趙麗君+張鳳杰+曲艷平+劉璐+李帥國+顧瑞婷+錢芮

摘 要：采用室內(nèi)培養(yǎng)方法，研究石油污染脅迫對苜蓿種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，石油脅迫延長了種子的發(fā)芽期，但對發(fā)芽率和發(fā)芽勢影響并不顯著，根長和芽長受石油污染抑制作用明顯，尤其是根長，在25 mg·L-1低濃度處理中表現(xiàn)出顯著的受害癥狀（P<0.01）；石油濃度為250 mg·L-1時(shí)，根長及芽長抑制作用明顯下降，并且對葉綠素含量無明顯影響。苜蓿的根和幼苗的過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量隨石油濃度的增加呈現(xiàn)相應(yīng)響應(yīng)，總體來看，根和幼苗中的POD，CAT活性及MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。

關(guān)鍵詞：石油污染；苜蓿；種子萌發(fā)；生理指標(biāo)

中圖分類號：S541+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.09.020

Abstract： The effects of oil pollution stress on germination of alfalfa seeds were studied by indoor culture method. The results showed that the germination period of alfalfa oil stress prolonged， but there were no significant influence on germination rate and germination potential of alfalfa seed. The root length and bud length were significantly inhibited by oil pollution， especially the root length， which showed significant symptoms of 25 mg·L-1 in low concentration （P<0.01）. When the oil concentration was 250 mg·L-1， the inhibition of root length and shoot length was significantly decreased， and there was no significant effect on chlorophyll content. Peroxidase of alfalfa root and bud （POD）， catalase （CAT） activity and malondialdehyde （MDA） content decreased with the increase of the oil concentration of the corresponding response. Overall， the POD， CAT activity and MDA content in roots and shoots showed the trend of the first high and the lower.

Key words： oil pollution； Medicago sativa； seed germination； physiological index

石油開采、存放和運(yùn)輸過程中因泄漏和廢棄物不合理排放造成的土壤石油污染已經(jīng)成為重要的環(huán)境問題之一。石油屬于混合物，主要包括烷烴、芳香烴，以及難降解的瀝青質(zhì)[1]，對許多植物組織器官有生物學(xué)毒性，特別是其中的一些芳香烴組分，不僅具有強(qiáng)烈的致癌、致畸和致突變毒性，還能通過食物鏈在動植物體內(nèi)生物富集和放大，對人體健康造成嚴(yán)重的威脅[2-4]。有研究表明，土壤中的石油烴的檢出深度主要在0～30 cm的土壤表層，引起土壤碳源大量增加，直接導(dǎo)致土壤中C與N比例失調(diào)以及酸堿度的變化，破壞了土壤結(jié)構(gòu)，影響土壤的疏松程度和通氣狀況[5-9]。土壤是植物生長的主要基質(zhì)環(huán)境，土壤石油污染對植物造成直接的威脅和傷害。研究發(fā)現(xiàn)，輕度石油污染會引起某些植物種子萌發(fā)率下降、生長發(fā)育遲緩、生物量下降，重度污染則會導(dǎo)致植物死亡，從而引起生態(tài)系統(tǒng)嚴(yán)重退化[10-12] 。

目前，世界石油年產(chǎn)總量已達(dá)2.2×1012 kg，每年約有8×109 kg石油污染物進(jìn)入環(huán)境，在我國每年的新增污染土壤也有近1.0×108 kg [13]。在天然草原和農(nóng)田區(qū)域因石油開采造成的土壤石油污染也十分嚴(yán)重。能夠耐受石油污染的草本植物將是土壤植物修復(fù)技術(shù)的首選，尤其能改良土壤的豆科植物對石油污染耐受性問題備受關(guān)注。

本研究采用模擬石油污染脅迫的室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，系統(tǒng)分析豆科植物苜蓿種子萌發(fā)對石油污染脅迫的響應(yīng)，初步探索紫花苜蓿對石油污染的耐受性，旨在為石油污染土壤的生物修復(fù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試苜蓿為紫花苜蓿（Medicago sativa L.），為豆科多年生草本植物，是世界各國廣泛栽培的綠肥，購自大連某草業(yè)公司；供試模擬石油污染物為柴油，購自大連開發(fā)區(qū)某加油站；試驗(yàn)所需試劑均為分析純，為天津科密歐試劑公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

