禹小芳，鄒玖零，張 強(qiáng)，黃建龍，李英明，郝知友，屈蓓蓓，周爭先，羅 軍，尹秋元

（1. 永州市畜牧水產(chǎn)局，湖南永州 425000；2. 湖南省獸醫(yī)局，湖南長沙 410000；3. 湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410000）

一起雞感染H7N9流感病毒變異株的調(diào)查

禹小芳1，鄒玖零1，張 強(qiáng)2，黃建龍3，李英明1，郝知友1，屈蓓蓓1，周爭先1，羅 軍1，尹秋元1

（1. 永州市畜牧水產(chǎn)局，湖南永州 425000；2. 湖南省獸醫(yī)局，湖南長沙 410000；3. 湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410000）

[目的] 通過對雞H7N9流感病毒（變異株）感染臨床解剖特征的描述以及H7N9流感病毒變異株來源的探討，為今后該病的臨床診斷以及防控提供借鑒。[方法] 采用流行病學(xué)調(diào)查、臨床解剖、實時熒光定量RTPCR、病毒分離測序等方法。[結(jié)果]病雞外觀癥狀與解剖癥狀均明顯；H7、H9流感病毒核酸檢測陽性；該分離株與2013年分離毒株（A/Anhui/1/2013（H7N9）的HA、NA基因核苷酸同源性分別為97.8%～97.9%、97.8%。[結(jié)論]雞的感染死亡是由H7N9流感病毒（變異株）引起的；該變異株引發(fā)疫情迅猛，傳染速度快，致死率高，應(yīng)加強(qiáng)對其防控。

H7N9流感病毒；變異株；臨床特征；病毒重組

禽流感（Avian influenza，AI）是由流感病毒引起的禽類感染或疾病綜合征。流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科，其最顯著的生物學(xué)特性是亞型眾多、變異頻繁。其分子機(jī)制涉及點突變引起的抗原漂移（Antigenic drift）和不同亞型毒株同源重組產(chǎn)生新亞型所引起的抗原轉(zhuǎn)變（Antigenic shift）[1]。流感病毒根據(jù)兩個蛋白抗原性的不同，可被分為16個HA 亞型（H1～H16） 和9個NA亞型（N1～N9），理論上流感病毒可組成144個亞型[2]。高致病性禽流感病毒目前僅見于H5、H7兩個亞型。它們從水禽傳給陸禽，經(jīng)過幾代傳播以后，從低致病性演變成高致病性病毒。關(guān)于H7N9流感病毒變異株分子特征、人感染后的臨床癥狀已有報道[3]，但未見禽感染H7N9流感病毒變異株臨床特征的報道。因此，研究禽感染H7N9流感病毒變異株的臨床特征及變異株的來源，對重大動物疫病防控是有意義的。

1 材料與方法

1.1 病例來源

發(fā)病雞來自湖南省永州市東安縣端橋鋪鎮(zhèn)某養(yǎng)禽場。該禽場存欄蛋雞6 000余羽，品種為海蘭灰，320日齡。至發(fā)病第4日，累計死亡102羽。分別隨機(jī)采集8只發(fā)病雞的咽/肛拭子及血液樣品，備用。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查

向養(yǎng)殖戶、飼養(yǎng)員、防疫技術(shù)員詢問關(guān)于雞發(fā)病的相關(guān)信息，并對飼料、用藥進(jìn)行取證調(diào)查。

1.3 病理解剖

隨機(jī)選擇8只發(fā)病雞進(jìn)行臨床解剖，對發(fā)病雞的氣管、心臟、肝臟、腎臟等器官進(jìn)行病理解剖并拍照，做好記錄。

1.4 實驗室檢測

1.4.1 檢測試劑。禽流感病毒H5（Re-6株）、H7亞型血凝抑制試驗抗原（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司出品，批號201605）；禽流感病毒H5/ H7/H9型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒（深圳生科源生物科技有限公司產(chǎn)品，批號201506）。

