陳燕文，李玉娟，宋夢(mèng)璐，崔耀天，許方雪，李佳，胡晶紅*，張永清*

?

PMP柱前衍生化-HPLC法分析瑪咖多糖的單糖組成

陳燕文1,2，李玉娟1,2，宋夢(mèng)璐1，崔耀天1，許方雪1，李佳1,2，胡晶紅1,2*，張永清1,2*

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東濟(jì)南 2503552； 2. 山東省中藥材良種選育工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250355）

應(yīng)用水提醇沉法獲得瑪咖多糖，苯酚-硫酸法測(cè)定瑪咖多糖含量，PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生法對(duì)酸水解的瑪咖多糖衍生化，HPLC法分析其單糖組成。結(jié)果表明，PMP柱前衍生化-HPLC法精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在1.50～650.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)各單糖的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 1，加樣回收實(shí)驗(yàn)各單糖的回收率均在98.83%～102.82% 之間，確定瑪咖多糖的單糖組成及摩爾比為(D-甘露糖)：(葡萄糖)：（D-半乳糖）：（阿拉伯糖）=1:196:6:6。該方法分析瑪咖多糖單糖組成簡(jiǎn)單易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

瑪咖；多糖；單糖組成；PMP柱前衍生化；高效液相色譜法

瑪咖（）為十字花科獨(dú)行菜屬植物瑪咖的塊狀根莖[1]，原產(chǎn)于南美安第斯山區(qū)秘魯境內(nèi)，現(xiàn)在北美洲、歐洲和東亞地區(qū)均有種植?，斂橐环N“藥食同源”類植物具有悠久的應(yīng)用歷史，素有“南美人參”之稱，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質(zhì)、生物堿、多糖、芥子油苷、類固醇、氨基酸、脂肪酸、纖維素、碳水化合物及礦物元素，此外還獨(dú)有瑪咖烯、瑪咖酰胺等成分[2-4]。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，瑪咖具有增強(qiáng)生育能力、改善性功能、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、抗焦慮、抗應(yīng)激及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功能[5-7]?，斂Ф嗵鞘乾斂в行С煞种凶钬S富的一種，約占其有效成分總量的46.63%[8]。多糖是生物體內(nèi)非常重要的一類有機(jī)化合物，除參與生物體的構(gòu)造，作為能源物質(zhì)、細(xì)胞識(shí)別的信息分子外，還參與體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化代謝生成為生物體必須的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等。此外，藥理研究表明多糖還具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等[9-11]功效。然而目前對(duì)多糖的研究卻十分有限，主要原因?yàn)槎嗵欠N類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，異構(gòu)體多樣，且存在微觀不均一性。為了的充分開發(fā)利用瑪咖多糖，本文在已有文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上[12-13]，首次應(yīng)用PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化-HPLC法對(duì)提取精制所得瑪咖多糖的單糖組成進(jìn)行分析，以期獲得一個(gè)穩(wěn)定的測(cè)定瑪咖多糖中單糖組成的方法，為瑪咖保健品、藥品、化妝品的開發(fā)、申報(bào)提供可靠的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，2998 PDA 檢測(cè)器（美國(guó)沃特世公司）；UV5100B型紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；5810R臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份有限公司）；德國(guó)ALPHA1-4 LD plus冷凍干燥機(jī)（上海匯分電子科技有限公司）；GFL-230型恒溫干燥箱（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；LD-Y500A高速萬能粉碎機(jī)（上海丁帥電熱有限公司）；CP225D型十萬分之一電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 藥材與試劑

瑪咖于2016年8月購自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為十字花科植物瑪咖的干燥塊根；葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品、PMP購自上海麥克林生化科技有限公司，均為分析純，純度大于等于98%；乙腈為色譜純；甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、三氟乙酸、氯仿、濃鹽酸、濃硫酸、苯酚、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉均為分析純；去離子水為自制。

