高金玉， 郭慧琴， 曹 路， 韓 冰,2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)是一種基于普通PCR定性技術(shù)發(fā)展而來的新型的核酸定量技術(shù)，具有定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性高、靈敏度高和高通量等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)、單個(gè)核酸多態(tài)性分析和基因表達(dá)研究。在基因表達(dá)分析過程中，結(jié)果時(shí)常會(huì)受到不同變量的影響，如起始RNA的質(zhì)量和數(shù)量、反轉(zhuǎn)錄合成[1]。在qRT-PCR試驗(yàn)中，為了使結(jié)果可信，需要篩選表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。在基因定量表達(dá)的研究中，通常選用看家基因(House-keeping gene)作為內(nèi)參基因，因?yàn)榭醇一蚴侨考?xì)胞中均要表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物對(duì)于維持細(xì)胞各種基本生命活動(dòng)是必需的，比如常用的糖酵解酶系基因、微管蛋白基因和核糖體蛋白基因等。一般認(rèn)為看家基因的表達(dá)只受機(jī)體RNA聚合酶或啟動(dòng)子相互作用的影響，并不受其他機(jī)制調(diào)節(jié)，看家基因的表達(dá)受環(huán)境因素的影響較小。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)看家基因在不同組織部位或者不同處理下的表達(dá)量并不穩(wěn)定，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性降低，甚至發(fā)生錯(cuò)誤[4]。關(guān)波[5]曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)18srRNA在不同組織細(xì)胞中的表達(dá)量是不同的，在細(xì)胞有絲分裂期間，其表達(dá)量近乎為零。這些結(jié)果使得人們?cè)谥苯舆x擇18srRNA、TUB等常規(guī)的看家基因作為內(nèi)參基因時(shí)產(chǎn)生了懷疑[6]，因此對(duì)最適內(nèi)參基因的篩選成為了對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量研究前所必需的工作。

短花針茅(Stipabreviflora)屬于禾本科，針茅屬。是荒漠草原的建群種，又是優(yōu)良的牧草，具有十分重要的生態(tài)和飼用價(jià)值，對(duì)荒漠地區(qū)惡劣生境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，是探究荒漠草原區(qū)重要野生牧草對(duì)全球變暖響應(yīng)機(jī)制的良好材料。然而關(guān)于短花針茅的研究，目前還主要集中在生理生態(tài)等方面，在分子遺傳等方面的研究進(jìn)展緩慢。為了揭示短花針茅在增溫處理下基因的表達(dá)機(jī)制，本研究分析9個(gè)常見候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料短花針茅葉片，采集于內(nèi)蒙古四子王旗烏蘭花鎮(zhèn)的“內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院四子王旗實(shí)驗(yàn)基地”，在短花針茅果后營(yíng)養(yǎng)期采集增溫區(qū)和對(duì)照區(qū)的短花針茅葉片組織，液氮冷凍，-80℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA提取及cDNA的合成 用Trizol Reagen試劑盒提取樣品總RNA，用核酸定量?jī)x和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的濃度、純度以及完整性。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，于-20℃儲(chǔ)藏備用。

1.2.2候選內(nèi)參基因的選擇與引物設(shè)計(jì) 具體參考Karunesh Kumar在谷子中篩選內(nèi)參基因的引物序列[7]，合成本試驗(yàn)所用引物，引物序列如表1所示。

表1 候選內(nèi)參基因的引物序列Table 1 The primers of candidate reference genes

1.2.3普通PCR 普通PCR為20 μL的反應(yīng)體系:5×PrimerSTARTMBuffer(Mg2+plus)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mM each)1 μL，上游引物(20 μM) 0.5 μL，下游引物(20 μM)0.5 μL，短花針茅cDNA 1 μL，PrimerSTARTMHS DNA Ploymerase 1 μL，RNase Free dH2O 11 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)加熱3 min，94℃模板變性30 sec，60℃退火30 sec，72℃模板延伸30 sec，72℃保持5 min使產(chǎn)物延伸完整，35個(gè)循環(huán)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 20 μL的熒光定量PCR反應(yīng)體系包括：SYBRPremixExTaqTM(2×)10 μL，上游引物和下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free dH2O 6 μL。qRT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性5 sec，60℃退火30 sec，45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行熔解曲線分析以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，溫度從60℃緩慢遞增到95℃，連續(xù)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取熔解曲線。

