馬利剛，趙 樂(lè)，付小蝶，馮衛(wèi)生，匡海學(xué)，鄭曉珂*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

獨(dú)行菜法尼基焦磷酸合酶基因的克隆與原核表達(dá)

馬利剛1,2，趙 樂(lè)1,2，付小蝶1，馮衛(wèi)生1,2，匡海學(xué)3，鄭曉珂1,2*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

從獨(dú)行菜(Lepidiumapetalum)中克隆強(qiáng)心苷合成途徑的法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，為進(jìn)一步研究獨(dú)行菜強(qiáng)心苷的合成途徑提供參考。分析前期獲得的獨(dú)行菜幼苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選擇其中注釋為FPS且具有完整開(kāi)放閱讀框的序列，從獨(dú)行菜葉片cDNA中通過(guò)PCR克隆該序列，并進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，克隆得到獨(dú)行菜FPS基因的cDNA序列，GenBank登錄號(hào)KY366218，命名為L(zhǎng)aFPS。序列長(zhǎng)度為1 332 bp，含有1 161 bp的開(kāi)放閱讀框，推測(cè)編碼386個(gè)氨基酸。LaFPS蛋白可能不含跨膜結(jié)構(gòu)，定位于線(xiàn)粒體中，含有聚異戊二烯合成酶結(jié)構(gòu)域。LaFPS蛋白氨基酸序列與擬南芥(Arabidopsisthaliana)FPS1蛋白相似性高達(dá)92%，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，LaFPS與同為十字花科的擬南芥FPS1、遏藍(lán)菜(Noccaeacaerulescens)FPS1、高山南芥(Arabisalpina)FPS親緣關(guān)系最近。構(gòu)建的載體pET-32a-LaFPS可在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)。表明成功克隆了獨(dú)行菜FPS基因，并建立了其原核表達(dá)體系。

獨(dú)行菜； 法尼基焦磷酸合酶； 基因克隆； 序列分析； 原核表達(dá)

中藥葶藶子是獨(dú)行菜(Lepidiumapetalum)或播娘蒿(Descurainiasophia)的干燥成熟種子，具有瀉肺平喘、利水消腫的功效[1]。已從葶藶子中分離出強(qiáng)心苷、黃酮類(lèi)、類(lèi)萜等多種化學(xué)成分，其中強(qiáng)心苷類(lèi)成分可以顯著改善心血管功能[1]。有研究表明，葶藶苷(helveticoside)在北葶藶子[2]、南葶藶子[3]提取物中都是重要的活性成分。

強(qiáng)心苷類(lèi)的生物合成主要包括萜類(lèi)骨架合成、甾類(lèi)合成、強(qiáng)心苷合成等階段[4]。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS，EC2.5.1.10)是萜類(lèi)骨架合成的關(guān)鍵酶，可催化異戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)縮合形成法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)。兩分子C15骨架的FPP再由鯊烯合酶(squalene synthase，SQS)催化形成C30骨架的鯊烯(squalene)，而鯊烯是甾類(lèi)物質(zhì)合成的關(guān)鍵前體[5]。目前，已有多種植物的FPS基因被成功克隆，其中擬南芥[6-7]、黃花蒿[8-10]、雷公藤[11]、三七[12]、臘梅[13]、銀杏[14]等植物的FPS基因功能和表達(dá)調(diào)控已有初步研究。而關(guān)于獨(dú)行菜FPS基因的研究則未見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)獨(dú)行菜幼苗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)PCR克隆得到獨(dú)行菜FPS基因，并在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)了該蛋白質(zhì)，為后續(xù)研究獨(dú)行菜FPS基因在強(qiáng)心苷合成途徑中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 植物材料 獨(dú)行菜種子采自河南伏牛山，由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為獨(dú)行菜干燥成熟種子。將獨(dú)行菜種子播種于含有Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液的蛭石中，在植物培養(yǎng)箱中(23 ℃，每天16 h光照、8 h黑暗)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3 000 lx。培養(yǎng)60 d后，采集獨(dú)行菜幼嫩葉片，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 植物總RNA提取、質(zhì)粒提取、普通DNA產(chǎn)物純化、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。PrimeSTAR HS高保真酶、rTaq、pMD19-T載體、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。Protein Ladder購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。pET-32a載體由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2方法