2 方法

2.1 多糖的提取與純化

取干燥瑪咖，粉碎，過40目篩，準(zhǔn)確稱取100.0 g依次與20倍量的丙酮、乙醇進(jìn)行水浴回流提取，每次2 h，除去其低極性脂溶性成分，過濾。濾渣加入20倍量的蒸餾水，于80 ℃水浴回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液濃縮至一定程度，加入無水乙醇使醇濃度達(dá)80%（v/v），4 ℃條件下靜置過夜，沉淀析出多糖，多糖用乙醇、丙酮各洗滌3次，收集沉淀，干燥得瑪咖粗多糖。取瑪咖粗多糖用10倍量的蒸餾水溶解，按瑪咖粗多糖100:1（m/m）的比例加入木果蛋白酶，于50 ℃條件下水浴酶解2.5 h，8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，應(yīng)用Sevage法萃取多次除蛋白質(zhì)，至水相和氯仿相之間不再出現(xiàn)白色絮狀物。棄氯仿相，水相加入適量體積分?jǐn)?shù)為20%的H2O2室溫條件下脫色過夜，再次加入乙醇至醇濃度達(dá)80%（v/v），4 ℃條件下靜置過夜，抽濾，收集多糖沉淀，沉淀分別用丙酮和石油醚洗滌3次，冷凍干燥，得瑪咖多糖，備用。

2.2 瑪咖多糖的含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于100 mL容量瓶，溶解稀釋至刻度線，配制成濃度為0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入蒸餾水至2 mL后，分別加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，于50 ℃下水浴反應(yīng)15 min，以蒸餾水做空白對(duì)照，進(jìn)行光譜掃描，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

2.2.2 瑪咖多糖樣品含量的測(cè)定

精密稱取一定量的2.1下的瑪咖多糖10 mg，置于100 mL容量瓶中，按照2.2.1下方法進(jìn)行測(cè)定，代入線性回歸方程，平行3次試驗(yàn)，計(jì)算得到樣品純度。

2.3 PMP柱前衍生化-HPLC法檢測(cè)瑪咖多糖的單糖組成

2.3.1 HPLC色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；流動(dòng)相：0.5%磷酸鹽（KH2PO4-NaOH，pH= 6.8），緩沖液：乙腈，體積比77 : 23，等度洗脫。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)液（D-甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液濃度均為1 mg/mL）與100 μL的0.6 mol/L的氫氧化鈉溶液混勻后，精密吸取50 μL的混合液與50 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液均勻混合，于70℃烘箱中反應(yīng)120 min，取出，冷卻至室溫，加入50 μL的0.3 mol/L的鹽酸中和過量的氫氧化鈉至pH=7，加水稀釋至1 mL，再加入等體積的氯仿溶液，充分渦旋，4 000 r/min離心10 min棄氯仿層，萃取3次，加水定容至2 mL，過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)行HPLC分析。

2.3.3 供試品的制備

準(zhǔn)確稱取瑪咖粗多糖30 mg置于安瓿瓶中，加入4 mol/L的三氟乙酸溶液5 mL，混勻、封口，放入烘箱中于120 ℃條件下水解4 h，冷卻至室溫，向其加入5 mL甲醇，氮?dú)獯蹈桑貜?fù)3~4次以除去多余的三氟乙酸，然后用0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，定容至10 mL容量瓶中，得瑪咖多糖水解液。水解液按照2.3.2項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化操作。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

分別配制系列濃度的各單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照2.3.2項(xiàng)下操作衍生化，進(jìn)樣進(jìn)行HPLC分析，以峰面積和單糖濃度計(jì)算各單糖組分的線性回歸方程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。各單糖在濃度為1.50～650.00 μg/mL的回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.999 1，說明在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各單糖線性方程和線性范圍