1.2.5數(shù)據(jù)處理及分析 使用Delta-Ct法和geNorm, Normfinder, BestKeeper 3個(gè)軟件分析候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性。其中g(shù)eNorm是將每個(gè)平行反應(yīng)樣品的平均Ct值轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的數(shù)據(jù)，計(jì)算出內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的M值，M值越大穩(wěn)定性越差，M值越小穩(wěn)定性越好。一般情況下M值大于1.5為不可接受，表明該內(nèi)參基因不可用。這個(gè)軟件可計(jì)算引入1個(gè)新的內(nèi)參基因后標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異V值，可根據(jù)Vn/Vn+1比值來判定所需新的內(nèi)參基因的數(shù)目。一般默認(rèn)的V值為0.15，如果Vn/Vn+1大于0.15，則有必要引入第n+1個(gè)內(nèi)參基因，如果小于0.15，則不必引入新的內(nèi)參基因。Normfinder軟件的原理是基于方差分析對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行直接評(píng)價(jià)，產(chǎn)生基因表達(dá)穩(wěn)定值，然后根據(jù)穩(wěn)定值的大小排序，最終將表達(dá)穩(wěn)定值最小的基因作為最穩(wěn)定的基因。

BestKeeper軟件主要通過比較a值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)從而選擇表達(dá)穩(wěn)定的基因，標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差。其中標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)是最關(guān)鍵的因素，SD值小于1看作是可以接受的范圍之內(nèi)的變異。

RefFinder在線綜合分析軟件是對(duì)上述3種軟件及評(píng)價(jià)方法的整合，它通過對(duì)4種方法給出的穩(wěn)定性排名進(jìn)行加權(quán)幾何平均數(shù)的計(jì)算，最終得出綜合排名系數(shù)。

1.2.6內(nèi)參基因的驗(yàn)證 從模擬增溫處理的短花針茅果后營(yíng)養(yǎng)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)挑選2個(gè)上調(diào)基因，2個(gè)下調(diào)基因和1個(gè)表達(dá)量不變的基因，利用Premier5.0軟件，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的基因序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)5個(gè)基因的特異性引物(表2)，通過qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證內(nèi)參基因的準(zhǔn)確性。

普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序與上述相同。

表2 5個(gè)驗(yàn)證基因的引物序列及注釋結(jié)果Table 2 The primers and annotation results of 5 validation genes

注：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及相對(duì)表達(dá)量變化倍率均為增溫組比對(duì)照組

Note: The change rate of the transcription group sequencing and relative expression rate are increased in the temperature group than in the control group

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA樣品質(zhì)量檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1)顯示，短花針茅各樣品的RNA電泳圖譜帶型清晰，28S RNA的亮度約為18S RNA亮度的2倍，且5S RNA條帶亮度較弱，所有RNA樣品符合qRT-PCR的試驗(yàn)要求，其中SD1樣品的RNA有g(shù)DNA污染，用DNA酶消化純化可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。核酸定量檢測(cè)顯示，各樣品OD260/280值均在1.8～2.1之間，表明RNA純度較好，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)研究的需要。

2.2 候選內(nèi)參基因的普通PCR分析

運(yùn)用設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)短花針茅cDNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示9個(gè)候選基因中有6個(gè)呈現(xiàn)的條帶單一明亮，說明引物特異性好，可以進(jìn)行實(shí)

時(shí)熒光定量PCR。TUBβ，RNAPOLII及GAPDH未獲得良好擴(kuò)增，在后續(xù)試驗(yàn)中予以剔除。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序短花針茅總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The agarose gel electrophoresis result of rna-seq Stipa breviflora total RNA注：M為total RNA標(biāo)準(zhǔn)品，SS為增溫處理，SD為試驗(yàn)對(duì)照Note: M: Total RNA standard; SS: Warming treatment; SD: Experiment control

圖2 9個(gè)候選內(nèi)參基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 The agarose gel electrophoresis resultsof 9 candidate reference genes

