王小林，孔祥珍，華欲飛，張彩猛，陳業(yè)明

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122)

大豆分離蛋白肽鈣螯合物的制備及表征

王小林，孔祥珍，華欲飛，張彩猛，陳業(yè)明

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122)

研究了酶解時間和酸法脫酰胺改性對脫植酸大豆分離蛋白肽鈣離子螯合能力的影響，并對螯合物的結(jié)構(gòu)特性及營養(yǎng)特性進(jìn)行表征。結(jié)果表明：酶解240 min的肽有較好的鈣結(jié)合量(57.85 mg/g)，螯合物得率為28.43%，脫酰胺后鈣結(jié)合量和螯合物得率分別增加到75.37 mg/g、34.55%；氨基酸分析結(jié)果表明酸性氨基酸是參與螯合物形成的重要氨基酸；相對分子質(zhì)量分布實驗結(jié)果說明鈣離子更傾向于結(jié)合相對分子質(zhì)量大于等于1 000的肽段，螯合物得率高，但相對分子質(zhì)量小于等于500的肽段是獲得更高鈣結(jié)合量螯合物的重要肽源；紅外光譜分析表明鈣結(jié)合后引起肽段結(jié)構(gòu)的變化，肽鏈羧基中的O及氨基中的N是主要配位原子；體外消化吸收模擬實驗制備的肽鈣螯合物有較好的胃胰酶耐受性，經(jīng)消化后肽段相對分子質(zhì)量幾乎沒有變化，鈣保留率穩(wěn)定在87%左右，生物利用率達(dá)81.81%。

肽鈣螯合物；酶解；酸法脫酰胺；表征

鈣是人體骨骼生長和生理調(diào)節(jié)的一種必需微量礦物元素，對神經(jīng)調(diào)節(jié)、肌肉收縮、有絲分裂、血液凝固等發(fā)揮著重要的作用[1]。鈣補充劑產(chǎn)品的發(fā)展經(jīng)過了3次的革新，第一代產(chǎn)品是無機鈣鹽，但膳食中的植酸鹽、草酸、纖維素、藻酸鈉、糖醛酸、酪蛋白會降低人體對無機鈣鹽的吸收利用度，且溶解性差[2]；第二代產(chǎn)品主要是有機酸鈣鹽，有較好的溶解性，但存在含鈣量低，易溶失以及價格高等缺點[3]；第三代產(chǎn)品即有機鈣，主要包括氨基酸螯合鈣與多肽螯合鈣，研究表明多肽螯合鈣獨特的螯合體制及轉(zhuǎn)運體制使其較氨基酸螯合鈣能夠更易且更快地被吸收[4]。

大豆分離蛋白在必需氨基酸組成上與動物蛋白不分伯仲，是一種全價蛋白質(zhì)，對心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、更年期綜合癥有很好的預(yù)防及改善作用[5]。大豆分離蛋白經(jīng)過酶解作用會釋放大量的活性肽，且氨基酸及其營養(yǎng)價值幾乎完全保留，所以具有更優(yōu)的功能特性[6]。

國內(nèi)外對大豆分離蛋白肽鈣螯合物的研究雖有報道，但主要集中在低水解度的酶解物，即較高的相對分子質(zhì)量肽上。本文通過堿性蛋白酶(Alcalase)酶解獲得水解度較高的脫植酸大豆分離蛋白肽，乙醇沉淀法制備鈣螯合物，并對螯合物的組成結(jié)構(gòu)全面分析。此外，本研究提供的磷酸鹽緩沖液(PBS)預(yù)處理方案為以后的螯合物研究領(lǐng)域提供了更為可靠的方法基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

低溫脫脂豆粕：山東禹王集團；植酸鈉：羅定市寶日植酸鈉有限公司；植酸酶(45 000 U/g)：山東濰坊蘇柯漢生物技術(shù)有限公司；膽酸鹽：Sigma-Aldrich；堿性蛋白酶(Alcalase)：諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。

氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈣、乙醇、硝酸、溴化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，分析純；三羥甲基氨甲烷(Tris)、胰蛋白酶、胃蛋白酶，生物試劑。

1.1.2 儀器與設(shè)備

K9840自動凱氏定氮儀；磁力攪拌器；Himac CR21GⅡ型冷凍離心機：日本Hitachi公司；LGJ-18型冷凍干燥機；UV-1500型紫外可見分光光度計；HH-601超級恒溫水浴箱；SHA-2A冷凍水浴恒溫振蕩器；TDZ5-WS臺式低速離心機；烘箱；AR224CN電子天平；箱式電阻爐；AA-240原子吸收分光光度計：美國瓦里安公司；D-2000 Elite高效液相色譜儀：日本Hitachi公司；DELTA320 pH計：Mettler-Toledo儀器有限公司；Nicolet Nexus 470傅里葉紅外光譜儀：美國Nicolet公司；835-50型氨基酸自動分析儀：日本Hitachi公司；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫植酸大豆分離蛋白的提取

