張正瑩,吳 潤

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅省蘭州市730000；2.景泰縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅省白銀市730400）

菌毒敵液、強力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同提取法對實驗室空氣菌的敏感程度的探究

張正瑩1,2,吳 潤1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅省蘭州市730000；2.景泰縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅省白銀市730400）

為了驗證菌毒敵液、強力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同提取法對實驗室空氣菌的敏感程度，本實驗采用微管-平板法測定了菌毒敵液、強力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同醇提物和水提物對實驗室空氣菌的最小抑菌濃度（MIC）,表明消毒藥品較中藥對實驗室細菌的抑制作用效果好，黃連醇提物對實驗室細菌的抑制作用明顯，甘草、黃柏的水提物對實驗菌的抑制作用不明顯。綜合經(jīng)濟效益和滅菌效果的綜合考慮，中藥滅菌可值得研究。

醇提物；最小抑菌濃度；水提物；消毒藥

早在20世紀50年代我國醫(yī)藥工作者即開始了中藥抑菌作用與抑菌成分研究，并發(fā)現(xiàn)許多具有抗菌作用的中藥。常規(guī)的藥敏實驗方法：有①紙片瓊脂擴散法；②試管稀釋法；③平板稀釋法；④打洞法；⑤挖溝法；⑥微量稀釋法等。然而這些方法也存在著其缺陷或局限性，因此我們應根據(jù)實際情況選擇較合適的方法。試管稀釋法是一個比較好的方法，但具有實驗工作量大，操作繁瑣，一個系列稀釋度含藥培養(yǎng)基只能測一種菌，營養(yǎng)要求高的菌無法培養(yǎng)等弊端；打洞法同紙片擴散法，存在藥物擴散問題，又沒有中藥標準紙片，實驗結(jié)果難以控制；平板稀釋法只需制兩個系列稀釋度含藥平板，一個稀釋度可同時測多種細菌，操作簡便，結(jié)果準確，是一種比較理想的方法，但是必須注意細菌之間交叉感染的問題；微量稀釋法準確可靠，重復性好，且簡便易行，但是結(jié)果不易觀察，加顯色劑以后不適用于需要加血的培養(yǎng)基。

根據(jù)以往的研究，傅文棟[1]對常見的抗菌抗中草藥的主要有效成分進行了列表，對此做出了總結(jié)，如金銀花為綠原酸、異綠原酸、新綠原酸；黃連為小檗堿、黃連堿、巴馬亭。盧芳國[2]等研究了12個中藥復方的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)由麻黃、杏仁、甘草、黃芩、魚腥草等組成的方劑抑菌效果最為明顯。楊勇[3]等對黃連中4種主要的生物堿的抑菌活性進行了研究發(fā)現(xiàn)小檗堿的抑菌活性最大，且4種黃連生物堿對G+菌的抑制活性大于G-菌和酵母菌。鄔蘇曉[4]等人研究發(fā)現(xiàn)黃柏抑菌效果較好，MIC為125mg/mL。中草藥在其他國家也是有所應用的，WHO曾經(jīng)做出過這樣的估計，全球使用中藥的人數(shù)占全世界人口的65%-80%。

在中藥體外抑菌實驗的研究中，一方面證實了其具有抑菌作用，另一方面也試圖發(fā)現(xiàn)其中的有效抑菌成分。到現(xiàn)在為止，發(fā)現(xiàn)有效地抑菌成分很多，而且有很多已經(jīng)直接或經(jīng)過改造后投入使用。從20世紀50年代起我國醫(yī)藥工作者開始了對中藥抑菌作用與抑菌成分的研究，發(fā)現(xiàn)了很多有抗菌作用的中藥和其抗菌的主要成分，抗菌成分是很復雜的，它主要包括有生物堿、有機酸、萜類、黃酮、醌類等。

實驗部分

1 材料

1.1 藥品

名稱 生產(chǎn)廠家金碘王（聚維酮碘溶液） 農(nóng)大潤農(nóng)生物科技有限公司中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑 哈爾濱中農(nóng)華大獸藥有限公司菌毒敵 湖南大乘醫(yī)藥化工有限公司強力消毒靈 中國農(nóng)業(yè)科學院中獸疫研究所藥廠威特格瑞 臨洮威特藥業(yè)有限公司燒堿 浩潤化工甘草 景泰縣同濟大藥房黃柏 景泰縣同濟大藥房黃連 景泰縣同濟大藥房

1.2 細菌 實驗室空氣菌

1.3 試劑

營養(yǎng)瓊脂，生產(chǎn)廠家：青島市高科技園海博生物科技有限公司

革蘭氏染液，生產(chǎn)廠家：青島市高科技園海博生物科技有限公司

普通肉湯培養(yǎng)基，生產(chǎn)廠家：杭州微生物試劑有限公司

1.4 儀器

儀器 型號 生產(chǎn)廠家生物安全柜 BSC-1300IIA2 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司壓力蒸汽滅菌器 WG-C35N.L 威海威高生物技術有限公司電熱恒溫鼓風干燥箱 DHG-9053A上海齊欣科學儀器有限公司電子天平 FA2104N 上海精密科學儀器有限公司超純水儀 OKP-S010 上海淶科儀器有限公司冰箱 BCD-256DT 青島海爾股份有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9052上海齊欣科學儀器有限公司

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

2.1.1 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備

30g營養(yǎng)瓊脂加入1000mL超純水，高壓滅菌121℃，15min。放入生物安全柜，當營養(yǎng)瓊脂溫度降到55℃左右時澆平板2-3cm厚。待平板內(nèi)瓊脂凝固后，冷藏備用[5]。

