彭馥芝，冉茂良，翁波，李智，董蓮花，陳斌

?

豬睪丸組織定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇

彭馥芝，冉茂良，翁波，李智，董蓮花，陳斌

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128）

【目的】采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析時(shí)，選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因是獲得準(zhǔn)確分析結(jié)果的關(guān)鍵。在豬睪丸分子生物學(xué)研究中，表達(dá)穩(wěn)定的蛋白編碼內(nèi)參基因和microRNA（miRNA）內(nèi)參基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在篩選出合適的內(nèi)參基因，為準(zhǔn)確定量不同時(shí)期豬睪丸組織中目的基因的表達(dá)提供可靠依據(jù)?！痉椒ā窟x用8個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、DM）的豬睪丸組織為材料，采用Trizol裂解法提取各樣品的總RNA，利用NanDrop ND-2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度。設(shè)計(jì)并合成已報(bào)道的豬其他組織中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的5個(gè)編碼內(nèi)參基因（、、、和）以及5個(gè)miRNA內(nèi)參基因（U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103）的特異性引物序列，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板后，按1:10梯度稀釋為7個(gè)濃度梯度進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。并對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因在各時(shí)期睪丸組織中的表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量全面檢測(cè)，采用GeNorm法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行綜合分析，最后根據(jù)內(nèi)參基因穩(wěn)定性值（M值）的大小篩選出最穩(wěn)定的參考基因；M值越小，表明內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，反之則越差。【結(jié)果】對(duì)、、、、、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103 10個(gè)候選內(nèi)參基因的熔解曲線(xiàn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，均無(wú)非特異擴(kuò)增及引物二聚體，說(shuō)明各內(nèi)參基因特異性良好，qRT-PCR反應(yīng)的專(zhuān)一性高；以Ct值為縱坐標(biāo)，相對(duì)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析可知，各內(nèi)參基因在系列稀釋的濃度梯度內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系；通過(guò)對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因在不同時(shí)期豬睪丸組織中的表達(dá)穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，蛋白編碼基因中，最穩(wěn)定的為，最不穩(wěn)定的是；miRNA候選內(nèi)參中，最穩(wěn)定的為U6，最不穩(wěn)定的是ssc-miR-26a。【結(jié)論】成功篩選出豬睪丸組織基因表達(dá)分析中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因和U6，可作為豬睪丸組織基因表達(dá)研究中最佳內(nèi)參基因候選者。

