劉慶忠

(山東省果樹(shù)研究所，山東泰安 271000)

甜櫻桃斑果病研究進(jìn)展及其防治

劉慶忠

(山東省果樹(shù)研究所，山東泰安 271000)

類病毒是一類單鏈、閉合環(huán)狀低分子量的致病性RNA，大小為246～463bp，無(wú)蛋白質(zhì)外殼包裹，是目前發(fā)現(xiàn)的最小病原物。類病毒侵染性強(qiáng)，可導(dǎo)致被侵染的細(xì)胞或組織發(fā)生異常，侵染后造成類似病毒感染的矮化、斑駁、葉變形、裂皮、斑果和壞死等癥狀。從類病毒的危害癥狀、檢測(cè)及鑒定、致病機(jī)理、傳播及防治等方面介紹了引起甜櫻桃斑果病的啤酒花矮化類病毒。

啤酒花矮化類病毒；甜櫻桃；斑果??；鑒定；癥狀；防治

隨著甜櫻桃新品種、新砧木和高效栽培技術(shù)在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，甜櫻桃種植在中國(guó)取得了快速發(fā)展。2016年中國(guó)甜櫻桃栽培面積達(dá)18萬(wàn)hm2，產(chǎn)量70萬(wàn)t，種植面積在近幾年翻了兩翻。在生產(chǎn)快速發(fā)展的同時(shí)，新的病害不斷出現(xiàn)，如葉片退綠黃化、花而不實(shí)、果實(shí)畸形、皺縮、果實(shí)出現(xiàn)斑點(diǎn)、果實(shí)變小、叢枝、枯枝死樹(shù)等，嚴(yán)重影響了甜櫻桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。

1971年美國(guó)科學(xué)家Diener在研究馬鈴薯紡錘塊莖病的過(guò)程中，提出了“類病毒”的概念[1]。類病毒(Viroid)是一類單鏈、閉合環(huán)狀低分子量的致病性RNA，大小為246～463bp，無(wú)蛋白質(zhì)外殼包裹，是目前發(fā)現(xiàn)的最小病原物。類病毒侵染性強(qiáng)，通?？蓪?dǎo)致被侵染的細(xì)胞或組織發(fā)生異常。侵染后造成類似病毒感染的矮化、斑駁、葉變形、裂皮、斑果和壞死等癥狀。筆者主要介紹由啤酒花矮化類病毒(Hop stunt viroid，HSVd)引起的甜櫻桃斑果病(Dapple fruit)。

1 HSVd在櫻桃上的危害癥狀

2008年土耳其研究者首次報(bào)道了啤酒花矮化類病毒侵染甜櫻桃和酸櫻桃，研究者在26個(gè)果園收集了127株樹(shù)上的樣品，采集樣品均無(wú)癥狀表現(xiàn)，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)甜櫻桃HSVd感病率為13.5%，酸櫻桃感病率為45.5%[2]。中國(guó)于2017年首次報(bào)道了啤酒花類病毒能引起“紅燈”甜櫻桃果實(shí)出現(xiàn)深紅色斑點(diǎn)，即“Dapple fruit”的癥狀[3]。進(jìn)一步田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在山東、遼寧、山西、甘肅、北京、陜西等甜櫻桃產(chǎn)區(qū)普遍存在。甜櫻桃品種紅燈、早大果、紅蜜、雷尼、美早、薩米特、桑提娜、先鋒、芝罘紅和布魯克斯等均有發(fā)生。發(fā)病嚴(yán)重的樹(shù)體不僅出現(xiàn)斑果，而且果實(shí)變小、皺縮，成熟期變晚，失去商品價(jià)值。有的還表現(xiàn)出枯枝、樹(shù)勢(shì)衰退甚至整枝死亡等癥狀。嫁接樹(shù)結(jié)果后2～3年，即表現(xiàn)典型的斑果癥狀(圖1)。目前，中國(guó)櫻桃還未見(jiàn)染病現(xiàn)象。

2 甜櫻桃HSVd的檢測(cè)及其鑒定

類病毒分為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科(Pospiviroidae)和鱷梨日斑類病毒科(Avsunviroidae)2個(gè)科。至今發(fā)現(xiàn)的30多種類病毒，其中大部分屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科，其科下分為5個(gè)屬28個(gè)種，引起甜櫻桃斑果病的HSVd是該科啤酒花矮化類病毒屬(Hostuviroid)的唯一成員，無(wú)蛋白質(zhì)外殼包裹，又無(wú)編碼蛋白的功能，不能采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)等血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。目前，常用的檢測(cè)方法主要有生物學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)兩種。