2.1.2 普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的制備

30g普通肉湯加入1000mL超純水，高壓滅菌121℃，15min。放入生物安全柜，紫外線消毒降溫到室溫冷藏備用。

2.2 試驗藥液的制備

2.2.1 菌毒敵液在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加20uL菌毒敵原液將其作1：500倍稀釋到畜禽房舍及器具消毒濃度，冷藏備用。

2.2.2 中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑 在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加20uL菌毒敵原液將其作1：500倍稀釋到畜禽房舍及器具消毒濃度，冷藏備用。

2.2.3 金碘王（聚維酮碘溶液）在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加10uL菌毒敵原液將其作1：1000倍稀釋到養(yǎng)殖場常規(guī)消毒濃度，冷藏備用。

2.2.4 威特格瑞液 在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加0.01g菌毒敵原液將其作1：1000倍稀釋到養(yǎng)殖場常規(guī)消毒濃度，冷藏備用。

2.2.5 強力消毒靈液 在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加0.01g菌毒敵原液將其作1：1000倍稀釋到飼養(yǎng)場所器具消毒濃度，冷藏備用。

2.2.6 燒堿溶液在生物安全柜內(nèi)稱取0.3g燒堿，加滅菌超純水10mL將其配成3%消毒濃度，冷藏備用。

2.2.7 醇提取 將黃連、黃柏、甘草粉碎，分別準確稱取10g，放入燒杯內(nèi)，加入 70%乙醇100mL，用超聲波提取30min，提取3次，然后加熱濃縮，濃縮液放入恒溫干燥箱中干燥成藥膏，再用蒸餾水溶解配成1g/mL的藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹11]。

2.2.8 水提取 將黃連、黃柏、甘草粉碎，分別準確稱取10g，放入錐形瓶中，加入適量的蒸餾水侵泡2-3h，用超聲波作用30min，然后用水煎20min，每種藥煎2-3次后濃縮成藥膏，用蒸餾水稀釋到1g/mL的藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹5]。

2.3 菌種的準備

取澆好的一個營養(yǎng)瓊脂平板打開放置在實驗室，24小時后挑取菌落并用普通營養(yǎng)肉湯做增菌培養(yǎng)，放置恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18-24h候得原菌液。取試管分別對原菌液用生理鹽水進行二倍比稀釋，用移液器從8號管中取20μL菌液注入平板上，重復做3個平板，并用L棒將其涂勻，培養(yǎng)18-24h查菌落數(shù)，得出原菌液的細菌濃度。將原菌液或稀釋后的菌液用生理鹽水稀釋到所需濃度106cfu/mL[6]，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 各藥液對試驗菌的最小抑菌濃度（MIC）的測定

在生物安全柜內(nèi)，采用微管-平板法。每種藥物12支EP管，每個EP管內(nèi)加入500μL的肉湯，向第1支EP管里加入500μL配好的藥液，混勻，從中吸取500μL加入第2支EP試管[5]，依次類推，直至第11支試管，棄去500μL，12號EP管做陰性對照。1-12號EP管內(nèi)加入20μL菌液，37℃培養(yǎng)18-24h后，將其分別接種到平板上[13]，37℃再培養(yǎng)18-24h后，得試驗藥物對實驗菌的MIC[7][8]。

3 試驗結(jié)果

通過試驗[8]，可以得出菌毒敵液、中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑、金碘王（聚維酮碘溶液）、威特格瑞液、強力消毒靈液和燒堿溶液的最小抑菌濃度的MIC,記錄于表2。

藥名 MIC（g/mL）菌毒敵液 1/500*8中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑 1/500*16金碘王（聚維酮碘溶液） 1/500*2威特格瑞液 1/500*128強力消毒靈液 1/500*128燒堿溶液 1/500*256甘草醇提物 1/32甘草水提物 1/8黃連醇提物 1/64黃連水提物 1/16

黃柏醇提物 1/32黃柏水提物 1/8

4 結(jié)論

燒堿溶液對試驗菌的抑制作用明顯，強力消毒靈液和威特格瑞液對實驗室細菌的抑制作用相當，對試驗菌的抑制作用僅次于燒堿，其它消毒藥對某些實驗室細菌的抑制作用不明顯。其中三種中藥的醇提物都比水提物對實驗菌的抑制作用強，這三種中藥其中黃連醇提物對實驗菌的抑制作用最強，黃連和黃柏的水提物對實驗菌的抑菌作用較小。此結(jié)論為實驗室消毒等工作具有指導意義。

[1]傅文棟.中草藥及其有效成分體外抗菌抗病毒研究進展[J].中國獸醫(yī)雜志，2006(5):66-67.

[2]盧芳國,朱應武,田道法.12個中藥復方體外抗菌作用的研究[J].湖南中醫(yī)學院學報,2004,24(4):9.

[3]楊勇,葉小利,李學剛.4種黃連生物堿的抑菌作用[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(12):3013-3014.

[4]鄔蘇曉,肖正中,李淑儀等.中草藥制劑對豬鏈球菌和大腸桿菌的體外抑菌效果[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2008,(05):183-184.

[5]王宏軍,周鐵忠,劉孝剛等.協(xié)同指數(shù)法篩選銀翹天甘組方的最佳劑量配比[J].動物醫(yī)學進展,2011,32（1）:58-62.

[6]蘆亞君,程 寧.3種中藥方劑逆轉(zhuǎn)大腸桿菌耐藥性的實驗觀察[J].西北藥學雜志,2007,22(6):309.

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S853.74

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1003-8655（2017）04-0010-03