2.3 內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果如表3所示，6個(gè)候選內(nèi)參基因的cq值范圍都在25以下，表明短花針茅cDNA樣品中6個(gè)候選內(nèi)參基因都有較好的表達(dá)豐度。其中18srRNA的cq值最小為12.4917，APRT的cq值最大為23.6783，TLF，EF-1α，Actin2，TUBα的cq值分別為15.9183，18.5283，20.7217和20.7333。各候選內(nèi)參基因存在表達(dá)差異，表明不同內(nèi)參基因的表達(dá)量在模擬增溫處理?xiàng)l件下存在較大差異。

表3 6個(gè)候選內(nèi)參基因的qRT-PCR結(jié)果Table 3 The qRT-PCR results of six candidate reference genes

6個(gè)候選內(nèi)參基因的熔解曲線如圖3所示，都呈單峰型，不同曲線間的重復(fù)性高，表明引物特異性良好，所得數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步的分析。

圖3 6個(gè)候選內(nèi)參基因的熔解曲線Fig.3 The melting curve of 6 candidate reference genes

2.4 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

4種內(nèi)參基因篩選方法所給出的分析結(jié)果不完全相同(圖4)。其中在normFinder軟件的分析結(jié)果中，數(shù)值越低表明候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越高。由圖4-A可知，18srRNA的穩(wěn)定性最高，穩(wěn)定性為0.179；其次為TLF，穩(wěn)定性為0.23；APRT為0.401；EF-1α為0.543；TUBα為0.642；Actin2最不穩(wěn)定為0.659。

運(yùn)用geNorm軟件對(duì)短花針茅6個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性(M值)分析，當(dāng)M值<1.0時(shí)，認(rèn)為候選內(nèi)參基因可以作為內(nèi)參基因使用，M值越低越好。結(jié)果顯示，6個(gè)候選內(nèi)參基因都可以作為內(nèi)參基因來使用，其中TLF和APRT同為表達(dá)最穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因，M值為0.207；TUBα其次，M值為0.304；18srRNA的M值為0.4；EF-1α的M值為0.54；Actin2表現(xiàn)最不穩(wěn)定，M值為0.596(圖4-B)。

用Delta-CT法計(jì)算短花針茅6個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示18sRrRNA的穩(wěn)定性最高為0.473，其次TLF為0.501，APRT為0.557，EF-1α為0.639，TUBα為0.699，Actin2最不穩(wěn)定,其穩(wěn)定性為0.710(圖4-C)。

BestKeeper軟件主要通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(SD值)來衡量候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。數(shù)值越小越穩(wěn)定。由圖4-D可知，TLF在6種候選內(nèi)參基因中最穩(wěn)定，SD值為0.108；APRT(0.136)次之，TUBα，18srRNA，EF-1α，Actin2的SD值依次為0.294，0.422，0.772，0.822。雖然4種分析方法得出的穩(wěn)定性排名不同，但是這6個(gè)候選內(nèi)參基因都可以作為內(nèi)參基因來使用。尤其是TLF，18srRNA和TUBα,這3個(gè)候選內(nèi)參基因在不同評(píng)價(jià)方法中排名均靠前。

圖4 4種方法篩選候選內(nèi)參基因的結(jié)果Fig.4 The results of 4 candidate reference gene analysis methods

RefFinder在線綜合分析得出的綜合排名如圖5所示，其中TLF的穩(wěn)定性最高，綜合排名系數(shù)為1.414；其次為18srRNA，綜合排名系數(shù)為2.000；APRT為2.060，TUBα為3.873，EF-1α為4.472，Actin2最不穩(wěn)定，其綜合排名系數(shù)為6.000。所以選擇TLF作為短花針茅模擬增溫下的內(nèi)參基因進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 RefFinder分析結(jié)果Fig.5 The result of RefFinder analysis

2.5 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證

2.5.1驗(yàn)證基因的普通PCR擴(kuò)增 運(yùn)用設(shè)計(jì)好的特異性引物對(duì)5個(gè)驗(yàn)證基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖6所示，條帶均單一明亮，所選引物可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 5個(gè)驗(yàn)證基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.6 The agarose gel electrophoresis results of 5 verification gene