圖1 甜櫻桃斑果病田間癥狀

2.1 指示植物法

HSVd檢測(cè)采用四葉黃瓜(CucumissativusL. cv Suyo)作為指示植物。具體的做法是：將營(yíng)養(yǎng)土裝入塑料營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，用水均勻灌溉，無(wú)積水時(shí)將黃瓜種整齊的播種于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，置于溫室條件下生長(zhǎng)。待黃瓜長(zhǎng)至二葉期時(shí)，將待檢測(cè)的各樣品低分子RNA溶液與接種緩沖液(100mM Tris-base，10mM EDTA，pH7.5)以1∶100的比例混合后，用棉棒蘸取摩擦接種于黃瓜葉片上，以不接種的四葉黃瓜作為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品接種10株。待黃瓜長(zhǎng)出第四片真葉時(shí)，將每株分別移栽于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，溫室保持在28～32℃。觀察記錄黃瓜生長(zhǎng)情況。接種3～4周后接種植株發(fā)生植株明顯矮化，節(jié)間縮短，葉片翻卷等現(xiàn)象(圖2)，健康植株未出現(xiàn)任何癥狀。生物學(xué)鑒定能夠提供類病毒繁殖和致病的證據(jù)，是一種重要的檢測(cè)方法。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)是目前非常成熟、應(yīng)用廣泛，靈敏度較高的檢測(cè)方法，已成功用于檢測(cè)多種類病毒。HSVd檢測(cè)具體操作為：選取健康植株和具有斑果癥狀的甜櫻桃葉片作為試材，提取總RNA，利用引物R1 (5′-GCTGGATTCTGAGAAGAGTT-3′)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后用R2 (5′-AAACCCGGGGCTCCTTTCTCA-3′) 和 F1 (5′-AAACCCGGGGCAACTCTTCTC-3′) 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增[4]。對(duì)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明導(dǎo)致甜櫻桃(Prunusavium)斑果病的HSVd與李屬(Prunussalicina)HSVd親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖2 接種四葉黃瓜發(fā)病植株與健康植株

圖3 甜櫻桃HSVd序列與下載HSVd序列系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

2.3 高通量深測(cè)序技術(shù)(NGS)

高通量深測(cè)序技術(shù)具有非序列依賴性，能同時(shí)檢測(cè)植物樣品中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的、含量高及含量低的所有DNA病毒、RNA病毒以及類病毒。通過(guò)高通量測(cè)序可對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全面的分析，然后利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行基因組組裝，完成病毒或類病毒的全基因組測(cè)序。相對(duì)于其他的植物病毒類病毒檢測(cè)方法，NGS具有其優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在5個(gè)方面：①NGS能快速檢測(cè)病毒、類病毒，傳統(tǒng)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，而NGS一般一個(gè)測(cè)序反應(yīng)需要2～3天即可完成，后期的數(shù)據(jù)分析和病毒或類病毒的確認(rèn)一般也可在短時(shí)間內(nèi)完成，因此，NGS能夠快速診斷生產(chǎn)實(shí)踐上的疑難雜癥和一些爆發(fā)性病害的病原，可為病害防治提供依據(jù)。②NGS可廣譜的檢測(cè)病毒或類病毒的寄主，無(wú)論是DNA病毒、RNA病毒還是類病毒，都能在一個(gè)測(cè)序反應(yīng)中被檢測(cè)到，不受病毒基因組類型的限制。③NGS檢測(cè)病毒或類病毒靈敏度高。NGS測(cè)定的是在RNA沉默這個(gè)寄主防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程中抵抗病毒或類病毒侵染產(chǎn)生的高度冗余的小RNA或病毒的轉(zhuǎn)錄本，所以即使極低效價(jià)的病毒或類病毒也能被鑒定出來(lái)。④NGS能夠?qū)Χ鄠€(gè)不同來(lái)源的樣品同時(shí)進(jìn)行病毒或類病毒檢測(cè)。由于每個(gè)植物樣品的cDNA都帶有特異的標(biāo)簽，因此序列來(lái)源可以追溯到原始地理帶的不同植物間，能快速比較病毒的分布和變異進(jìn)化等特征。⑤NGS能夠通過(guò)非序列同源性的方式發(fā)現(xiàn)病毒或類病毒。傳統(tǒng)方法對(duì)于那些與已知的病毒或類病毒序列完全缺乏同源性的新序列在認(rèn)定上存在困難，目前已經(jīng)通過(guò)NGS測(cè)定siRNA和新的逐漸過(guò)濾重疊siRNA的數(shù)據(jù)分析方法，在葡萄等植物上發(fā)現(xiàn)了與已知的類病毒序列完全缺乏同源性的新類病毒。

3 HSVd的致病機(jī)理

HSVd是由294～303個(gè)核苷酸序列組成的RNA片段，二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖所示(圖4)。病毒侵入寄主敏感細(xì)胞后，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)到達(dá)相應(yīng)的細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)寄主DNA依賴的RNA聚合酶(DNA dependent RNA Polymerase)作用下復(fù)制，新合成的類病毒個(gè)體又反向細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)胞間連絲進(jìn)入相鄰的細(xì)胞，然后進(jìn)入韌皮部維管系統(tǒng)，長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)街仓甑母鱾€(gè)部位，侵入植株其他的健康細(xì)胞。類病毒本身的RNA序列，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)與寄主細(xì)胞內(nèi)的RNA分子互作，通過(guò)RNA沉默，激素調(diào)節(jié)，特定基因的表達(dá)，調(diào)控基因細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，干擾寄主正常的新陳代謝，導(dǎo)致植株表現(xiàn)出明顯的發(fā)育障礙，出現(xiàn)矮化、皺縮、花葉、病斑等癥狀。據(jù)報(bào)道，HSVd能夠影響植株體內(nèi)MYB，bHLH和WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[5]。