1.2.1 葉片總RNA的提取及cDNA的合成 取100 mg獨(dú)行菜葉片，使用天根試劑盒提取總RNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。然后以質(zhì)量符合要求的總RNA為模板，oligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄合成得到獨(dú)行菜葉片cDNA，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 獨(dú)行菜FPS基因的克隆 從獨(dú)行菜幼苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選擇注釋為FPS的序列，設(shè)計(jì)克隆引物L(fēng)aFPS-F:5′-ATGGCAAAAGTTGTAAATAAGGT-3′，LaFPS-R:5′-GTTTGTTTCCCCTCAAAGC-3′。使用PrimeSTAR HS高保真酶從獨(dú)行菜葉片cDNA模板中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，54.7 ℃ 15 s，72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析確認(rèn)與預(yù)期大小一致后，將目的片段切膠純化連接到pMD19-T載體，熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans5α細(xì)胞。比較分析多個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果及轉(zhuǎn)錄組序列，確定其中序列正確的克隆，即為成功構(gòu)建的pMD19-T-LaFPS。

1.2.3 序列分析 對(duì)于正確克隆的測(cè)序結(jié)果，采用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找開(kāi)放閱讀框并獲得其編碼的蛋白質(zhì)序列，用于后續(xù)分析。使用NCBI blastp比對(duì)nr數(shù)據(jù)庫(kù)獲得與其序列相似的其他蛋白質(zhì)。使用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)、TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、NCBI CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)等在線(xiàn)工具分析該蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)。用MEGA 7軟件進(jìn)行序列比對(duì)，使用Phylogeny.fr軟件(http://www.phylogeny.fr/index.cgi)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 原核表達(dá) 根據(jù)LaFPS的ORF序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物：5′-CGGGATCCATGAGTGTGAGTTATTG-3′，5′-CCGCTCGAGCTACTTCTGCCTCTTGT-3′。以pMD19-T-LaFPS質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用BamH Ⅰ和XhoⅠ對(duì)擴(kuò)增片段和pET-32a載體分別進(jìn)行雙酶切，并純化。將LaFPS基因片段連接至pET-32a載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α細(xì)胞。對(duì)轉(zhuǎn)化菌斑培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，并送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確的克隆即為成功構(gòu)建的pET-32a-LaFPS。

將構(gòu)建的pET-32a-LaFPS質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，挑取單斑于LB/Amp液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。然后按照1∶100的比例稀釋到新鮮的LB/Amp液體培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)至A600為0.6時(shí)，加入IPTG至濃度為0.4 mmol/L，在28 ℃、160 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)8 h。取2 mL誘導(dǎo)菌液12 000 r/min離心1 min,收集菌體，加入20 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液、80 μL雙蒸水，重懸菌體后沸水浴15 min。12 000 r/min離心5 min后取20 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE(4%濃縮膠、12%分離膠)電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1獨(dú)行菜FPS基因的克隆

以獨(dú)行菜葉片cDNA為模板，采用引物L(fēng)aFPS-F和LaFPS-R成功擴(kuò)增出與預(yù)期大小(1 332 bp)一致的PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)果如圖1所示。將該片段連至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌斑培養(yǎng)后的菌液先使用載體通用引物進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的菌液送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，然后分析測(cè)序結(jié)果。

測(cè)序結(jié)果經(jīng)Snapgene軟件拼接后得到長(zhǎng)度為1 332 bp的序列，其中包含一個(gè)1 161 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼386個(gè)氨基酸。該蛋白質(zhì)與擬南芥FPS1蛋白的序列一致性達(dá)到92%。因此,將該基因命名為L(zhǎng)aFPS(GenBank登錄號(hào)KY366218)。

M：DL2000 DNA Marker； 1：PCR產(chǎn)物圖1 PCR擴(kuò)增LaFPS基因

2.2獨(dú)行菜FPS蛋白的序列分析

利用ProtParam tool預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為44.58 ku，等電點(diǎn)為6.10。不穩(wěn)定系數(shù)為40.07，屬于不穩(wěn)定蛋白。TargetP 1.1預(yù)測(cè)LaFPS蛋白定位于線(xiàn)粒體，含有長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。TMHMM預(yù)測(cè)LaFPS無(wú)跨膜區(qū)。CD-Search分析LaFPS蛋白，在84—345位發(fā)現(xiàn)聚異戊二烯合成酶結(jié)構(gòu)域(pfam00348，2.72e-99)。

