楊 歌，惠 穎，趙 翠，田夢涵，任媛媛，黃占景，葛榮朝

(1. 河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊 050024；2. 石藥集團 中奇制藥技術(shù)有限公司，河北 石家莊 050035)

利用酵母單雜交篩選擬南芥AtSTK基因表達調(diào)控蛋白的研究

楊 歌1，惠 穎2，趙 翠1，田夢涵1，任媛媛1，黃占景1，葛榮朝1

(1. 河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊 050024；2. 石藥集團 中奇制藥技術(shù)有限公司，河北 石家莊 050035)

擬南芥絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因AtSTK的過量表達可以明顯提高擬南芥的耐鹽性。為進一步研究AtSTK基因表達的調(diào)控機制，以擬南芥基因組DNA為模板設(shè)計引物，擴增獲得AtSTK基因的啟動子序列，并構(gòu)建到報告載體pAbAi，將重組報告載體質(zhì)粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ進行單酶切線性化，轉(zhuǎn)化酵母菌株Y1H Gold，線性化的pAbAi-HYT整合到基因組中。然后，將純化的擬南芥雙鏈cDNA、pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化含有報告載體pAbAi-HYT的酵母菌，將菌液涂布到含有100 ng/mL AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上進行陽性克隆的酵母單雜交篩選。通過回復鑒定、序列測定，最終篩選獲得了可能參與AtSTK基因表達調(diào)控的4個擬南芥基因。測序結(jié)果表明，酵母單雜交篩選獲得的擬南芥基因AT3G32090含有WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域，為WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的一員。因此，AtSTK基因的表達很可能接受MAPK信號傳導途徑中AT3G32090基因編碼的WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，從而影響擬南芥植株的耐鹽性。

AtSTK；啟動子；表達調(diào)控蛋白；酵母單雜交

目前土地的鹽漬化程度在不斷加重，鹽脅迫主要是通過滲透脅迫、離子傷害等過程損傷植物，最顯著的效應(yīng)就是抑制植株生長[1-3]。所以土地的鹽漬化嚴重影響了生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，導致了糧食和經(jīng)濟作物減產(chǎn)。除了通過改良土壤減少鹽堿地之外，我們還可以利用基因工程的手段，通過分子生物學方法，培育出高產(chǎn)耐鹽的作物品種來達到改造和利用鹽堿地的目的。目前國內(nèi)外的學者對植物耐鹽機制及耐鹽相關(guān)基因等方面都進行了大量的研究，在各個研究領(lǐng)域均取得了長足的進展。

植物體在受到鹽脅迫的情況下，會激活或啟動體內(nèi)一系列的生物化學反應(yīng)，從而對植物的生理變化進行調(diào)節(jié)，以保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)。植物在鹽脅迫下，會通過信號的信息傳導來保持細胞和整個植株的離子平衡，或是通過激活或抑制一些轉(zhuǎn)錄因子的表達來對下游應(yīng)答基因進行調(diào)控。在真核生物中，MAPK級聯(lián)途徑是由一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶參與的信號傳導途徑[4-7]。此類蛋白激酶在多種信號傳遞中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在植物體中MAPK信號途徑參與干旱、高鹽、低溫等多種脅迫反應(yīng)的信號傳遞[8-10]。AtMEKK1基因是從擬南芥中分離出的MAPK基因，它參與高鹽脅迫的信號傳導[11-13]。AtMKK2基因受鹽脅迫、冷害和MKK1特異激活，可以與下游的MPK4和MPK6直接作用，誘導下游一系列高鹽脅迫相關(guān)基因的表達[14]。

到目前為止，利用酵母單雜交技術(shù)已經(jīng)識別并鑒定出了許多與目的DNA片段相結(jié)合的蛋白質(zhì)。2015年，Deokar等[15]利用酵母單雜技術(shù)篩選出了與鷹嘴豆非生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CarERF116。Wang等[16]應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)，從玉米中分離獲得了bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子ABP9。Yu等[17]利用酵母單雜交方法確定了野大豆堿脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GsERF71。利用酵母單雜交系統(tǒng)尋找與特定順式元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因，與植物調(diào)控逆境脅迫和生長發(fā)育的研究相結(jié)合來挖掘與植物抗逆有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子成為當前研究的重點。