豆粕與水按料液比1∶10混合，調(diào)節(jié)溶液pH 7.0于25℃下攪拌1 h。經(jīng)紗布過濾后離心(7 500 r/min，4℃，30 min)。取上清液于燒杯中，以40 U/g(以豆粕的質(zhì)量計)加入植酸酶酶解(pH 5.0，25℃)1 h。酶解完成后，迅速調(diào)節(jié)pH 4.5，酸沉1 h，離心后棄上清，水洗沉淀并于pH 7.0復(fù)溶，離心，取上清液凍干，即得到大豆分離蛋白。

植酸含量的測定參考Wang等[7]的方法。脫植酸后，大豆分離蛋白中植酸含量由20.02 mg/g下降到3.13 mg/g。

1.2.2 大豆分離蛋白肽的制備

蛋白質(zhì)含量5%，酶添加量2%，用堿性蛋白酶Alcalase進(jìn)行酶解(pH 9.0、60℃)，通過沸水浴10 min滅酶，離心后取上清液凍干，得到大豆分離蛋白肽。

1.2.3 水解度及蛋白質(zhì)回收率的測定

通過pH-stat法[8]測定水解度。

通過凱氏定氮法測定大豆分離蛋白中的蛋白質(zhì)含量A1及不同酶解時間得到的大豆分離蛋白肽中的蛋白質(zhì)含量A2，并分別記錄酶解所用的大豆分離蛋白的質(zhì)量M1以及得到的大豆分離蛋白肽的質(zhì)量M2。蛋白質(zhì)回收率的計算公式如下：

1.2.4 酸法脫酰胺改性[9-10]

以0.3mol/L鹽酸為溶劑，大豆分離蛋白肽含量為5%，65℃反應(yīng)5h，反應(yīng)過程中密封以防水分蒸發(fā)。

1.2.5 肽鈣螯合物的制備

稱量0.5g大豆分離蛋白肽，加入25mL20mmol/LTris-鹽酸(pH7.8)緩沖液，按照大豆分離蛋白肽中每克蛋白質(zhì)加入1.25mmol的鈣的比例，加入0.25mol/L氯化鈣溶液，混勻。在冷凍水浴恒溫振蕩器中40℃下反應(yīng)1h。離心(4 000r/min，10min)，按上清液和無水乙醇的體積比1∶6加入無水乙醇，靜置，離心，沉淀即螯合物，于50℃烘干。根據(jù)GB/T5009.92—2003，通過干法消解以及原子吸收分光光度法測定肽的鈣結(jié)合量。螯合物得率及鈣螯合率按下式計算：

螯合物得率=螯合物質(zhì)量/(加入的大豆分離蛋白肽質(zhì)量×蛋白質(zhì)含量+加入的鈣質(zhì)量)×100%

1.2.6 氨基酸組成測定

采用OPA FMOC柱前衍生，通過氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定。稱取約0.1 g大豆分離蛋白肽或肽鈣螯合物于水解管內(nèi)，加入8 mL、6 mol/L HCl溶液，混勻后放于110℃的烘箱內(nèi)消解22 h。取出冷卻，將消解液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，用10 mol/L氫氧化鈉溶液中和，并用水定容至刻度。采用雙層濾紙過濾，取1 mL濾液離心(10 000 r/min，10 min)，取上清液進(jìn)行測定。

保留比指螯合物中相應(yīng)的氨基酸含量與大豆分離蛋白肽原料中氨基酸含量的比值。

1.2.7 PBS脫鈣方法

通過PBS(0.2 mol/L，pH 8.0)對肽鈣螯合物進(jìn)行脫鈣，脫鈣率約達(dá)99%，N保留率可達(dá)100%。

1.2.8 相對分子質(zhì)量分布測定

采用凝膠滲透色譜法(GPC)分別測定了大豆分離蛋白肽及肽鈣螯合物經(jīng)PBS脫鈣后得到的螯合肽的相對分子質(zhì)量分布。

色譜條件：TSK-gel 2000 SWXL凝膠柱(7.8 mm×300 mm)經(jīng)流動相A(純水)及流動相B(乙腈、水、三氟乙酸的體積比為45∶55∶0.1)平衡，樣品質(zhì)量濃度5 mg/mL，檢測波長214 nm，柱溫30℃，流速0.5 mL/min。

1.2.9 傅里葉紅外光譜分析[11]

