崔丹丹，王傲杰，王新港，周 峰，彭志鋒，王川慶

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

1株P(guān)RRSV類NADC30毒株的分離鑒定及序列分析

崔丹丹，王傲杰，王新港，周 峰，彭志鋒，王川慶*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為了解豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)流行株的變異情況，將PRRSV陽性病料處理后接種Marc-145細(xì)胞，成功分離到1株P(guān)RRSV毒株，將其命名為HENZXC-4，并對其全基因組序列進(jìn)行測定和分析。結(jié)果表明，HENZXC-4為未發(fā)生重組的類NADC30毒株，其NSP2蛋白存在131個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失，且其GP5蛋白存在1個(gè)氨基酸插入。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒； 分離鑒定； 類NADC30株； 序列分析

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以妊娠母豬繁殖障礙及各生長階段豬的呼吸道癥狀為特征的傳染病，最早于1987年在美國報(bào)道，目前已成為嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一[1]。PRRSV基因組全長約15 kb，包含至少10個(gè)開放式閱讀框(open reading frames,ORFs)，具有高度變異的特點(diǎn)，在進(jìn)化過程中可通過突變、缺失、插入、重排及重組等方式進(jìn)行遺傳變異，進(jìn)而導(dǎo)致病毒的多樣性。

我國作為世界上養(yǎng)豬大國之一，自1995年底報(bào)道出現(xiàn)PRRS后，養(yǎng)豬業(yè)已被該病困擾長達(dá)20多年。我國分離到的第1株P(guān)RRSV為經(jīng)典毒株CH-1 a[2]。2006年，高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引發(fā)了一場豬的“高熱病”，其NSP2蛋白與經(jīng)典毒株相比存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸的特征性缺失，為該類毒株的特征性缺失。隨后，該類毒株逐漸成為國內(nèi)PRRSV優(yōu)勢流行毒株[3-7]。然而，近年來針對該優(yōu)勢流行毒株的弱毒活疫苗的廣泛使用造成了一些疫苗回復(fù)株在田間流行的現(xiàn)象[8]。此外，自2012年周峰等[9]首次發(fā)現(xiàn)與美國NADC30毒株高度同源的國內(nèi)毒株以來，陸續(xù)有學(xué)者報(bào)道在我國其他地方有類NADC30毒株出現(xiàn)，且逐漸成為繼HP-PRRSV之后的又一田間優(yōu)勢流行毒株，該類毒株在NSP2蛋白存在131個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失，并易與其他類型PRRSV毒株發(fā)生重組[10-15]。目前，我國出現(xiàn)了多種類型PRRSV毒株共存的局面，且各類毒株仍在不斷地變異，加大了該病的防控難度。分析PRRSV遺傳變異情況，對指導(dǎo)PRRS防控工作具有重要意義[16-18]。鑒于此，本研究分離了PRRSV，并對其進(jìn)行全基因組序列分析，以了解河南省PRRSV流行株的變異特征，旨在為PRRS的防控及疫苗研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1病料采集

PRRSV陽性病料采自河南省駐馬店市某HP-PRRSV疫苗免疫豬場病死豬只的肺臟、脾臟及淋巴結(jié)等，取適量研磨后于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2菌株、毒株及載體

pMD18-T克隆載體購自寶生物工程(大連)有限公司；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞及PRRSV陽性對照毒株(HP-PRRSV毒株HENZZ-8)由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3主要試劑及細(xì)胞

RNAiso Plus試劑、隨機(jī)引物、dNTP、RNA酶抑制劑(RNase Inhibitor)、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、DL2000 DNA Marker、5′ Full RACE 試劑盒和3′ Full RACE試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖購自Sigma公司；2×ExTaqMaster Mix(含染料)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自北京四季青公司；DAPI染色液及FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG熒光抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；抗美洲型PRRSV N蛋白單克隆抗體由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)田克恭教授惠贈；Marc-145細(xì)胞由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊國宇教授惠贈；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成

使用郭天準(zhǔn)等[19]設(shè)計(jì)的引物P3-F/R(F: 5′-GTGTCAGGCATTGTGGCTGTG-3′,R: 5′- CA-TTATTGGCGTGTAGGTGATAGAAAA-3′)對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行RT-PCR檢測，使用周峰[20]設(shè)計(jì)的針對類NADC30毒株的10對特異性引物對全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，基因組5′ 端和3′ 端分別采用5′ Full RACE 試劑盒 和3′ Full RACE 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增(表1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PRRSV全基因組擴(kuò)增引物

