黨耀宏，王蘇康，方鵬超，張萌，張永樂，苗碩，胡翠，張露文，劉世國＊

（1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院河南新鄉(xiāng)453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分子病原體實驗室河南新鄉(xiāng)453000）

河南新鄉(xiāng)寵物犬、貓與弓形蟲病感染關(guān)系探討

黨耀宏1，王蘇康1，方鵬超1，張萌1，張永樂1，苗碩1，胡翠1，張露文2，劉世國2＊

（1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院河南新鄉(xiāng)453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分子病原體實驗室河南新鄉(xiāng)453000）

目的：為了了解河南省新鄉(xiāng)市寵物犬、貓弓形蟲感染情況，探討獸齡、性別與弓形蟲感染關(guān)系，為弓形蟲病的防治提供依據(jù)。方法：2014年10月-2015年10月直接采集動物靜脈血，用酚試劑方法提取寵物犬、貓血液中總DNA，將弓形蟲529多拷貝片段作為待檢弓形蟲序列，通過單管一步法巢式PCR技術(shù)隨機對新鄉(xiāng)市區(qū)124只寵物犬、54只寵物貓進(jìn)行了弓形蟲檢測。結(jié)果：124份寵物犬樣本中，弓形蟲陽性13份，陽性率為10.48%（13/124），54份貓樣本中有弓形蟲陽性28份，陽性率為51.85%（28/54）；貓血樣本中，雌性陽性率63.16%（12/19），雄性陽性率47.83%（11/23）；貓各年齡段中，小于6月齡陽性率66.67%（6/9），6月～12月齡陽性率75.00%（6/8），1歲～3歲陽性率60.00%（9/15），3歲以上陽性率50.00%(1/2)。結(jié)論：寵物貓弓形蟲感染率高于寵物犬；寵物貓性別之間弓形蟲感染無顯著差異；隨著年齡增長，寵物貓弓形蟲感染率逐漸下降。

弓形蟲；犬；貓；巢式PCR

弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種世界范圍內(nèi)分布的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，能感染幾乎所有的溫血動物，包括人類、家畜和野生動物。人畜和禽類等其他動物為中間宿主，貓及貓科類動物是它的終末宿主。人類通過消費未煮熟的肉類（含有組織囊腫或孢子化卵囊）而感染，可以導(dǎo)致胎兒和免疫低下的人群患病，甚至威脅他們的生命。狗和貓是世界上最受歡迎的寵物動物，如今，狗已經(jīng)承擔(dān)了許多功能：作盲人向?qū)?，作為警衛(wèi)和獵狗，有一個寵物的好處是不可爭議的，貓和狗都成了人類家庭的一部分。但動物和人弓形蟲感染都呈上升趨勢，因此，準(zhǔn)確把握寵物弓形蟲感染狀況，對弓形蟲病的防治尤為重要。

目前弓形蟲的常用檢測方法主要有血清學(xué)、病原形態(tài)鑒定和小鼠腹腔接種及核酸檢測等。血清學(xué)檢測陽性率較高，但常存在假陽性及既往感染的缺點；小鼠接種檢測周期較長，臨床上難以推廣；PCR檢測待檢樣品中蟲體核酸的方法是近年來常用的檢測手段，以檢測到病原體目的DNA為陽性標(biāo)準(zhǔn)，此法可以快速、敏感、特異地檢測到弓形蟲感染。為了解河南省新鄉(xiāng)市寵物犬、貓弓形蟲感染情況，本研究于2014年10月-2015年10月運用PCR檢測技術(shù)開展了寵物犬、貓弓形蟲感染的流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 試劑

蛋白酶K（USA Genview），Tris飽和酚（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），PCR 2*Es Taq master mix（中國北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），弓形蟲RH株由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室長期保種，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 樣品采集及預(yù)處理

2014年10月-2015年10月在新鄉(xiāng)市各地區(qū)隨機采集寵物犬124份血樣，每只動物采集3～4 mL靜脈血，4℃存放備檢。隨機收集寵物貓血樣54份，其中雌性19份，雄性23份，12份性別不明；體重1.5～7.5 kg；年齡小于6個月9份，6～12個月8份，1～3歲5份，3歲以上2份，20份年齡不詳。每只采取1.5～2 mL靜脈血EDTA抗凝，4℃存放備檢；健康犬、貓血400μL，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室提供，同法處理備用。