在SWISS-MODEL服務(wù)器上以ArtemisiaspiciformisFPP/GFPP合酶(4kk2.1.A)為模板進(jìn)行La-FPS蛋白的三維建模，LaFPS與模板序列的一致性為74.78%，用于建模的氨基酸殘基范圍為模板48—386位(圖2)。

圖2 LaFPS三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

依據(jù)NCBI網(wǎng)站上通過(guò)blastp比對(duì)nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果，LaFPS蛋白與擬南芥(Arabidopsisthaliana)FPS1(NP_199588.1，AtFPS1)序列一致性較高，其他序列一致性較高的蛋白質(zhì)為甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.oleracea)FPS2(92%，XP_013618156.1，BoFPS2)、蘿卜(Raphanussativus)FPS2(92%，XP_018433596.1，RsFPS2)、蕪菁(Brassicarapa)FPS2(92%，XP_009128999.1，BrFPS2)、遏藍(lán)菜(Noccaeacaerulescens)FPS1(89%，JAU13831.1，NcFPS1)。使用MEGA 7軟件對(duì)以上各FPS蛋白的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，F(xiàn)PS蛋白序列中N端信號(hào)肽區(qū)域序列差異較大，其他區(qū)域序列高度保守(圖3)。

使用Phylogeny.fr軟件的“One Click”模式對(duì)多種不同植物的FPS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。分析結(jié)果表明，LaFPS與同為十字花科的擬南芥FPS1、遏藍(lán)菜FPS1、高山南芥(Arabisalpina)FPS親緣關(guān)系最近。

圖3 多種FPS蛋白的序列比對(duì)分析

圖4 LaFPS與其他植物FPS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3獨(dú)行菜FPS蛋白的原核表達(dá)

將PCR擴(kuò)增得到的LaFPS基因ORF片段連接至載體pET-32a，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致(圖5)。測(cè)序結(jié)果也表明，表達(dá)載體pET-32a-LaFPS構(gòu)建成功。

對(duì)含有pET-32a-LaFPS質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，當(dāng)大腸桿菌培養(yǎng)至A600為0.6時(shí)，于0.4 mmol/L IPTG、28 ℃、160 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)8 h，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，該條件下成功誘導(dǎo)表達(dá)出與預(yù)期大小64 ku(融合蛋白包含大小約20 ku的pET-32a標(biāo)簽)一致的蛋白質(zhì)，未誘導(dǎo)的對(duì)照樣品中沒(méi)有出現(xiàn)該蛋白條帶(圖6)。

M：DL10000 DNA Marker； 1：質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到的 pET-32a載體與LaFPS基因片段圖5 BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切鑒定pET-32a-LaFPS

M：Protein Ladder；1.含pET-32a-LaFPS的大腸桿菌未 誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)的總蛋白； 2.同樣的大腸桿菌于0.4 mmol/L IPTG、 28 ℃條件下誘導(dǎo)8 h表達(dá)的總蛋白。箭頭示目的蛋白條帶圖6 pET-32a-LaFPS的誘導(dǎo)表達(dá)

3 結(jié)論與討論

獨(dú)行菜植物體內(nèi)的強(qiáng)心苷類(lèi)物質(zhì)含量不高，阻礙了相關(guān)藥物的研究開(kāi)發(fā)。植物基因工程技術(shù)是提高藥用植物體內(nèi)天然產(chǎn)物含量的可行途徑，但是相關(guān)研究以目標(biāo)天然產(chǎn)物合成途徑的解析作為前提，而獨(dú)行菜強(qiáng)心苷的合成途徑目前并不清楚。獨(dú)行菜FPS是三萜和甾類(lèi)化合物合成途徑中的重要酶，其編碼基因的克隆和研究對(duì)于解析獨(dú)行菜強(qiáng)心苷類(lèi)物質(zhì)的合成途徑具有重要價(jià)值。通過(guò)對(duì)獨(dú)行菜強(qiáng)心苷合成途徑中FPS等關(guān)鍵酶編碼基因的研究，可以采用基因工程技術(shù)來(lái)提高這些基因在獨(dú)行菜體內(nèi)的表達(dá)水平，從而增加強(qiáng)心苷類(lèi)物質(zhì)的含量，為該類(lèi)藥物的開(kāi)發(fā)提供便利。