1.5PRRSV流行毒株的分離與鑒定

將保存的PRRSV陽性病料經(jīng)離心、過濾后取1 mL 濾液接種于生長至單層的Marc-145細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，加入5 mL含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞病變(CPE)，2～4 d收集細(xì)胞培養(yǎng)物。盲傳3代后進(jìn)行RT-PCR檢測，若出現(xiàn)CPE且PCR檢測結(jié)果為陽性，則將該細(xì)胞培養(yǎng)物繼續(xù)傳代3次，觀察CPE的穩(wěn)定性并進(jìn)行RT-PCR檢測，同時(shí)進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)對培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)物總RNA的提取及病毒核酸檢測 取細(xì)胞上清250 μL，參照RNAiso Plus說明書提取總RNA，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL)：RNA 模板1 μg、隨機(jī)引物(20 pmol/μL) 1 μL、dNTP(10 mmol/μL) 1 μL、5×Buffer 4 μL、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(200 U/μL) 0.5 μL、RNA酶抑制劑(40 U/μL) 0.5 μL，并用1‰的DEPC水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，得到的cDNA用于PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×ExTaqMaster Mix 25 μL、上下游引物(20 pmol/μL)各1 μL、cDNA模板5 μL，補(bǔ)加1‰的DEPC水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。以不加病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對照，以1‰ DEPC水的模板為空白對照。

1.5.2 IFA鑒定 在12孔板中用常規(guī)方法進(jìn)行IFA試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)束后每孔即刻加入100 μL DAPI染色液并室溫避光作用5 min進(jìn)行細(xì)胞核染色，PBS清洗，晾干后置于熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)設(shè)立PRRSV陽性對照組(HENZZ-8毒株)和陰性對照組(不加病毒)。

1.6PRRSV分離株生長曲線繪制

PRRSV分離株按MOI=0.01接種Marc-145細(xì)胞，在接種后每隔12 h(直至96 h)分別取樣進(jìn)行TCID50測定，繪制出各毒株生長曲線。同時(shí)設(shè)立PRRSV陽性對照組HENZZ-8。

1.7PRRSV分離株全基因組的分段擴(kuò)增、克隆及測序

用PRRSV全基因引物擴(kuò)增出分離株基因組的各片段，將這些片段的PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素篩選及PCR鑒定后，將陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.8PRRSV分離株全基因組的遺傳變異分析

用DNAStar軟件中的MegAlign對分離株的全基因進(jìn)行序列比對和相似性分析，利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法對分離株進(jìn)行全基因遺傳進(jìn)化分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用RDP 4.0進(jìn)行重組分析。

1.9PRRSV分離株NSP2及GP5氨基酸序列分析

用DNAStar軟件中的MegAlign對由NSP2和 ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.11株P(guān)RRSV流行株的分離與鑒定

經(jīng)病毒傳代及RT-PCR(圖1)和IFA(圖2)鑒定陽性后，成功分離出1株P(guān)RRSV毒株，命名為HENXC-4。初代培養(yǎng)60 h出現(xiàn)CPE，連續(xù)傳代3次后可出現(xiàn)穩(wěn)定且典型的CPE。

M.DL2000 DNA Marker； 1.陽性對照； 2.細(xì)胞培養(yǎng)物； 3.陰性對照； 4.空白對照圖1 細(xì)胞培養(yǎng)物的RT-PCR檢測結(jié)果

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)物的IFA鑒定結(jié)果(100×)

2.2PRRSV分離株在Marc-145細(xì)胞上的生長特性

分離株HENXC-4和對照株HENZZ-8接種后，定點(diǎn)收毒，測定TCID50，繪制特異性生長曲線(圖3)。在接種60 h內(nèi)，分離株HENXC-4和對照株HENZZ-8具有相似的生長趨勢，HENXC-4較HENZZ-8生長略為緩慢；但對照株HENZZ-8在60 h后有明顯的下降趨勢，而分離株HENXC-4未出現(xiàn)明顯的下降趨勢。2株毒株均能很好地適應(yīng)Marc-145細(xì)胞，病毒滴度最高能達(dá)到約107TCID50/mL。

圖3 PRRSV分離株生長曲線

2.3全基因組的遺傳變異特征

成功擴(kuò)增得到分離株HENXC-4各基因片段。經(jīng)DNAMAN軟件拼接獲得其全基因組序列，全長為15 023 bp，不包含Poly(A)。GenBank登錄號為KU950371。