1.3 方法

寵物犬、貓血DNA的提取按酚-氯仿苯酚抽提法進(jìn)行，弓形蟲RH株滋養(yǎng)體的DNA提取常規(guī)采用酚-氯仿法進(jìn)行。以寵物犬、貓血總DNA為模板，進(jìn)行單管一步法巢式PCR，擴增弓形蟲529多拷貝片段。弓形蟲529外引物F：5'-CGC TGC AGG GAG GAA GAC GAA AGTTG-3'，R：5'-CGC TGC AGA CAC AGT GCA TCT GGA TT-3'，弓形蟲529內(nèi)引物F：5'-AGA AGG GAC AGA AGT CGA AG一3', R：5'一CTC CAC TCT TCA ATT CTC TCC一3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃2 min，95℃30 s，68℃30 s，72℃50 s進(jìn)行15循環(huán)擴增；然后在95℃30 s，58℃30 S，72℃50 s，72℃5 min條件下再進(jìn)行共35循環(huán)擴增，每個樣本DNA擴增反應(yīng)均在一個PCR反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行。取15μL PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。以RH株弓形蟲滋養(yǎng)體DNA作陽性對照，ddH2O作空白對照。PCR反應(yīng)結(jié)果見圖一。

圖1 弓形蟲529多拷貝片段的擴增

1.4 數(shù)據(jù)處理

EXCEL 2010建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。不同種類陽性率之間的比較用x2檢驗，P＜0. 05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 犬、貓弓形蟲感染情況

犬弓形蟲陽性率為10.48%，貓弓形蟲陽性率為51.85%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，X2=36.313，P＜0.005，新鄉(xiāng)市寵物貓與寵物犬感染率有顯著差異。（見表1）

2.2 各年齡段貓弓形蟲感染情況

小于6月齡貓感染率為66.67%，6月～12月齡貓感染率為 75.00%，1歲 ～3歲貓感染率為60.00%，3歲以上的貓感染率為50.00%，未知年齡的貓感染率為30.00%。在貓各年齡段中差異不顯著。（見表2）

2.3 不同性別貓弓形蟲感染情況

雌貓感染率為 63.16%，雄性貓感染率為47.83%，未知性別的貓的感染率為41.67%，性別差異不顯著。（見表3）

表1 犬、貓弓形蟲感染情況

表2 貓各年齡段弓形蟲感染情況

表3 不同性別貓弓形蟲感染情況

3 討論

據(jù)統(tǒng)計1985-2006年期間，我國犬弓形蟲感染率在0.66%～62.3%之間不等，貓弓形蟲感染率在14.06%～78%之間[1]。本次對新鄉(xiāng)市區(qū)的各寵物診所中124只寵物犬，54只寵物貓進(jìn)行了實驗室檢測，寵物犬的陽性率為10.48%，寵物貓的陽性率為51.85%。寵物犬與國內(nèi)報道的山東陽性率3.50%，?？陉栃月?.6%相比較高，與貴陽陽性率19.5%，北京陽性率13.2%相比較低，寵物貓在國內(nèi)報道結(jié)果與寵物狗相似（山東陽性率3.90%，?？陉栃月?.58%，貴陽陽性率63.2%，北京陽性率57.8%），這表明新鄉(xiāng)市寵物的弓形蟲感染處于全國中等水平。而結(jié)果與德國報道的牧羊犬陽性率46.3%，流浪貓陽性率47.2%相比，德國犬、貓都處于較高的感染水平，這可能是流浪狗、貓比寵物狗、貓感染更加顯著的原因。本次調(diào)查結(jié)果顯示：寵物貓陽性率顯著高于寵物狗，這與報道的日本（貓陽性率6.7%，狗陽性率1.9%）、德國（貓陽性率33.6%，狗陽性率9.4%）、中國海南（貓陽性率5.58%，狗陽性率2.6%）結(jié)果相符。陽性貓排泄大量的弓形蟲卵囊污染人類環(huán)境，它在人類感染弓形蟲的過程中起到了極大的作用，我們對其的監(jiān)測與防治不容忽視。