將含約1%樣品的KBr粉末于瑪瑙研缽中磨細(xì)，壓片，采用傅里葉紅外光譜儀對薄片掃描，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1。分別測定PBS脫鈣后得到的螯合肽以及肽鈣螯合物的紅外光譜。

1.2.10 體外消化吸收模擬實驗

參考Miller等[12]的方法并稍加調(diào)整。將0.5 g樣品溶于10 mL水中，調(diào)節(jié)溫度37℃，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 2.0，胃蛋白酶加入量為2%，消化到一定時間，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH 7.5，加入4%胰蛋白酶進(jìn)行消化；通過8 000 Da透析袋模擬小腸的吸收作用。鈣保留率及鈣生物利用率按下式計算：

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆分離蛋白水解度及蛋白質(zhì)回收率

分批制備了酶解時間分別控制在20、45、90、150、240、360 min的肽原料，并測定了其水解度及蛋白質(zhì)回收率，結(jié)果見表1。

表1 不同酶解時間下大豆分離蛋白水解度及蛋白質(zhì)回收率

由表1可知，隨著酶解時間的延長，水解度增大，可溶性蛋白質(zhì)含量增加，所以蛋白質(zhì)回收率也隨之增加。

2.2 大豆分離蛋白最適酶解時間的選擇

圖1A、B為不同酶解時間的鈣結(jié)合量及螯合物得率。圖1C為不同酶解時間的鈣螯合率，反映金屬離子的利用程度。

圖1 不同酶解時間的鈣結(jié)合量(A)、螯合物得率(B)及鈣螯合率(C)

由圖1A可知，鈣結(jié)合量隨著酶解時間的延長而增加，即隨著水解度的增大而增加。由圖1B可知，螯合物得率隨著酶解時間的延長整體呈下降趨勢。由圖1C可知，酶解20、240、360 min有相對較高的鈣螯合率。由于酶解20 min蛋白質(zhì)回收率僅71.23%，且鈣結(jié)合量最低；而酶解240 min以及360 min鈣結(jié)合量較高，兼顧時間效益，選取240 min為最佳酶解時間。

2.3 酸法脫酰胺改性對肽鈣螯合能力的影響

酸法脫酰胺是一種簡單有效的脫酰胺方法，通過提供H+打斷—NH2鍵，釋放氨氣，將Asn、Gln轉(zhuǎn)化為Asp、Glu。以上述獲得的酶解240 min的肽為原料，研究了酸法脫酰胺對其螯合物得率和鈣結(jié)合量的影響，結(jié)果見表2。

表2 脫酰胺改性對螯合能力的影響

通過微量彌撒皿法[13]測得脫酰胺率為64.33%。由表2可知，酶解240 min的肽脫酰胺后鈣結(jié)合量增加了30%，螯合物得率增加約22%，說明酸性氨基酸是影響螯合鈣含量的重要因素。包小蘭等[14]研究發(fā)現(xiàn)脫酰胺改性可以提高由Protease M制備大豆蛋白酶解物的可溶性鈣的結(jié)合量，并通過增加羧基基團提高肽的鈣結(jié)合量。所以選取酶解240 min脫酰胺肽為后續(xù)實驗的原料并對其制備的螯合物進(jìn)行表征。

2.4 大豆分離蛋白肽及肽鈣螯合物的氨基酸組成

有研究[15]表明，大豆蛋白肽的鈣結(jié)合量與螯合物中的酸性氨基酸含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.820 4，但其只測定了螯合物的氨基酸組成，有的研究[8]只對肽的氨基酸組成進(jìn)行測定。本實驗對螯合前后的肽段氨基酸組成進(jìn)行對比，結(jié)果見表3。

表3 大豆分離蛋白肽及肽鈣螯合物的氨基酸組成 %

由表3可知，肽鈣螯合物中Asp、Glu共占54.17%，比原料肽增加了56%，說明酸性氨基酸對螯合鈣的重要作用；此外，His、Gly、Arg、Cys、Lys、Pro殘基也是參與肽鈣螯合物形成的重要氨基酸殘基，其中Gly、Arg、Lys、Pro在肽鈣螯合物中占有較大比例以及螯合后的保留比較高，His、Cys雖然占比較少，但保留比卻很高，尤其Cys的保留比最高。說明富含上述氨基酸的肽段更易于螯合，一方面可能是由于側(cè)鏈基團R可以提供更多的配位原子，另一方面也可能是對肽段結(jié)構(gòu)的影響，使得配體暴露，促進(jìn)螯合。

2.5 大豆分離蛋白肽及螯合肽的相對分子質(zhì)量分布(見表4)

