV治療臨床試驗的研究進展進行綜述。

1 CHB功能性治愈的定義

CHB治愈的定義尚不統(tǒng)一。目前在多個國際指南中關于CHB治愈的定義為HBeAg陽性的患者出現(xiàn)HBeAg/HBsAg轉陰或血清學轉換（HBeAb/HBsAb出現(xiàn)），HBeAg陰性的患者出現(xiàn)HBsAg轉陰或血清學轉換[2,6-7]。然而，即使出現(xiàn)HBsAg轉陰的CHB患者仍有發(fā)生肝癌的風險[4-5]，研究表明這可能與肝內(nèi)cccDNA持續(xù)存在有關[8]。因此，CHB患者出現(xiàn)HBsAg轉陰或血清學轉換并不是令人滿意的治療終點，CHB患者的徹底治愈應該是cccDNA的清除[9]，當然達到這一點非常困難，主要是因為目前缺少測定cccDNA的生物標志物以及直接作用于cccDNA的藥物。基于上述情況，專家提出了CHB患者功能性治愈的概念[9]，即在降低cccDNA水平的基礎上，使cccDNA轉錄失活，在無HBV復制的同時使肝臟疾病的進展得到緩解。目前認為這是評估抗HBV療效最可行的治療終點。

2 CHB臨床治愈的難點和HBV復制周期的特點

抗HBV治療主要有以下幾個難點。首先，cccDNA隱藏在感染肝細胞核的微染色體中，目前的治療方法很難直接進入細胞核中清除cccDNA。其次，HBV主要感染肝細胞并復制DNA，研究表明外源性的DNA進入人體后會強烈刺激天然免疫反應產(chǎn)生IFN-Ⅰ，有利于清除病毒，但是肝細胞先天缺乏這種免疫反應，從而導致病毒不易清除[10]。再次，HBsAg組成中有大量非感染性亞病毒顆粒，容易導致宿主對HBV的耐受。最后，HBV有10種基因型，感染后不同基因型的臨床病程和治療反應都不相同[11]，所以臨床有效治療不僅須要涵蓋最普遍的HBV基因型，也要包括其他少見的HBV基因型。

HBV是雙鏈環(huán)狀DNA病毒，屬于嗜肝病毒。病毒為小的球形結構，包括核衣殼、核心蛋白以及構成外部脂質(zhì)包膜的病毒表面蛋白（例如HBsAg）。HBV復制的開始是病毒與細胞相關的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖連接[12]，之后病毒與肝細胞特異性膽汁酸轉運蛋白牛磺膽酸共轉運多肽（Na+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP）不可逆結合[13]。結合后，HBV包膜通過與細胞膜的融合內(nèi)吞作用進入細胞，脫殼后形成部分雙鏈DNA（partial double-stranded DNA, partial dsDNA）。進入細胞核后形成具有共價連接聚合酶的松弛環(huán)狀DNA（relaxed circular DNA, rcDNA），之后通過細胞酶轉化為高度穩(wěn)定的cccDNA[14]。cccDNA是一個編碼3種表面蛋白、HBV X蛋白和前基因組RNA病毒的mRNA轉錄模板，通過翻譯產(chǎn)生核心蛋白和聚合酶蛋白，并且用作新生病毒基因組反轉錄的RNA模板[15]。細胞核中cccDNA轉錄的病毒RNA釋放到細胞質(zhì)中并翻譯成病毒蛋白。病毒轉錄產(chǎn)物之一的前基因組RNA（pregenomic RNA, pgRNA）會形成新的病毒衣殼。大、中、小3種HBV包膜蛋白包裹成熟核衣殼和反轉錄的rcDNA作為病毒粒子分泌出細胞，也可轉運回細胞核以維持cccDNA庫。這就是HBV復制周期（見圖1）。

圖1 HBV復制周期和關鍵的治療位點Figure 1 HBV replication cycle and key treatment site

3 治療CHB的新藥

目前新的抗HBV治療主要包括針對減少HBV生成的靶向藥物以及激活抗HBV的免疫治療。以下就從這兩方面進行介紹。

3.1 針對HBV靶向藥物 根據(jù)HBV復制的特點，針對HBV靶向藥物主要分為3類：抑制HBV進入肝細胞，降解消除cccDNA或抑制HBV產(chǎn)生，抑制HBsAg釋放。