AtSTK基因是前期研究發(fā)現(xiàn)的一個與擬南芥耐鹽性密切相關(guān)的蛋白激酶基因，其過量表達可以明顯提高擬南芥的耐鹽性[18]。通過對其啟動子系列缺失和鹽脅迫誘導研究，確定了該啟動子的鹽誘導敏感元件。本研究利用AtSTK基因啟動子序列作為誘餌構(gòu)建載體，利用酵母單雜交技術(shù)來篩選能夠作用于該啟動子的轉(zhuǎn)錄因子基因，以探明影響AtSTK基因表達的調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 構(gòu)建報告載體

根據(jù)啟動子序列設(shè)計引物：Hybc：5′-CGAGCTCCGGAAAATCAACAAAACCC-3′，Hyxb：5′-CCTCGAGTAAGCTTCTCACGATCTTCTTC-3′，以含有AtSTK基因啟動子的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，對產(chǎn)物加A后連接到pMD18-T載體，利用SacⅠ、XhoⅠ雙酶切，將啟動子片段連接到pAbAi載體，獲得報告載體(pAbAi-HYT)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌保存。

1.2 酵母單雜交cDNA文庫構(gòu)建與篩選

提取擬南芥幼苗總RNA，采用SMART技術(shù)合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNaseH處理后，進行LD-PCR擴增雙鏈cDNA，反應(yīng)循環(huán)數(shù)定為22個循環(huán)。對雙鏈cDNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用CHROMA SPIN+TE-400 Column純化雙鏈cDNA。

從大腸桿菌提取構(gòu)建好的重組報告載體質(zhì)粒pAbAi-HYT，利用BstbⅠ進行單酶切線性化，轉(zhuǎn)化酵母菌株Y1H Gold，線性化的pAbAi-HYT整合到基因組中。然后，將線性化的文庫載體pGADT7-Rec和雙鏈文庫cDNA共轉(zhuǎn)化含有pBait-AbAi的酵母菌。將轉(zhuǎn)化液按1/10，1/100，1/1 000，1/10 000比例稀釋后分別取100 μL涂布在SD/-Leu和含有100 ng/mL AbA的SD/- Leu培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4～6 d。

利用pGADT7-Rec載體引物pGAD-RecS(5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′)和pGAD-RecX(5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT-3′)，對初步篩選獲得的酵母菌進行PCR檢測。對鑒定獲得的陽性克隆進行回復鑒定。然后將確定的陽性菌株中的質(zhì)粒進行測序，測定的序列提交到NCBI進行Blast同源比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母報告載體的構(gòu)建

以含有AtSTK基因啟動子片段的載體為模板，Hybc和Hyxb為引物進行PCR擴增，回收后連接到pMD18-T載體進行測序，陽性克隆命名為pMD18-T-HYT。用SacⅠ和XhoⅠ酶切質(zhì)粒pMD18-T-HYT，回收啟動子片段后，連接到報告載體pAbAi，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定獲得陽性克隆pAbAi-HYT(圖1)。

A.PCR產(chǎn)物； B.報告載體質(zhì)粒；C.報告載體的酶切鑒定；M.分子量Marker。A.PCR product;B.pAbAi-HYT plasmid;C.pAbAi-HYT plasmid digested with SacⅠ/XhoⅠ; M.Molecular weight Marker.

2.2 cDNA文庫構(gòu)建與酵母雙雜交檢測

為了從擬南芥中篩選和報告載體pAbAi-HYT相互作用的蛋白質(zhì)因子，構(gòu)建了擬南芥幼苗cDNA文庫。提取擬南芥總RNA，總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，反轉(zhuǎn)錄獲得雙鏈cDNA，LD-PCR擴增后利用柱層析的方法純化PCR產(chǎn)物，純化后的產(chǎn)物貯存于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

提取重組報告載體質(zhì)粒pAbAi-HYT，利用BstbⅠ進行單酶切線性化，利用LiAc/PEG法轉(zhuǎn)化酵母菌株Y1H Gold，線性化的pAbAi-HYT進入酵母菌并整合到基因組中。然后將線性化的文庫載體pGADT7-Rec和制備的雙鏈cDNA片段利用LiAc/PEG法共同轉(zhuǎn)化pAbAi-HYT酵母細胞。由于雙鏈文庫cDNA片段的兩端和pGADT7-Rec的兩端具有一定的同源性，因此，雙鏈文庫cDNA片段可以整合到pGADT7-Rec載體中，形成環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，這樣酵母就可以在缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基中生存。