2.3.1 全基因組核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性比較 由表2可見，分離株HENXC-4的核苷酸序列與歐洲型(Ⅰ型)代表毒株LV的相似性為62.0%，與美洲型(Ⅱ型)代表毒株VR-2332的相似性為85.3%，與國內(nèi)經(jīng)典毒株CH-1a的相似性為84.4%，與國內(nèi)HP-PRRSV JXA1的相似性為83.3%，而與美國NADC30毒株的相似性最高，為95.6%。重組分析結(jié)果表明，HENXC-4并未與其他毒株發(fā)生重組。

HENXC-4 與代表毒株NADC30、JXA1、CH-1a、VR-2332、LV的各段序列比對結(jié)果見表2和表3。HENXC-4的5′和3′非編碼區(qū)(UTR)核苷酸序列與其他5個(gè)代表毒株的相似性分別為52.7%～96.3%和70.2%～98.7%，且均與NADC30相應(yīng)片段的相似性最高。HENXC-4各編碼區(qū)氨基酸序列與NADC30、JXA1、CH-1a、VR-2332和LV的相似性分別為90.6%～100.0%、66.8%～96.4%、67.1%～96.0%、70.8%～100.0%和29.6%～81.2%。在13個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白中，NSP2是HENXC-4同其他代表毒株氨基酸相似性較低的蛋白質(zhì)，僅為29.6%～90.6%。HENXC-4的ORF2a—7區(qū)域的核苷酸序列與其他5個(gè)代表毒株的相似性為67.2%～96.2%，而在該區(qū)域編碼的8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中，HENXC-4的氨基酸序列與其他5個(gè)代表毒株的相似性為51.0%～97.7%，且ORF3～ORF5a是結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列比對中相似性較低的蛋白質(zhì)，僅為51.0%～96.6%，但與M蛋白的氨基酸序列相似性較高，為79.3%～97.7%。值得一提的是，除NSP1α外，HENXC-4各非結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列相似性均與NADC30最高。

表2 HENXC-4與PRRSV參考株核苷酸序列相似性 %

表3 HENXC-4與PRRSV參考株氨基酸序列相似性 %

2.3.2 分離株全基因組的遺傳進(jìn)化特征 由HENXC-4及28個(gè)參考株的全基因序列構(gòu)成的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，分離株HENXC-4屬于以NADC30為代表的亞群4，且與國內(nèi)優(yōu)勢流行毒株HP-PRRSV的代表株JXA1的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

▲為代表性參考毒株；■為分離株HENXC-4圖4 基于HENXC-4株全基因組核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析

2.4分離株NSP2和GP5氨基酸序列特征

NSP2的氨基酸序列分析結(jié)果顯示，HENXC-4與NADC30的相似性最高，為90.6%。序列比對結(jié)果表明，HENXC-4與NADC30有著一樣的缺失特征，即存在131個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失，這一缺失特征與國內(nèi)HP-PRRSV的缺失特征不同(圖5)。

GP5的氨基酸序列分析結(jié)果顯示，HENXC-4與NADC30的相似性最高，為93.5%。此外，序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同其他參考毒株相比，HENXC-4在GP5第58位有1個(gè)氨基酸的插入(圖6)，且這一插入特點(diǎn)在其他類NADC30毒株中未發(fā)現(xiàn)。

類NADC30株缺失部分用灰色陰影標(biāo)注；HP-PRRSV株缺失部分用黑色方框標(biāo)注圖5 分離株HENXC-4部分NSP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對分析結(jié)果

插入部分用灰色陰影標(biāo)注圖6 分離株HENXC-4 ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