這次調(diào)查寵物貓雄性與雌性弓形蟲感染率差異無顯著性（雄性陽性率47.83%，雌性陽性率63.16%，P＞0.05）。與德國（雄性陽性率47.9%，雌性陽性率52.1%，P＞0.05）、巴基斯坦（雄性陽性率25.68%，雌性陽性率27.27%，P＞0.05）、中國長沙（雄性陽性率27.2%，雌性陽性率28.5%，P＞0.05）等性別差異的調(diào)查結(jié)果相符合。在不同年齡階段，有人認(rèn)為幼年的貓可以從母體中獲得，也可以在后天哺乳中獲得，并且幼貓免疫系統(tǒng)仍在發(fā)育，表現(xiàn)出較高的陽性率，有報道稱小于1歲的貓（46.6%）弓形蟲感染率顯著高于大于1歲的貓（18.4%，P＜0.001），隨著年齡的增加感染率也在下降,本次調(diào)查結(jié)果與上述報道相符?？赡芘c幼貓抵抗力低易感染弓形蟲，顯性感染而未得到及時治療，伴發(fā)其他疾病死去，存活者感染率較低。

我國人口標(biāo)準(zhǔn)化弓形蟲感染率6.02%，國際人口標(biāo)準(zhǔn)化感染率5.52%，隨著寵物的品種和數(shù)量的急劇增加，人類與動物接觸的日益頻繁，通過動物將動物源人獸共患病傳播給人類的風(fēng)險日益增大，對疾病傳播的防控刻不容緩。我們發(fā)現(xiàn)貓和狗的性別、年齡對弓形蟲的傳播無顯著差異，Dubey等人也認(rèn)為不同年齡、性別和品種的貓對弓形蟲都易感。而流浪貓相比寵物貓感染率較高，可能是因為流浪貓的戶外訪問和狩獵行為較多，并且排出含有弓形蟲卵囊的糞便污染環(huán)境。狗雖然不能產(chǎn)生卵囊，但因為他們的嗅覺能力，有尋找和滾動惡臭物質(zhì)并污染毛皮的習(xí)慣，可能從貓屎機械傳遞卵囊給人類。

為了降低弓形蟲傳播，應(yīng)盡可能的控制流浪貓，流浪狗的數(shù)量；注意寵物貓，寵物狗的衛(wèi)生和必要的體檢；避免食用未煮熟的肉類；孕婦或免疫功能低下的人要避免接觸貓、狗及其糞便?！?/p>

[1] 鄭世英,鄭芳,李士平,等.山東省部分地區(qū)犬貓弓形蟲病流行情況調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志.2015,51(3)：74-75.

Epidemiological Investigations of Toxoplasmosis in PetDogs and Cats in Xinxiang City ofHenan Province

DANG Yaohong1,WANG Sukang1,FANG Pengchao1,ZHANG Meng1,ZHANG Yongle1,M IAO Shuo1,Hu Cui1,ZHANG Luwen2,LIU Shiguo2＊

(1.FirstAffiliated HospitalofXinxiang MedicalUniversity,Xinxiang,453000; 2.Molecular pathogen laboratory ofXinxiang MedicalUniversity,Xinxiang,453000.)

Objectives：A epidemiological survey of Toxoplasma gondii infection in petdogs and cats in Xinxiang City,Henan Province，to explore the relationship between animal age and gender with Toxoplasmosis,and to provide the basis for the prevention and treatmentof Toxoplasmosis.Methods：Single tube nested PCR was used to detect the DNA fragment sequences of Toxoplasma gondiiwhich is distilled from collecting venous blood of 124 petdogs and 54 petcats by Phenol reagentin Xinxiang area during the period from October 2014 to October 2015.Results：The results showed that the positive rate was 10.48%(13/124)in 124 petdogs and 51.85%(28/54) in pet cats blood samples,in this pet cats blood samples,63.16%(12/19)in the female and 47.83%(11/23)in male.Allages ofcats,the positive rate was 66.67%(6/9)less than 6 months old,75.00%(6/8)from 6 to 12 months old，60.00%(9/15)from 1 yearold to 3 years old and 50.00%(1/2)above 3 years old.Conclusion：The Toxoplasmosis positive rate ofpetcats was significantly higher than petdogs.There was no significantdifferences in Toxoplasma gondiiinfection ofpetcats among sexes.When the age ofpetcatgrows,the infection rate of Toxoplasma gondiiis gradually declined.

Toxoplasma gondii;dog;cat;Nested PCR.

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.06.052

*通訊作者：劉世國，lsg1963@163.com