3.1.1 抑制HBV進入肝細胞 目前認為NTCP是HBV特異性受體，可以使HBV進入肝細胞[16]。一種合成肽Myrcludex B可以與preS1結合從而競爭性抑制NTCP，阻止HBV進入。通過體內(nèi)、外人感染肝細胞的實驗已證實Myrcludex B可以有效的防止病毒進入[17-18]。一項評估Myrcludex B的安全性和耐受性的Ⅱa期臨床試驗中，以該藥治療40例HBeAg陰性的CHB非肝硬化患者（HBV DNA＞ 2000 IU/ml），1次/d，劑量波動在0.5～10.0 mg之間，結果表明在10 mg劑量組的患者中，8例患者有6例（75%）在治療12周時 HBV DNA數(shù)值降低＞ 1 log10 IU/ml，但是更低劑量組的40例患者中只有7例（17%）出現(xiàn)上述情況[19]。由此提示該藥對抑制HBV進入肝細胞有一定的療效。但是在長期使用Myrcludex B治療的過程中，會出現(xiàn)影響膽汁鹽平衡和一些藥物的代謝導致高膽紅素血癥發(fā)生的問題[20]。當然，Myrcludex B對既往已感染的肝細胞無明顯作用，但是可以防止新的肝細胞被感染，所以該藥可能對于CHB肝移植患者療效更好，因為它能預防肝移植后再次感染HBV。

3.1.2 降解消除cccDNA或抑制HBV產(chǎn)生 cccDNA的存在導致CHB患者很難被徹底治愈。目前認為使用NAs的CHB患者在停止治療后出現(xiàn)HBV再激活的原因也與此有關[21]，所以治愈CHB的關鍵在于直接破壞cccDNA或抑制rcDNA轉化為cccDNA。目前該類藥物（鋅指核酶和非取代的磺酰胺化合物、酪氨酰-DNA-磷酸二酯酶等）還處在早期研發(fā)階段，僅在細胞培養(yǎng)以及原代鴨肝細胞中進行了研究[22-23]。同時，另一個有希望的藥物是激活載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like,APOBEC）蛋白，它能與HBV相互作用并移位至細胞核，隨后脫氨基降解cccDNA。前期研究結果表明，活化淋巴毒素-β受體（lymphotoxin-β receptor, LTβR）可以上調(diào)APOBEC3B，體內(nèi)、外實驗均證實激活LTβR可以使HBV DNA數(shù)值和cccDNA數(shù)量降低，而且在停止治療后仍具有抑制病毒的作用，同時無明顯肝毒性。但是，LTβR激動劑的具體作用仍然需要長期的臨床數(shù)據(jù)去證實，須要注意的是使用該藥持續(xù)治療超過1年可能導致肝癌發(fā)生[24]。靶向cccDNA治療的另一種方法是運用基因組編輯技術CRISPR/Cas9，CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。該方法是使用具有特異性序列的靶向RNA引導Cas9核酸酶在DNA保守區(qū)切割DNA。一些研究已表明，在受HBV感染的細胞和轉基因小鼠中使用CRISPR系統(tǒng)靶向作用于cccDNA的保守區(qū)域，可以有效抑制并清除cccDNA[25]。