本研究通過(guò)PCR技術(shù)成功克隆得到LaFPS的全長(zhǎng)cDNA片段。序列分析表明，LaFPS蛋白與擬南芥FPS1和FPS2親緣關(guān)系較近，其中又與擬南芥FPS1序列更為接近。擬南芥FPS1基因編碼2種不同大小的FPS蛋白，F(xiàn)PS1L比FPS1S在N端多了40個(gè)氨基酸組成的線(xiàn)粒體信號(hào)肽，F(xiàn)PS1L定位于線(xiàn)粒體，F(xiàn)PS1S則定位于細(xì)胞質(zhì)[6-7]。TargetP分析結(jié)果表明，LaFPS蛋白可能同樣具有N端線(xiàn)粒體信號(hào)肽并定位于線(xiàn)粒體中，因而可能具有與擬南芥FPS1L類(lèi)似的功能。

LaFPS在大腸桿菌中的成功誘導(dǎo)表達(dá)，為后續(xù)通過(guò)體外催化試驗(yàn)鑒定該蛋白質(zhì)的功能奠定了基礎(chǔ)。擬南芥的FPS1與FPS2基因在種子發(fā)育過(guò)程中分別具有不同的功能，表達(dá)模式也不同[6]。在分析獨(dú)行菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)了另外1條FPS基因序列，但是其CDS不完整，后續(xù)將嘗試克隆其全長(zhǎng)cDNA序列，并比較研究這2個(gè)獨(dú)行菜FPS基因的表達(dá)模式，以闡明其在獨(dú)行菜強(qiáng)心苷合成途徑中的作用。

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Cloning and Prokaryotic Expression of Farnesyl Pyrophosphate Synthase Gene fromLepidiumapetalum

MA Ligang1,2,ZHAO Le1,2,FU Xiaodie1,FENG Weisheng1,2,KUANG Haixue3,ZHENG Xiaoke1,2*

(1.School of Pharmacy,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,China;2.Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province,Zhengzhou 450046,China; 3.College of Pharmacy,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

This study obtained the farnesyl pyrophosphate synthase gene involved in the cardiac glycosides biosynthesis fromLepidiumapetalum,analysed the sequence,and induced expression of the gene inE.coli,which provided new material for research of the biosynthetic pathway of cardiac glycoside inL.apetalum.Specific primers were designed for a gene fragment with complete ORF and annotated asFPSin the transcriptome data ofL.apetalum,and the fragment was cloned fromL.apetalumleaf cDNA template by PCR method.Then the sequence of cloned gene was analyzed.The cloned cDNA fragment ofLaFPS(GenBank accession No.KY366218) had an length of 1 332 bp,with an ORF of 1 161 bp encoding 386 amino acids.According to the sequence analysis result,LaFPS had no transmembrane helices,located in mitochondria,and had an polyprenyl synthetase domain.Sequence of LaFPS was 92% identical to that ofArabidopsisFPS1 protein.LaFPS was closest toArabidopsisFPS1,NoccaeacaerulescensFPS1,ArabisalpineFPS in the phylogeny tree analysis,and all the proteins were from the Brassicaceae family.Expression of LaFPS protein was successfully induced inE.colistrain BL21(DE3) with constructed expression vector pET-32a-LaFPS.LaFPSgene was cloned fromL.apetalum,and the prokaryotic expression system was established.

Lepidiumapetalum; farnesyl pyrophosphate synthase; gene cloning; sequence analysis; prokaryotic expression

2017-05-20

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展(973)計(jì)劃項(xiàng)目(2013CB531802)；河南中醫(yī)學(xué)院博士科研基金項(xiàng)目(BSJJ2011-18)

馬利剛(1983-)，男，湖北襄陽(yáng)人，講師，博士，主要從事藥用植物次生代謝途徑及調(diào)控研究。 E-mail:maligang@outlook.com

*通訊作者：鄭曉珂(1961-)，女，河南開(kāi)封人，教授，博士，主要從事中藥活性成分及作用機(jī)制研究。 E-mail:zhengxk.2006@163.com

S567

： A

： 1004-3268(2017)09-0092-06