將含報告載體pAbAi-HYT、文庫載體pGADT7-Rec和雙鏈cDNA文庫的酵母菌液涂布在含有100 ng/mL AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d后，在平板上出現(xiàn)了陽性菌落。分別挑取陽性單菌落在含AbA抗性板上劃線2～3次，初步確定其陽性克隆(圖2)。結(jié)果表明，經(jīng)過多次劃線培養(yǎng)后長出的各酵母株系的菌落生長狀態(tài)不同，可能是不同的酵母株系中表達的調(diào)控蛋白與報告載體的作用強弱不同，造成了酵母菌對AbA抗生素的抗性有所差別。

2.3 陽性克隆的篩選鑒定

將陽性菌落接種于含有100 ng/mL AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后，用引物pGAD-RecS和pGAD-RecX對文庫載體所插入的cDNA片段進行PCR擴增，檢測其插入片段的長度(圖3)。

圖2 陽性克隆的初步篩選Fig.2 The initial screening of positive clones

圖3 陽性克隆的PCR檢測Fig.3 PCR detection of positive clones

2.4 陽性克隆的復篩鑒定

為了進一步鑒定陽性克隆質(zhì)粒，分別提取含有外源片段的陽性酵母菌文庫質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。提取陽性克隆的質(zhì)粒并純化，轉(zhuǎn)化含報告載體酵母菌，將其涂布到SD/-Leu和含有100 ng/mL AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基上。以構(gòu)建的含突變體的報告載體酵母菌為陰性對照，進行酵母單雜交的驗證試驗。結(jié)果表明，在含有AbA的培養(yǎng)基上，只有1～4號克隆能夠生長(圖4)。因此可以確定1～4號克隆為陽性克隆。

1～4. 利用pAbAi-HYT和陽性文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母菌；5. 陽性對照(p53-AbAi 和pGADT7-53轉(zhuǎn)化的酵母菌)；6. 陰性對照(含有突變的pMutant-AbAi載體的酵母菌)。

1-4.Yeast transformed with pAbAi-HYT and positive library vectors; 5. Positive control (yeast transformed with p53-AbAi and pGADT7-53 vectors); 6. Negative control (yeast transformed with pMutant-AbAi vector).

圖4 酵母單雜交回復鑒定
Fig.4 Retest of the positive clones

把回復鑒定后的陽性克隆在上海生工進行測序，在NCBI網(wǎng)站進行比對。得到了4個可能參與AtSTK基因表達調(diào)控的擬南芥基因AT3G29810、ATCG00470、AT2G31600和AT3G32090。其中AT3G29810是與COBRA-like蛋白家族相關(guān)的基因，此家族基因編碼糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白質(zhì)(GPI)，在細胞膜-細胞壁相互作用中扮演重要角色；ATCG00470基因編碼ATP合成酶epsilon亞基，具有ATP酶活性。AT2G31600編碼未知功能蛋白質(zhì)。其中擬南芥基因AT3G32090含有WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域(圖5)，為WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的一員。

圖5 AT3G32090 基因具有WRKY轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 The AT3G32090 gene has a conserved domain of the WRKY transcription factor

3 討論

研究DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，可以采用的方法包括DNA足跡法(Dnase I footprinting)、染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)、凝膠阻滯電泳法(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)和酵母單雜交(Yeast one hybrid system)。應(yīng)用酵母單雜交系統(tǒng)作為研究蛋白質(zhì)與DNA間相互作用，通過簡單的試驗操作，就能鑒定獲得與DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時還能夠從基因文庫中找到編碼該蛋白的DNA序列，避免了分離純化蛋白的過程。另外，酵母屬于真核細胞，通過酵母系統(tǒng)得到的鑒定結(jié)果更能體現(xiàn)出真核細胞內(nèi)基因表達調(diào)控的真實情況。