表4 大豆分離蛋白肽及螯合肽的相對分子質(zhì)量分布 %

由表4可知，螯合肽中，Mr大于等于1 000的肽段所占的比例增加了3倍左右，Mr小于等于500的肽段所占的比例減少了約一半，Mr 500～1 000的比例可認(rèn)為沒有變化。說明Mr大于等于1 000的肽段較Mr小于等于500的肽段更易參與螯合物的形成，結(jié)合酶解時間對肽鈣結(jié)合量的影響結(jié)果，可推測Mr小于等于500的肽是制備高鈣含量螯合物主要肽組分。Huang等[16]通過超濾的方法對蝦蛋白酶解物進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)最低相對分子質(zhì)量的肽組分(Mr≤500)顯示了最高的鈣結(jié)合能力。Liu等[8]將通過Alcalase 酶解獲得的小麥胚芽蛋白肽通過超濾分離后，發(fā)現(xiàn)Mr在3 000～5 000范圍的肽組分有最佳的鈣結(jié)合量，這些差異主要由于蛋白質(zhì)的來源不同。

2.6 螯合肽及肽鈣螯合物的紅外光譜(見圖2)

圖2 螯合肽及肽鈣螯合物的紅外光譜圖

2.7 體外消化吸收模擬實驗

相對于體內(nèi)消化評價及臨床評價，體外消化法方便、耗資少。肽鈣螯合物在胃胰酶消化后的相對分子質(zhì)量變化見圖3，胃胰酶消化不同時間點的鈣保留率見表5。

圖3 肽鈣螯合物在胃胰酶消化后的相對分子質(zhì)量變化

由圖3可知，在胃胰酶消化的不同時段，肽鈣螯合物中肽段的相對分子質(zhì)量變化甚微。由表5可知，鈣保留率也穩(wěn)定在87%左右；通過模擬小腸處的吸收測得鈣的生物利用率可達(dá)81.81%，說明了肽鈣螯合物有較好的耐胃胰酶穩(wěn)定性及吸收特性，主要原因可能是肽鈣螯合物中的肽段本身經(jīng)過堿性蛋白酶酶解后，相對分子質(zhì)量小，胃胰酶的酶切位點少。

表5 胃胰酶消化不同時間點的鈣保留率

3 結(jié) 論

研究了酶解時間和酸法脫酰胺改性對脫植酸大豆分離蛋白肽鈣離子螯合能力的影響，并對螯合物的結(jié)構(gòu)特性及營養(yǎng)特性進(jìn)行表征。脫酰胺改性提高了肽的鈣結(jié)合量和螯合物得率。水解度、肽段的氨基酸組成以及相對分子質(zhì)量都會對螯合作用產(chǎn)生影響。酸性氨基酸及相對分子質(zhì)量小于等于500的小分子肽對制備高鈣含量的肽鈣螯合物有重要作用。肽鈣螯合物有較好的消化吸收特性，且N、O原子是參與肽鈣螯合物形成的主要配位原子。

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Preparationandcharacterizationofsoybeanproteinisolatepeptide-calciumchelate

WANG Xiaolin，KONG Xiangzhen，HUA Yufei，ZHANG Caimeng，CHEN Yeming

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

The effects of enzymolysis time and acidic deamidation modification on the calcium-binding capacity of phytate degraded soybean protein isolate peptide were studied, and the structural and nutritional properties of peptide-calcium chelate were characterized. The results showed that when enzymolysis time was 240 min, the amount of bound calcium was higher (57.85 mg/g) and the chelate yield was 28.43%. After acidic deamidation, the amount of bound calcium and chelate yield increased to 75.37 mg/g and 34.55% respectively. Amino acid analysis demonstrated that acidic amino acid made the most contribution to chelation. The results ofMr distribution experiment indicated that peptide withMr≥1 000 showed a better chelation effect with a higher chelate yield, while peptides withMr≤500 were the main peptides when making chelation with high amount of bound calcium. Fourier transform infrared spectra expressed that oxygen atom on the carboxyl group and nitrogen atom on the amino group were primary coordination atoms, while peptide structure changed a lot. In vitro digestion and absorption simulation experiment indicated that peptide-calcium chelate had a better tolerance to pepsin and pancreatin, and theMr of the peptide almost had no change after digestion, with calcium retention rate about 87% and bioavailability up to 81.81%.

peptide-calcium chelate; enzymolysis; acidic deamidation; characterization

2016-11-24;

：2017-03-27

國家自然科學(xué)基金(31201380)

王小林(1990)，女，碩士，研究方向為油脂與植物蛋白(E-mail)390084217@qq.com。

孔祥珍，副教授，博士(E-mail)xzkong@jiangnan.edu.cn。

TS201.2；TS202.3

：A

：1003-7969(2017)07-0050-05