石油濃度分別為0，25，50，100，250，500 mg·L-1，每處理6個(gè)重復(fù)。參照OECD方法[11]進(jìn)行種子發(fā)芽及根伸長試驗(yàn)，將苜蓿種子用2% H2O2浸泡15 min后，用蒸餾水反復(fù)沖洗，在培養(yǎng)皿內(nèi)用蒸餾水浸泡0.5 h，用鑷子將浸泡好的種子腹溝朝下，均勻擺在發(fā)芽床上，每皿40粒，將培養(yǎng)皿隨機(jī)均勻放在光照培養(yǎng)箱內(nèi)，（25±1） ℃，光照強(qiáng)度為400 μmol·（m-2·s-1），光照周期12 h/12 h（光/暗），相對濕度75%左右。

1.3 測定指標(biāo)及方法endprint

每天觀察并記錄發(fā)芽情況，試驗(yàn)進(jìn)行第3天計(jì)算發(fā)芽勢，第5天發(fā)芽結(jié)束計(jì)算發(fā)芽率，隨機(jī)取出20棵幼芽，測量根和芽長度及其鮮質(zhì)量；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性；采用紫外分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性；采用2-硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示各指標(biāo)大小；采用LSD法及SPSS檢驗(yàn)差異顯著性和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油污染對苜蓿種子發(fā)芽生長及其相對生長量的影響

石油脅迫對苜蓿發(fā)芽率及發(fā)芽勢、根長和芽長的影響結(jié)果如表1所示。由表1可知，石油污染濃度對發(fā)芽率和發(fā)芽勢影響不顯著，但苜蓿種子延遲1 d發(fā)芽；石油污染濃度對苜蓿根長及芽長的影響差異顯著（P<0.01），在50～500 mg·L-1范圍內(nèi)，根長和芽長呈現(xiàn)波動性抑制趨勢，100 mg·L-1時(shí)對根長和芽長的影響最大，抑制率分別為45.7%和59.5%，說明石油濃度在100 mg·L-1時(shí)對苜蓿的根長和芽長生長具有更明顯的抑制作用。

由圖1可知，石油質(zhì)量濃度在25 mg·L-1時(shí)，對苜蓿的根和幼苗單株生物量具有抑制作用，其他濃度影響并不大，說明紫花苜蓿對于石油污染脅迫具有良好的抗逆性[14]。

2.2 苜蓿幼苗和根中MDA含量變化及對污染脅迫的敏感性

MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物之一，表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。從圖2可以看出，0～ 25 mg·L-1范圍內(nèi)，苜蓿根中MDA含量急劇增加，根和幼苗明顯出現(xiàn)黃化現(xiàn)象；隨著石油污染濃度的增大，根中丙二醛含量增加緩慢，呈現(xiàn)上升趨勢；25 mg·L-1的低濃度時(shí)，根和幼苗中丙二醛含量最高，且對根的影響極其顯著。從表3可以看出，根對石油污染反應(yīng)更加敏感，且與根和幼苗鮮質(zhì)量及根芽長度呈負(fù)相關(guān)，根中MDA含量與其根鮮質(zhì)量呈顯著負(fù)相關(guān)，幼苗中MDA含量與其生長指標(biāo)相關(guān)性較差?？梢?，苜蓿根的生長指標(biāo)受到石油污染脅迫的影響大于苜蓿的幼苗。