圖4 HSVd類病毒二級(jí)結(jié)構(gòu)圖(Ohno et al., 1983)

4 HSVd的傳播與防治

HSVd首次在日本啤酒花上分離得到，自然寄主范圍十分廣泛，包括啤酒花、黃瓜、石榴、柑桔、梨、蘋果、桃、李、扁桃、櫻桃、棗和無(wú)花果等草本和木本植物，世界各國(guó)均有發(fā)生。類病毒可以通過(guò)帶毒材料的無(wú)性繁殖、機(jī)械摩擦、帶毒的種子或者花粉以及昆蟲(chóng)介體等方式進(jìn)行傳播[6]。主要傳播途徑是采用帶毒植物材料的無(wú)性繁殖。一旦母體材料被感染，通過(guò)快速擴(kuò)繁，短時(shí)間內(nèi)類病毒就能大規(guī)模擴(kuò)散。20世紀(jì)六、七十年代，啤酒花矮化病害在日本突然大規(guī)模流行，給日本的啤酒花生產(chǎn)和啤酒釀造業(yè)造成了嚴(yán)重的沖擊[7]。田間農(nóng)事操作過(guò)程中，類病毒能夠通過(guò)被污染的操作工具進(jìn)行傳播。尤其是對(duì)果樹(shù)來(lái)說(shuō)，嫁接和修剪也是類病毒傳播的重要途徑之一。類病毒還能夠通過(guò)被感染的種子或者花粉進(jìn)行傳播[8]。此外，類病毒還可以通過(guò)昆蟲(chóng)及相鄰植株間的汁液進(jìn)行傳播。如野生寄主中的類病毒可經(jīng)蚜蟲(chóng)、桃蚜傳播到實(shí)驗(yàn)寄主中。然而大量實(shí)驗(yàn)證明，昆蟲(chóng)雖可作為類病毒傳播的介體，但其傳播效率較低且持久性比較弱。

HSVd在杏、棗、梨和蘋果等植物中呈潛伏侵染，在某些寄主上可造成嚴(yán)重的病害，如啤酒花矮化病、柑桔矮化裂皺病、李和桃斑果病等。HSVd侵染寄主植物后是否有癥狀表現(xiàn)與地區(qū)、品種有關(guān)，如HSVd在土耳其侵染甜櫻桃，感染率達(dá)13.8%，但未見(jiàn)有癥狀報(bào)道。而在中國(guó)HSVd侵染甜櫻桃引起嚴(yán)重斑果病、縮果病、小果病、枝枯病、植株流膠、整株死亡等現(xiàn)象，個(gè)別果園100%植株感染發(fā)病，危害十分嚴(yán)重。應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)綜合防治。首先應(yīng)制定法律法規(guī)，建立嚴(yán)格的檢疫制度，防止病害擴(kuò)散。其次，生產(chǎn)上要使用無(wú)毒苗木。第三，建立健全果園巡視制度，及時(shí)淘汰果園病株。第四，甜櫻桃生產(chǎn)園、苗圃必須與生產(chǎn)櫻花及其他核果類、棗、葡萄、柑桔類和仁果類等果樹(shù)的果園隔離。第五，及時(shí)清除果園雜草，防止交叉感染。第六，加強(qiáng)熱處理、組織培養(yǎng)、超低溫冷凍脫毒技術(shù)研究、培育無(wú)病毒苗，加強(qiáng)弱株系交叉防護(hù)、開(kāi)展轉(zhuǎn)基因抗類病毒病研究、培育抗病品種。

值得注意的是，類病毒相對(duì)于病毒病來(lái)說(shuō)，雖然類病毒的寄主范圍相對(duì)較窄，但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)類病毒的寄主范圍有逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)[9]。如長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)只侵染馬鈴薯和番茄，但有報(bào)道表明鱷梨也是其自然寄主；開(kāi)始HSVd只在啤酒花中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究表明其還能侵染黃瓜、蘋果、桃、李、棗、無(wú)花果和梨等草本和木本植物。此外，有研究表明與馬鈴薯和啤酒花生長(zhǎng)在同一農(nóng)田的野草，雖不是PSTVd和HSVd的自然寄主，接種類病毒cDNA后，卻能夠支持類病毒在其體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。因此，如果條件合適，類病毒可能會(huì)侵染一些新的植物，所以應(yīng)該嚴(yán)格防控類病毒傳播。

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2017-02-13

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAD02B03-3-2)； 山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系果品創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(SDAIT-06-04)。

劉慶忠(1963-)，男，山東莒南人， 研究員，主要從事果樹(shù)種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種工作。E-mail: qzliu001@126.com

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1002-2910(2017)05-0001-04