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取2.3.2中的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算HPLC圖譜中各單糖對(duì)應(yīng)色譜峰面積，得到對(duì)照品的日內(nèi)精密度。連續(xù)測(cè)定5 d相同條件下的日間峰面積精密度，結(jié)果顯示，各單糖的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.06%～2.27%。日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.31%～2.65%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取2.3.3中的供試品溶液20 μL，依次在衍生化反應(yīng)后0、3、6、9、12、15 h進(jìn)樣，通過HPLC測(cè)定供試品的峰面積，計(jì)算得到各單糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.54%～1.98%。說明各單糖的衍生物在15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將供試品按照上述2.3.3方法平行實(shí)驗(yàn)6次，分別進(jìn)行HPLC測(cè)定，確定6份供試品溶液峰面積，計(jì)算得到各單糖衍生物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.98%～1.41%之間，進(jìn)行比較得出相似度可達(dá)99%以上，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取6份瑪咖多糖樣品，按照2.3.3項(xiàng)下操作進(jìn)行水解，然后加入相應(yīng)量的各單糖標(biāo)準(zhǔn)品，再按2.3.2項(xiàng)下操作方法衍生化后進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，測(cè)得數(shù)據(jù)代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品中的單糖進(jìn)行計(jì)算，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3 結(jié) 果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及樣品含量測(cè)定

根據(jù)2.2.1項(xiàng)下操作，測(cè)得各濃度下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，以吸光度和濃度為參數(shù)計(jì)算得到線性回歸方程：=47.96+0.0021，R=0.9983（在0.002 5～0.012 5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，見圖1）。根據(jù)2.2.2項(xiàng)下操作測(cè)定瑪咖多糖純度，3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果依次為82.8%、85.7%和86.2%。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均大于80%，平均純度為84.9%，說明本實(shí)驗(yàn)提取純化瑪咖多糖的方法是可靠的。

3.2 HPLC法測(cè)定瑪咖多糖的單糖組成

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖的HPLC色譜圖

根據(jù)2.3.2項(xiàng)下操作，將混合單糖的衍生化標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.2 瑪咖多糖水解后衍生化產(chǎn)物的HPLC分析色譜圖

根據(jù)2.3.3項(xiàng)下操作，多次實(shí)驗(yàn)提取純化所得的瑪咖多糖進(jìn)行PMP柱前衍生化-HPLC分析，瑪咖多糖的單糖組成結(jié)果見圖3。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)單糖的HPLC色譜圖

1 PMP； 2 D-甘露糖； 3 葡萄糖； 4 D-半乳糖； 5 阿拉伯糖

1 PMP； 2 D-甘露糖； 3 葡萄糖； 4 D-半乳糖； 5 阿拉伯糖； a 、b為未知成分

根據(jù)混標(biāo)單糖的峰面積與濃度的關(guān)系，引入響應(yīng)因子的概念，將D-半乳糖的響應(yīng)因子設(shè)為1，計(jì)算其他單糖的響應(yīng)因子。確定D-甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖的響應(yīng)因子如表3所示。

表3 HPLC各單糖衍生物保留時(shí)間和響應(yīng)因子

由各單糖衍生物的HPLC色譜圖中測(cè)得的峰面積和各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)因子計(jì)算得到瑪咖多糖衍生物的各成分相對(duì)摩爾比，依次為（D-甘露糖）∶（葡萄糖）∶（D-半乳糖）∶（阿拉伯糖）=1∶196∶6∶6。由此可知，PMP柱前衍生化-HPLC法測(cè)定瑪咖多糖是以葡萄糖為主的雜多糖。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法對(duì)瑪咖多糖進(jìn)行提取，應(yīng)用木瓜蛋白酶和Savage法聯(lián)合除蛋白，過氧化氫脫色，丙酮和石油醚洗滌除脂溶性雜質(zhì)，結(jié)果得到純度大于80%的瑪咖多糖。應(yīng)用三氟乙酸水解瑪咖多糖，PMP柱前衍生化-HPLC法對(duì)瑪咖多糖的單糖組成進(jìn)行分析。方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出PMP柱前衍生化-HPLC法分析瑪咖多糖中單糖組成穩(wěn)定、可靠。其中，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在1.50～650.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)各單糖的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 1，加樣回收實(shí)驗(yàn)中各單糖的回收率均在98.83%～102.82%之間。在對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)單糖的選擇過程中考慮到D、L構(gòu)型單糖的差異僅在于兩者的旋光性不同，在HPLC分析時(shí)兩者保留時(shí)間并沒有差異，故沒有選擇所有已知構(gòu)型的單糖。對(duì)瑪咖多糖單糖組成分析得出瑪咖多糖主要是以葡萄為主的雜多糖，其單糖組成及摩爾比為(D-甘露糖) ∶(葡萄糖)：（D-半乳糖）：（阿拉伯糖）=1∶196∶6∶6。