2.3 石油污染脅迫下苜蓿根和幼苗中酶活性與生物量的關(guān)系

過氧化物酶、過氧化氫酶是植物體內(nèi)重要的催化酶。從表2可以看出，石油污染對苜蓿幼苗中的POD，CAT活性具有一定的刺激作用，在低濃度25 mg·L-1和高濃度500 mg·L-1極顯著，濃度為100～250 mg·L-1時(shí)與較低或較高濃度相比對酶活性影響較小（圖3）。同時(shí)從表3還可以看出，根中POD，CAT活性與其鮮質(zhì)量具有明顯負(fù)相關(guān)性，根中POD活性及幼苗中CAT活性與其鮮質(zhì)量具有極其顯著的相關(guān)性（P<0.01），幼苗中CAT活性與根鮮質(zhì)量、幼苗中POD活性與幼苗鮮質(zhì)量以及CAT活性與呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，石油污染延遲了苜蓿種子的萌發(fā)時(shí)間，對根和幼苗的長度影響較大（P<0.01）；但對發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根芽鮮質(zhì)量的影響不明顯。在石油質(zhì)量濃度為25 mg·L-1時(shí)幼苗受影響效果顯著（P<0.05），MDA含量是對照組3.1倍，根比幼苗對石油污染脅迫響應(yīng)更為敏感。在石油質(zhì)量濃度50～500 mg·L-1時(shí)，隨著脂膜過氧化程度增加，在MDA含量增加的同時(shí)POD及CAT活性明顯增加，消除了對脂膜的毒害作用，且MDA含量及POD，CAT活性與根苗鮮質(zhì)量呈顯著負(fù)相關(guān)。在石油污染脅迫的條件下，植株生物量的大小反映其抗逆性的強(qiáng)弱，相對生物量越大抗逆境能力愈強(qiáng)[14-15]。苜蓿的單株生物量在一定污染濃度范圍內(nèi)并未受到抑制。因此，紫花苜蓿在25～500 mg·L-1污染濃度范圍內(nèi)對石油污染土壤具有一定的耐受能力，具有修復(fù)石油污染土壤的潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1]ZHANG Z N， ZHOU Q X， PENG S W， et al. Remediation of petroleum contaminated soils by joint action of Pharbitis nill and its microbial community[J]. Science of the total environment， 2010， 408（22）： 5600-5605.

[2]彭勝巍， 周啟星， 張浩， 等. 8種花卉植物種子萌發(fā)對石油烴污染土壤的響應(yīng)[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 29 （4）： 786-790.

[3]李希銘， 宋桂龍.鎘脅迫對紫花苜蓿鎘吸收特征及根系形態(tài)影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 25（2）： 178-186.

[4]時(shí)騰飛， 劉增文， 田楠， 等. 黃土區(qū)石油污染對土壤及豆科灌草植物的潛在影響[J].草地學(xué)報(bào)， 2013， 21（2）： 295-301.

[5]郭超， 黃廷林， 唐智新， 等. 西北黃土地區(qū)現(xiàn)場石油污染土壤生物修復(fù)研究[J]. 環(huán)境污染與防治， 2011， 33（10）： 5-8.

[6]雒曉芳， 陳麗華， 楊成波， 等. 植物-微生物聯(lián)合修復(fù)石油污染土壤的實(shí)驗(yàn)室模擬[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2015， 51（3）： 411-417.

[7]王亞男， 程立娟， 周啟星. 萱草修復(fù)石油烴污染土壤的根際機(jī)制和根系代謝組學(xué)分析[J]. 環(huán)境科學(xué)， 2016， 37（5）： 1978-1985.

[8]GRAJ W， LISIECKI P， SZULC A， et al. Bioaugmentation with Petroleum-Degrading Consortia Has a Selective Growth-Promoting Impact on Crop Plants Germinated in Diesel Oil-Contaminated Soil[J]. Water， air & soil pollution， 2013， 224（9）： 1676.

[9]王傳遠(yuǎn)， 楊翠云， 孫志高， 等. 黃河三角洲生態(tài)區(qū)土壤石油污染及其與理化性質(zhì)的關(guān)系[J]. 水土保持學(xué)報(bào)， 2010， 24（2）： 214-217.

[10]岳冰冰， 李鑫， 任芳菲， 等. 石油污染對紫花苜蓿部分生理指標(biāo)的影響[J]. 草業(yè)科學(xué)， 2011， 28（2）： 236-240.

[11]彭昆國， 楊麗珍， 榮亮， 等. 土壤石油污染對植物種子萌發(fā)和幼芽生長的響應(yīng)[J]. 環(huán)境污染與防治， 2012， 34（7）： 19-23.

[12]藺昕， 李培軍， 臺培東， 等. 石油污染土壤植物-微生物修復(fù)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2006， 25（1）： 93-100.

[13]LIN Q X， MENDELSSOHN I A， SUIDAN， M T， et al. The dose-response relationship between No. 2 fuel oil and the growth of the salt marsh grass， Spartina alterniflora[J]. Marine pollut bulletin， 2002， 44（9）： 897-902.

[14]沈偉航， 朱能武， 商儒， 等. 石油污染土壤微生物修復(fù)過程中植物毒性變化規(guī)律[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 36（1）： 232-242.

[15]代惠， 趙樺， 曹婷， 等. Zn2+脅迫對4種紫花苜蓿光合的影響色素的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 23（3）： 128-132.endprint