目前影響并抑制HBV復制合成的新技術包括RNA干擾（interfering RNAs, RNAi）、基因沉默以及抑制病毒組裝。①RNAi是結合宿主或病毒的mRNA使其失活，從而阻止蛋白質(zhì)翻譯。目前RNAi技術已經(jīng)發(fā)展到能將小的RNA導入細胞中。對小鼠和黑猩猩模型的研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定的RNAi靶向HBV mRNA中間體可以減少上述模型中HBsAg和HBeAg病毒蛋白的表達[26]。一項Ⅱa期的臨床試驗中，18例接受恩替卡韋治療的HBeAg陰性的亞洲CHB患者，同時給予單次靜脈注射不同劑量穩(wěn)定的RNAi混合物ARC-520（1 mg、2 mg或3 mg），結果表明在2 mg/kg組中HBsAg定量較基線水平平均下降22%，在隨訪85 d內(nèi)未見與治療相關的不良反應[27]。但其確切療效仍須要進一步地研究。②基因沉默可以通過引入與RNA靶標互補的短的反義核苷酸實現(xiàn)。Billioud等[28]研究發(fā)現(xiàn)在HBV感染小鼠和細胞模型中，通過上述方法治療4周后HBsAg定量下降≥2個log值。然而，該方法與恩替卡韋聯(lián)合治療的效果并不優(yōu)于單獨使用恩替卡韋治療。③組裝抑制劑是通過阻斷RNA組裝產(chǎn)生沒有遺傳信息的空衣殼進而影響HBV生成[29]。多項臨床前研究發(fā)現(xiàn)雜合二氫嘧啶（Bay 41-4109和GLS4）和苯丙醇酰胺（AT-61和AT-130）系列化合物通過誤導組裝導致核衣殼不穩(wěn)定，產(chǎn)生無功能的病毒顆粒進行反轉錄，從而抑制HBV復制[30-31]。另一種是直接作用于HBV核心蛋白和衣殼蛋白的抑制劑NVR 3-778。一項Ⅱ期臨床試驗中采用該抑制劑治療40例白人男性，結果證實該藥物無明顯不良反應[32]。但是關于該藥的抗病毒療效目前正在進行臨床試驗。

3.1.3 抑制HBsAg釋放 HBsAg可以抑制細胞因子的產(chǎn)生并誘導T細胞耐受及耗竭[33]，因此，控制HBsAg分泌有利于恢復HBV特異性T細胞免疫功能。目前，該類藥物（三唑并嘧啶抑制劑組藥物）的作用機制仍在研究中[34]。HBsAg可能對T細胞具有直接的免疫調(diào)節(jié)作用，但HBV可以通過HBsAg亞病毒顆粒來影響宿主免疫系統(tǒng)并介導免疫耐受[35]。關于抑制受感染的肝細胞釋放亞病毒顆粒藥物EP 2139-Ca的臨床研究表明，12例HBeAg陽性的無肝硬化患者使用該藥后再予以Peg-IFN或胸腺肽α，患者HBV DNA數(shù)值和HBsAg定量下降，有4例患者出現(xiàn)HBsAg轉陰[36]。并且目前有許多基于此結果的研究計劃正在準備中。

3.2 激活對HBV的抗病毒免疫調(diào)節(jié)藥物 除了針對HBV的靶向治療，提高宿主免疫功能也有利于清除HBV，包括通過治療性疫苗產(chǎn)生新的T細胞；刺激抗病毒效應細胞（T、B細胞和樹突狀細胞）以及恢復慢性HBV感染后功能衰竭的T細胞等。

3.2.1 治療性疫苗 既往治療性疫苗主要是合并前S1、S2和T細胞肽疫苗，盡管在動物實驗中發(fā)現(xiàn)該疫苗可以減少HBV復制，但是在臨床試驗中卻無明顯抗病毒療效[37]。HBV治療性疫苗面臨的主要挑戰(zhàn)是克服免疫耗竭，因此新疫苗的策略是針對不同HBV蛋白或腺病毒疫苗載體進行研究[38-39]。GS-4774（tarmogen）是一種重組熱滅活全酵母疫苗，表達包括HBV X，HBV S和HBcAg，可以誘導CD4+和CD8+T細胞應答。在單中心安全性試驗中發(fā)現(xiàn)，試驗期間受試者對GS-4774耐受性良好，無不良事件。在治療結束后85 d內(nèi)檢測發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者至少有1項結果體現(xiàn)出對T細胞有反應[40]。一項關于評估GS-4774單用或聯(lián)合替諾福韋治療CHB患者的Ⅱ期臨床試驗（NCT019433799）正在進行中[41]。

同時，古巴研制出第一種包括HBsAg和HBcAg組合的鼻腔疫苗用于抗HBV治療，其機理是通過激活B細胞并協(xié)同誘導T細胞的激活，使其能夠作用抗原呈遞細胞，進一步抑制HBV。19例健康男性的Ⅰ期雙盲、安慰劑對照隨機臨床試驗證實了其良好的安全性和耐受性[42]。2013年在EASL會議中760號摘要報道了nasvac疫苗的Ⅲ期臨床試驗，初步證實了其抗病毒的有效性，但后續(xù)研究仍在進行中。