在實際操作中，由于Clontech酵母單雜交體系常常受所用報告基因AbA自泄漏表達等因素影響，在篩庫過程中為降低背景表達，需要首先篩選報告子酵母菌AbA的最小抑制濃度，防止假陽性的出現(xiàn)。本研究最終確定選用100 ng/mL AbA作為酵母單雜交篩庫的濃度。在誘餌序列的選擇上，由于不能確定與鹽誘導有關(guān)的順式元件的確切位置。所以沒有采用幾個順序同向相連的順式作用元件，而是用整個啟動子作為了誘餌序列。所以在篩選獲得的蛋白質(zhì)中會有一些和誘餌序列相結(jié)合的非轉(zhuǎn)錄因子蛋白，因此獲得的結(jié)果還需進一步檢測驗證。

本次雜交試驗共篩選獲得4個陽性克隆，其中AT3G32090基因編碼的蛋白質(zhì)具有WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域。WRKY是一類植物家族性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，含有1個或2個保守結(jié)構(gòu)域，其核心序列為WRKYGQK[19]。WRKY蛋白可與含有(T)TGACC(A/T)核心序列(W-box)的DNA特異結(jié)合。迄今為止，擬南芥中已發(fā)現(xiàn)72～75個WRKY家族成員[20-22]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子與植物MAPK信號通路密切相關(guān)。Kim等[23]發(fā)現(xiàn)MAPK蛋白激酶可以調(diào)節(jié)某些WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能。在擬南芥逆境信號傳導通路中AtWRKY22、AtWRKY29位于MPK3、MPK6的下游[24]，AtWRKY25和AtWRKY33是MAPK信號通路中MPK4的底物[25]。

前期試驗中，通過對AtSTK基因過表達轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)AtSTK基因的過表達，可以明顯引起MAPK信號傳導途徑下游基因Esk表達量的增加，說明AtSTK基因可能通過該途徑影響擬南芥植株的耐鹽性[18]。eskimo1基因是擬南芥中與冷、旱、鹽脅迫抗性密切相關(guān)的應(yīng)答基因，處于MAPK信號傳導途徑下游。綜上所述，AtSTK基因很可能通過MAPK信號傳導通路中的AT3G32090基因編碼的WRKY蛋白質(zhì)調(diào)控表達量，從而影響到擬南芥的抗逆特性。

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Study on the Expression Regulatory Proteins ofArabidopsisGeneAtSTKby Yeast One Hybrid System

YANG Ge1，HUI Ying2，ZHAO Cui1，TIAN Menghan1，REN Yuanyuan1，HUANG Zhanjing1，GE Rongchao1

(1.College of Life Sciences，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024,China；2.Zhongqi Pharmaceutical Ltd. CSPC，Shijiazhuang 050035,China)

The overexpression of Serine/Threonine protein kinase geneAtSTKcan significantly enhance the salt tolerance ofArabidopsisthaliana. In order to study the regulation mechanism ofAtSTKgene expression，the promoter sequences ofAtSTKwere amplified from genomic DNA and constructed into the reporter vector pAbAi. The recombinant plasmid pAbAi-HYT was linearized byBstb Ⅰ and transformed into the yeast strain Y1H Gold，the linear pAbAi-HYT integrated into the genomic DNA. Then，the purified double strand cDNA ofArabidopsisand the linearized library vector pGADT7-Rec were co-transformed into the yeast cell which containing reporter vector pAbAi-HYT. The positive clones were screened on the SD/-Leu medium containing 100 ng/mL AbA by the yeast one hybrid method. Through the identification，it was found that four genes might be involved in the regulation ofAtSTKgene expression. The sequencing results indicated that theArabidopsisthalianageneAT3G32090，which contained a conserved domain of WRKY transcription factor，was a member of the WRKY transcription factor. Therefore，the expression level ofAtSTKmight affect the salt tolerance ofArabidopsisplants through the MAPK signaling pathway transcription factor which coded by the geneAT3G32090.

AtSTK；Promoter；Expression regulatory proteins；Yeast one hybrid

2017-06-18

國家自然科學基金項目(30900104)；河北省自然科學基金項目(C2016205158)

楊 歌(1993-)，女，河北石家莊人，在讀碩士，主要從事耐鹽相關(guān)基因克隆與功能研究。楊歌、惠穎為同等貢獻作者。

葛榮朝(1974-)，男，河北衡水人，教授，博士，主要從事植物抗逆相關(guān)功能基因研究。

Q756

A

1000-7091(2017)04-0073-05

10.7668/hbnxb.2017.04.012