2.5.2驗(yàn)證基因的qRT-PCR 以篩選出的TLF作為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。圖7為5個(gè)驗(yàn)證基因的熔解曲線。可以看出，5個(gè)基因的引物特異性良好峰型呈現(xiàn)單峰狀，且不同曲線間重復(fù)性高。

圖7 5個(gè)驗(yàn)證基因的熔解曲線Fig.7 The melting curve of 5 verification genes

將5個(gè)驗(yàn)證基因在qRT-PCR中獲得的增溫和對(duì)照之間的相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中獲得的變化倍率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示5個(gè)基因在qRT-PCR試驗(yàn)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的變化趨勢(shì)一致。DHZM-L776和DHZM-L2454 2個(gè)基因在RNA-seq中增溫與對(duì)照相比都是下調(diào)基因，分別下調(diào)0.06倍和0.12倍；在qRT-PCR試驗(yàn)中分別下調(diào)0.05倍和0.17倍。DHZM-L1899在RNA-seq中表達(dá)量不變，其比率為1.02；在qRT-PCR試驗(yàn)中，其比率為0.92。DHZM-L12725和DHZM-L15404兩個(gè)基因在RNA-seq中為上調(diào)基因，分別上調(diào)44.63倍 和168.4倍；在qRT-PCR試驗(yàn)中分別上調(diào)49.60倍和71.93倍(表2，圖8)。

3 討論

在以往的研究中，研究者經(jīng)常使用GAPDH[8]、Actin[9]、TUBα[10]等看家基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行定量分析，但是許多看家基因在不同的試驗(yàn)處理下表達(dá)量具有很大差異。盲目的選擇內(nèi)參基因，往往會(huì)造成試驗(yàn)結(jié)果不理想，甚至出現(xiàn)錯(cuò)誤。Long[11]等在對(duì)小麥(Triticumaestivum)的研究中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Actin是最不穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因，與本研究結(jié)果一致。Kim[12]在對(duì)不同發(fā)育時(shí)期及紫外照射下水稻黃化苗的內(nèi)參基因篩選中發(fā)現(xiàn)18srRNA是最穩(wěn)定的。黃文華[13]在對(duì)干旱處理下蒙古冰草(Agropyronmongolicum)的內(nèi)參基因篩選中分析了Actin2，18srRNA，APRT，EF-1α，RNApollⅡ，TUBα，TUBβ，GAPDH，TLF9個(gè)看家基因，發(fā)現(xiàn)18srRNA表達(dá)最穩(wěn)定。Jian[14]等發(fā)現(xiàn)大豆(Glycinemax)中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是ELF1b和CYP2。EF-1α也常被當(dāng)作內(nèi)參基因來使用，但是在不同的物種、生長(zhǎng)時(shí)期和處理中得到的結(jié)果卻完全不同，例如當(dāng)擬南芥受到生物與非生物脅迫時(shí)內(nèi)參基因EF-1α的表達(dá)很不穩(wěn)定[15]，在本研究中卻相對(duì)穩(wěn)定，可以考慮作為內(nèi)參基因來使用。

圖8 5個(gè)驗(yàn)證基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 The relative expression of 5 verification genes

本研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因都可以作為內(nèi)參基因來使用，這與模擬增溫處理屬于較溫和的處理有關(guān)，但這6個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性依然存在巨大差異，其中最適合本研究的內(nèi)參基因是TLF。

4 結(jié)論

本研究基于Delta-CT法，geNorm，normFinder和BestKeeper軟件以及RefFinder工具分析比較了9個(gè)內(nèi)參基因18srRNA，Actin2，APRT，EF-1α，TLF，TUBα，TUBβ，GAPDH和RNApollⅡ在短花針茅葉片組織的表達(dá)穩(wěn)定性。Delta-CT和normFinder分析結(jié)果顯示，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)?8srRNA；geNorm和BestKeeper分析結(jié)果顯示，TLF為表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。運(yùn)用RefFinder軟件綜合分析，TLF基因表達(dá)最穩(wěn)定，依次為 18srRNA,APRT,TUBα,EF-1α,Actin2。以TLF為內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明TLF為短花針茅模擬增溫處理下的最佳內(nèi)參基因。