3.2.2 刺激抗病毒效應細胞 Toll樣受體（Tolllike receptor, TLR）是重要的病原體識別受體，其在暴露于特定配體時會刺激天然和適應性免疫應答。 HBV可能會下調(diào)TLR逃避天然性免疫應答，所以TLR激動劑可以誘導產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素以及其他天然免疫反應，從而抑制HBV復制[43]。目前的數(shù)據(jù)表明最有希望的藥物是口服TLR-7激動劑，在TLR-7激動劑GS 9620誘導黑猩猩長期成功抑制HBV DNA并刺激IFN-α產(chǎn)生后，GS 9620被用于75例健康者，口服單次劑量為3 mg～12 mg[44]。由于該藥激活發(fā)生在胃腸道中，因此能夠通過門靜脈循環(huán)快速被肝臟吸收，研究表明藥物在人體中吸收及耐受性均良好。該藥物的主要不良反應與其他外源性IFN相似，主要是流感樣癥狀，有研究發(fā)現(xiàn)僅在接受8 mg或12 mg劑量的患者中才可見上述不良反應，進一步研究仍在進行中。

3.2.3 恢復HBV特異性細胞免疫功能 HBV持續(xù)復制主要是因為T細胞功能下調(diào)，出現(xiàn)功能障礙甚至耗竭的情況。程序性死亡分子-1（programmed death-1, PD-1）和其配體PD-L1/2均在T細胞上表達，并在T細胞調(diào)節(jié)中起作用[45]。在體內(nèi)或體外的研究中發(fā)現(xiàn)，PD-1和PD-L1/2拮抗劑無論是被單獨使用還是與NAs或疫苗聯(lián)合治療均會增強HBV特異性T細胞的反應。在一項土撥鼠模型的研究中也證實了上述結論，通過增強特異性T細胞的反應，抑制病毒復制同時清除cccDNA[46]。盡管PD-1拮抗劑還沒有應用于CHB患者的臨床試驗，但是在腫瘤患者中已初步顯示出良好的治療效果。須要注意的是，在腫瘤患者臨床試驗中該藥不良反應率偏高，9%的患者出現(xiàn)3級或4級不良反應[47]。因此，PD-1拮抗劑的不良反應會影響該藥用于病情平穩(wěn)的CHB患者。當然，第二代PD-1抑制劑可能會有更多的選擇性及治療的希望。

4 結 論

在過去20年中，隨著乙型肝炎疫苗接種的廣泛推廣以及抗HBV治療方法的不斷進步，HBV的預防和治療都取得了長足的改進。但是對于CHB患者而言，目前治療的不足是抗病毒藥物不能達到徹底治愈，同時還受到藥物不良反應的限制。雖然我們?nèi)圆荒軓氐坠タ薍BV，但隨著針對HBV復制周期和提高宿主免疫治療新藥的不斷涌現(xiàn)，最終將能徹底治愈CHB患者。

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（2017-08-03收稿 2017-08-15修回）

（本文編輯 胡 玫）

Advance on novel therapeutic agents for chronic hepatitis B

LI Yuan-yuan*, ZHOU Wen-jing, JIN Jie-hua, WANG Fu-sheng
Treatment and Research Center for Infectious Diseases, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

The ideal goal for chronic hepatitis B is functional cure. The current antiviral treatment can efficiently control viral replication, reduce or eliminate liver pathological lesion, effectively prevent the progression into liver cirrhosis and liver cancer, but it cannot clear HBsAg and viral reservoir (cccDNA). So it is still quite far from achieving a functional cure. Therefore, novel antiviral agents are needed to target various processes of hepatitis B virus lifecycle and regulate immune system. The emergency of HBV receptor and the establishment of in vitro HBV-infected cell-culture model will promote the development of potential antiviral surface antigen or incrrease virus-specific cellular immunity and other host antiviral drugs, such as inhibiting HBsAg synthesis and clearing viral reservoir. It is likely that successful HBV functional cure may be ultimately realized with the combinational use of HBV-specific immunomodulatory drugs, antiviral (HBsAg and HBV DNA) agents and cccDNA inhibitors.

HBV; chronic hepatitis B; therapy; immunomodulatory

R512.6

A

1007-8134(2017)04-0197-06

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.04.004

首都臨床特色應用研究（Z151100004015014）

100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心（李元元、周文靖、靳婕華、王福生）

李元元，E-mail： lyy020818@sina.com

*Corresponding author, E-mail： lyy020818@sina.com