1.4.2 檢測方法。關(guān)于禽流感病原學(xué)檢測，按禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法（GB/T 19438.1—2004）。從樣品中提取病毒 RNA 后，以實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（real-time RT-PCR）檢測H5/H7/H9 亞型核酸。關(guān)于禽流感抗體檢測，按高致病性禽流感診斷技術(shù)（GB/T 18936—2003）進(jìn)行血凝和血凝抑制試驗，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理。將有關(guān)數(shù)據(jù)錄入Excel 2003軟件，通過 SPSS 13. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病調(diào)查結(jié)果

發(fā)病前100 d，養(yǎng)雞場實施過H5亞型流感疫苗和“H5+H9”聯(lián)苗（廣東永順）免疫，飼養(yǎng)狀況良好，并無其他烈性發(fā)病情況。發(fā)病后的前4 天，分別死亡10、18、31、102羽（圖1）；死亡的前幾天，病雞采食量、產(chǎn)蛋量無明顯變化，外觀正常；至瀕死日，呈現(xiàn)明顯的外觀癥狀：精神萎靡、頭部腫大、肉髯發(fā)紺、流淚、口流涎（圖2），也有部分雞在采食過程中突然死亡。由于雞發(fā)病迅猛，死亡快，無腳趾出血癥狀。

圖1 發(fā)病禽場日死亡數(shù)量

圖2 發(fā)病3日的病危雞

2.2 病理解剖

臨床解剖8只發(fā)病雞，發(fā)現(xiàn)病理癥狀明顯（圖3）。普遍呈現(xiàn)：支氣管充血，呈現(xiàn)條紋狀血帶；肌胃旁脂肪有星點狀出血；腺胃乳頭有充血、出血；心包充血，心包液渾濁；肝臟腫大；腎臟腫大，呈花斑狀；十二指腸局部出血；輸卵管發(fā)紺，呈蛋清樣；卵泡變形液化；個別腦膜出血。

圖3 病理解剖各器官病變

2.3 實驗室檢測結(jié)果

對采集的各8份咽/肛拭子及血液樣品進(jìn)行編號，采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、血凝和血凝抑制試驗進(jìn)行抗原、抗體檢測。檢測結(jié)果見表1。在咽/肛拭子樣品中檢出H7、H9流感病毒核酸，且H7流感病毒核酸陽性檢出率達(dá)100%。對血清樣品進(jìn)行H5、H7抗體檢測，所有樣品均無H7抗體，H5抗體水平達(dá)27，實驗室診斷為疑似H7流感。經(jīng)哈爾濱獸醫(yī)研究所病毒分離測序檢測，確診為H7N9流感（變異株）。

表1 咽/肛拭子及血液樣品實驗室檢測結(jié)果

3 討論

H7N9流感病毒變異有幾種：一是發(fā)生點突變，包括堿基的替換、插入或缺失；二是不同亞型流感病毒之間發(fā)生基因重組。2013年在上海市流行的新型H7N9流感經(jīng)檢測認(rèn)為是由野鳥H7N9病毒（NA節(jié)段）、浙江H7N3病毒（HA節(jié)段）及北京市、上海市、江蘇省和浙江省等地的家禽H9N2病毒（除NA與HA節(jié)段外）重組而產(chǎn)生的[4]。而此次采集的樣品，經(jīng)哈爾濱獸醫(yī)研究所檢測，均檢測到H7N9流感病毒。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，上述H7N9流感病毒分離株與我國2013年A/ Anhui/1/2013（H7N9）毒株的HA和NA基因核苷酸同源性分別為97.8%～97.9%和97.8%。其中，HA基因裂解位點均有4個氨基酸增加，為變異株。本次抗原核酸檢測發(fā)現(xiàn)，該發(fā)病雞場也存在H7、H9等亞型流感病毒，且H9陽性率較高。這為變異株的重組提供了可能，所以不排除此H7N9流感變異株是由其它亞型流感病毒重組而來的可能。