對(duì)瑪咖多糖的單糖組成已有多人進(jìn)行研究報(bào)道。柳志宇[12]通過HPLC法應(yīng)用示差折光檢測(cè)器對(duì)麗江產(chǎn)不同品種瑪咖的多糖組成進(jìn)行分析，得出不同品種的瑪咖多糖單糖組成不同。該研究為直接對(duì)水解后的瑪咖多糖進(jìn)行分析，由于糖類是一種多羥基化合物，水解后的單糖分子間很容易形成分子內(nèi)氫鍵，極性較大，增加了各種單糖間的分離難度，影響多糖中單糖組成的定性、定量。王金全[13]通過離子交換樹脂和葡聚糖凝膠純化瑪咖多糖，乙酰基化法對(duì)各種單糖進(jìn)行衍生化，然后通過氣相色譜法，以肌醇為內(nèi)標(biāo)物采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行瑪咖多糖的單糖組成的分析與測(cè)定，確定其主要含有鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和一未知組成。但此方法乙?；^程操作繁瑣，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，溫度高，需要醋酸酐、吡啶等易爆、高毒性試劑，限制了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步推廣，另外GC分析法還存在揮發(fā)性限制的問題[14]。本研究首次采用PMP柱前衍生化-HPLC法對(duì)瑪咖多糖進(jìn)行分析，PMP衍生化相對(duì)于乙?；^程，衍生化進(jìn)行完全，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短；采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)瑪咖多糖單糖組成進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)于示差折光檢測(cè)器，此檢測(cè)器具有靈敏度高、檢測(cè)線低等優(yōu)點(diǎn)。綜上所述，PMP柱前衍生化-HPLC法分析瑪咖多糖中單糖的組成操作簡(jiǎn)單易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠，值得推廣。

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Analysis on Monosaccharide Composition of Maca Polysaccharide by PMP Pre-column Derivatization-HPLC

1,2,1,1,1,1,1,2,1,2,1,2

(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Shandong Jinan 250355, China; 2. Research Center of Breeding Technology of Chinese Medicinal Materials in Shandong Province, Shandong Jinan 250355, China )

To study the composition of maca polysaccharides by PMP (1-phenyl-3-methyl-5- pyrazolone) pre-column derivatization and HPLC, maca polysaccharides were extracted by the method of water extraction and alcohol precipitation and measured by phenol-sulfuric acid method, derivatization of acid-hydrolyzed maca polysaccharide was carried out by pre-column derivatization of PMP, and its monosaccharides composition was analyzed by HPLC method. The relative standard deviations of precision test, stability test and reproducibility test were less than 3%, the correlation coefficient of each monosaccharide in the concentration range of 1.50～650.00 μg/mL was more than 0.999 1, and the recoveries of the monosaccharides were between 98.83%～102.82%. The composition and proportion of monosaccharide of maca polysaccharide were(D-mannose):(glucose):(D-galactose):(arabinose)= 1: 196: 6: 6. The PMP pre-column derivatization-HPLC method is simple and easy to determine the composition of the monosaccharides of maca.

Maca; Polysaccharide; Monosaccharide composition; PMP pre-column derivatization; HPLC

O 657

A

1671-0460（2017）08-1513-04

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GSF119004)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“山東道地藥材資源質(zhì)量控制科技平臺(tái)建設(shè)”課題（2008GG2NS02022）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系中草藥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(2015)；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J15LM55)。

2017-06-14

陳燕文（1990-），男，山東菏澤人，碩士研究生在讀，研究方向：中藥資源及質(zhì)量控制研究。E-mail：18765804058@126.com。

胡晶紅（1974-），女，山東濟(jì)南人，博士，講師，研究方向：中藥資源及其質(zhì)量控制研究。E-mail：hujinghong97@126.com。張永清（1962-），男，山東平邑人，博士，教授，研究方向：中藥資源及其質(zhì)量控制研究。E-mail：zyq622003@126.com。