PRRSV自從在我國發(fā)現(xiàn)以來，已歷經(jīng)20多年的流行及演變，但繼CH-1a之后的BJ-4、HB-1(sh)/2002和HB-2(sh)/2002等經(jīng)典型毒株并未引發(fā)較為嚴(yán)重的疫情[21-22]。HP-PRRS首先于2006年在我國江西省暴發(fā)，并迅速蔓延至全國大部分地區(qū)，其以高發(fā)病率和高死亡率為特征，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[23]。引發(fā)該病的病原HP-PRRSV也逐漸成為國內(nèi)PRRSV優(yōu)勢流行毒株。然而，自2012年以來，與美國NADC30毒株具有相同缺失特征的毒株在我國各地相繼被發(fā)現(xiàn)，并逐漸成為繼HP-PRRSV之后的又一田間優(yōu)勢流行毒株，且易與其他類型PRRSV毒株發(fā)生重組[10-15]。NADC30毒株最早在美國發(fā)現(xiàn)，近年來隨著國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)大規(guī)模引進(jìn)加系和美系種豬，類NADC30毒株相繼在國內(nèi)很多地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，提示類NADC30毒株可能與從美洲國家引進(jìn)種豬有關(guān)[13]。另外值得注意的是，現(xiàn)有的疫苗包括經(jīng)典疫苗(VR-2332和R98)和高致病性疫苗(JXA1-P80、HuN4-F112、GDr180和TJM-F92)，均不能有效地保護(hù)豬只免受類NADC30毒株的侵害[23-24]。因此，迫切需要對類NADC30毒株，尤其是未發(fā)生重組的類NADC30毒株的分子特征、遺傳進(jìn)化及致病性等方面進(jìn)行深入研究，為PRRS的防控及新疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本研究成功分離鑒定到1株P(guān)RRSV毒株HENXC-4。全基因序列比對分析結(jié)果顯示，HENXC-4與美國NADC30毒株的全基因核苷酸序列相似性最高，且除NSP1α外，HENXC-4各非結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列相似性均與NADC30最高，表明HENXC-4可能為1株類NADC30株。全基因遺傳進(jìn)化分析顯示，分離株HENXC-4屬于以NADC30為代表的亞群4，這一結(jié)果進(jìn)一步指示HENXC-4為1株類NADC30毒株。NSP2的氨基酸序列比對結(jié)果顯示，HENXC-4和NADC30均存在131個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失，這一結(jié)果再次證實(shí)HENXC-4為1株類NADC30株。在已報(bào)道的類NADC30分離株中，同其他類型毒株發(fā)生重組的毒株居多，而未發(fā)生重組的類NADC30分離株數(shù)量十分有限，這使得全面了解類NADC30毒株的研究受到限制。而本研究所分離到的PRRSV HENXC-4經(jīng)重組分析后發(fā)現(xiàn)，其未與其他PRRSV類型毒株發(fā)生重組，是1株與NADC30毒株相似性非常高的類NADC30毒株，為進(jìn)一步研究該類毒株提供了原材料，并為疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。此外，HENXC-4的GP5蛋白中第58位有1個(gè)氨基酸的插入，且這一插入特點(diǎn)在已報(bào)道的所有類NADC30毒株中均未發(fā)現(xiàn)。因此，如果后續(xù)用該毒株研發(fā)類NADC30疫苗，其在GP5蛋白中插入的氨基酸可作為一天然標(biāo)記，用于區(qū)分野毒株和疫苗株。

大部分已報(bào)道的類NADC30分離株，尤其是未與其他PRRSV發(fā)生重組的NADC30株，是由豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)培養(yǎng)分離所得，并不能很好地適應(yīng)Marc-145細(xì)胞。而本研究中，類NADC30株HENXC-4的分離并不依賴PAM，且可在Marc-145細(xì)胞上很好地增殖，不需要分離培養(yǎng)原代細(xì)胞PAM，省時(shí)省力、節(jié)約成本。

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Isolation,Identification and Sequence Analysis of a NADC30-like Strain of PRRSV

CUI Dandan,WANG Aojie,WANG Xingang,ZHOU Feng,PENG Zhifeng,WANG Chuanqing*

(College of Animal Husbandry and Veterinary Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

To investigate the molecular variation characteristics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) in the field,a PRRSV isolate(HENXC-4) was isolated by inoculating the PRRSV positive samples into the Marc-145 cell layers.The whole genome was then sequenced and analyzed.The sequence analysis showed that HENXC-4 was NADC30-like PRRSV without any recombination phenomenon characterized by a discontinuous 131-amino-acid deletion in the NSP2 region.More importantly,it had a 1-amino-acid insertion in GP5,which was absent in other NADC30-like PRRSV strains.

PRRSV; isolation and identification; NADC30-like strain; sequence analysis

2017-04-10

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)與支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(14IRTSHN015)

崔丹丹(1991-)，女，河南焦作人，在讀碩士研究生，研究方向:豬繁殖與呼吸綜合征病毒的流行、變異及致病性。 E-mail:13723171656@163.com

*通訊作者：王川慶(1954-)，男，河南濮陽人，教授，主要從事動(dòng)物傳染病發(fā)病機(jī)制及防制研究。E-mail:wchuanq@163.com

S852.65

： A

： 1004-3268(2017)09-0132-07