流感病毒除了本身變異造成多樣性外[5]，還由于病毒來源的多樣性以及病毒之間的重組與重排[6]而導(dǎo)致病毒生物特性的改變。從外觀癥狀來看，此次的禽H7N9流感病毒變異株感染相比其它類型的禽流感感染，發(fā)病速度更迅猛，致死速度更快。以往禽感染禽流感后主要表現(xiàn)為采食量下降、產(chǎn)蛋量減少，出現(xiàn)軟殼蛋，腳趾出血等外觀癥狀。然而此次H7N9流感變異株感染多表現(xiàn)為急性經(jīng)過，甚至雞不表現(xiàn)明顯外觀癥狀而快速死亡。有研究表明，H7N9流感在哺乳動物貂和豬中也具有一定的傳染性[7]，這給重大動物疾病防控提出了更大考驗，也給現(xiàn)代養(yǎng)殖衛(wèi)生條件設(shè)施提出了更高要求。H9亞型流感病毒雖并不能使禽致病，但是其一方面能抑制機(jī)體的免疫，另一方面也可能重組其它亞型流感病毒，導(dǎo)致變異，因此給現(xiàn)代養(yǎng)禽行業(yè)的疾病防控提出了更高要求。

H7N9流感（變異株）對養(yǎng)禽業(yè)和人類健康的影響已經(jīng)引起了社會的廣泛關(guān)注。人們應(yīng)該充分認(rèn)識禽感染H7N9流感（變異株）的危害，加強(qiáng)對其的預(yù)防與控制，確保養(yǎng)禽業(yè)順利發(fā)展。

[1] 張賽，陸軍. H7N9 禽流感病毒基因檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015（12）：2226-2228.

[2] MUKAIGAWA J，NAYAK D P. Two signals mediate nuclear localization of influenza virus（A/WSN/33）polymerase basie protein2[J]. Virol，1991，65：245-253.

[3] 修文瓊，鄭奎城. 新型H7N9禽流感病毒研究進(jìn)展. 中國人獸共患病學(xué)報2014，30（6）：636-644.

[4] 張寶，黃克勇，郭勁松，等. H7N9 病毒的來源和重組模式[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，33（7）：1017-1021.

[5] BAO C J，CUI L B，ZHOU M H，et al. Live-animal markets and influenza A（H7N9）virus infection[J]. N Engl J Med，2013，368（24）：2337-2339.

[6] XIONG C，ZHANG Z，JIANG Q，et al. Evolutionary characteristics of a/Hangzhou/1/2013 and source of avian influenza virus H7N9 subtype in China[J]. Clin Infect Dis，2013，57：622-624.

[7] ZHU H，WANG D，KELVIN D J，et al. Infectivity，transmission，and pathology of human H7N9 influenza in ferrets and Pigs[J]. Science，2013，341（6142）：183-186.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

An Investigation on Chicken Infection with H7N9 Infuenza Virus Variants

Yu Xiaofang1，Zou Jiuling1，Zhang Qiang2，Huang Jianlong3，Li Yingming1，Hao Zhiyou1，Qu Beibei1，Zhou Zhengxian1，Luo Jun1，Yin Qiuyuan1
（1. Yongzhou Animal Husbandry and Fishery Bureau，Yongzhou，Hunan 425000；2. Hunan Veterinary Bureau，Changsha，Hunan 410000；3. Hunan Animal Disease Prevention and Control Center，Changsha，Hunan 410000）

[Objective] To explore the clinical features of H7N9 influenza virus（mutant）and the recombination possibility of H7vvN9 influenza virus mutant，and to provide reference for clinical diagnosis and disease prevention and control in the future. [Methods] Epidemiological survey，clinical anatomical diagnosis，real-time quantitative RTPCR method，virus isolation sequencing were used. [Results] The appearance and anatomical symptoms of sick chicken were obvious. The results of H7 and H9 subtype detection were positive. The nucleotide homology of the virus isolates in HA and NA gene of A/Anhui/1/2013（H7N9） were 97.9% and 97.8%，respectively. [Conclusion] The infectious death of chicken was caused by H7N9 influenza virus（mutant）. The outbreak caused by this strain was rapid，fast and lethal，and should be strengthened and prevented.

H7N9 influenza virus；variant strain；clinical features；viral recombination

S851.3

A

1005-944X（2017）09-0004-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.002