豬睪丸組織；內(nèi)參基因；qRT-PCR；miRNA

0 引言

【研究意義】實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR）是一種通過(guò)始點(diǎn)定量和熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)累積熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量基因檢測(cè)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、線(xiàn)性關(guān)系好、操作簡(jiǎn)單的定量PCR技術(shù)，已成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中分析基因表達(dá)的重要工具[1]。內(nèi)參基因是一種維持細(xì)胞最低限度功能不可缺少的基因，理想的內(nèi)參基因在不同類(lèi)型細(xì)胞和組織中的表達(dá)應(yīng)無(wú)顯著差異，且不受試驗(yàn)和臨床條件的影響。但由于內(nèi)參基因的表達(dá)具有物種及組織特異性，所以其表達(dá)的穩(wěn)定性是相對(duì)的。而在使用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)目的基因表達(dá)水平時(shí)，為減少檢測(cè)樣本在RNA產(chǎn)量、質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差異，通常需要引入一個(gè)表達(dá)較為穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[2-3]。【前人研究進(jìn)展】目前，各個(gè)研究領(lǐng)域關(guān)于內(nèi)參基因的報(bào)道很多，例如，在家蠶不同組織中、的表達(dá)相對(duì)較穩(wěn)定[4]；陳瑞等[3]以3個(gè)階段的新西蘭白兔的3種不同組織作為研究對(duì)象，證實(shí)新西蘭白兔不同的發(fā)育時(shí)期和組織中，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因不同；而、和為山羊不同組織和不同時(shí)期中最合適的內(nèi)參基因[5]，為波爾山羊10個(gè)不同組織中表達(dá)水平最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[6]，校正綿羊不同組織qRT-PCR結(jié)果時(shí)，也需要選擇各組織中最適用的內(nèi)參基因[7]；LISOWSKI 等[8]在牛的不同組織中篩選內(nèi)參基因的結(jié)果也表明，不同組織中各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性也有所不同。這些結(jié)果對(duì)不同試驗(yàn)材料及其在不同時(shí)期基因表達(dá)研究中內(nèi)參基因的選擇提供了有效參考。而作為生物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要成員的miRNAs，盡管現(xiàn)在對(duì)其的研究取得了很大進(jìn)展[9-10], 但是對(duì)于均一化miRNA表達(dá)的內(nèi)參基因的系統(tǒng)研究還比較匱乏，主要在人類(lèi)疾病方面的研究比較多。SCHAEFER等[11]對(duì)前列腺癌組織樣本進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)，建議在前列腺癌組織中使用miR-103b作為內(nèi)參基因。WOTSCHOFSKY等[12]的研究結(jié)果指出，作為透明細(xì)胞腎癌研究的miRNA內(nèi)參基因應(yīng)用一種miRNA內(nèi)參來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，那么miRNA-28是最佳選擇。人類(lèi)各種組織miRNA內(nèi)參基因的選擇結(jié)果顯示，miR-191是多種正常組織中最穩(wěn)定的miRNA，而在腫瘤組織中表達(dá)最穩(wěn)定的是miR-103[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雄性睪丸是調(diào)控雄性生殖發(fā)育和精子成熟的重要器官，探索睪丸組織內(nèi)各基因的表達(dá)水平對(duì)促進(jìn)雄性生育及預(yù)防生殖方面的疾病具有重要的意義。目前，內(nèi)參基因的篩選在仔豬心、肝臟、脾臟等不同組織[14]、梅山-大白豬肌肉組織[15]、豬血管內(nèi)皮細(xì)胞[16]、豬骨骼肌組[17]等豬的相關(guān)組織中已有報(bào)道，但對(duì)其在豬睪丸組織中表達(dá)的內(nèi)參基因的篩選還未見(jiàn)系統(tǒng)研究。因此，本研究以不同發(fā)育階段豬睪丸組織樣品為材料，綜合比較豬其他組織中各內(nèi)參基因穩(wěn)定性后，選擇、、、和五個(gè)蛋白編碼基因以及U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103等5個(gè)miRNA為候選內(nèi)參基因，采用qRT-PCR技術(shù)，結(jié)合GeNorm分析軟件[18]，對(duì)10個(gè)候選基因在不同時(shí)期豬睪丸組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】獲得適用于豬睪丸組織基因表達(dá)研究的最佳內(nèi)參基因，以期為后續(xù)相關(guān)研究中內(nèi)參基因的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年4—6月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

試驗(yàn)所用的沙子嶺豬睪丸組織樣品采于湖南省湘潭市沙子嶺豬保種場(chǎng)，通過(guò)屠宰的方法采集豬胚胎期睪丸組織樣品，采用閹割的方法采集出生后公豬的睪丸組織樣品。采集90胚齡（E 90）、1日齡（D 1）、30日齡（D 30）、60日齡（D 60）、90日齡（D 90）、120日齡（D 120）、150日齡（D 150）及180日齡（DM）8個(gè)發(fā)育階段的正常健康公豬睪丸組織，剪成小塊，放入RNase-free的EP管中，立即置于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)階段采集3頭公豬睪丸組織樣品，共計(jì)24個(gè)樣品。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

采用Trizol裂解法提取各樣品的總RNA，利用NanDrop ND-2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度。OD260/280和OD260/230的值用來(lái)確定所有RNA樣品的純度。只有OD260/280比值介于1.8—2.0之間，OD260/230在2.0以上的RNA樣品才能用于后續(xù)研究。按照RR047A型PrimeScript? RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的構(gòu)建

本研究選取、、、和等5個(gè)蛋白編碼基因以及U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103等5個(gè)miRNA內(nèi)參基因作為候選基因。利用miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)搜索5個(gè)miRNA內(nèi)參基因的成熟序列，查閱文獻(xiàn)資料確定5個(gè)蛋白編碼基因的序列，設(shè)計(jì)10個(gè)候選基因的特異性引物序列（表1），并由生工生物工程有限公司（上海，中國(guó)）合成。將cDNA模板按1﹕10梯度稀釋為7個(gè)濃度梯度后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

表1 候選基因的引物序列

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

qRT-PCR反應(yīng)體系為25 μL：熒光染料SYBR?Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，dH2O（滅菌蒸餾水）8.5 μL，PCR Forward Primer 1.0 μL（10 μmol·L-1）、PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1）1.0 μL，cDNA模板2.0 μL。反應(yīng)在CFX Connect（Bio Rad，美國(guó)）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60℃30 s擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)；55℃—95℃熔解30 s，監(jiān)測(cè)熔解曲線(xiàn)的過(guò)程中，每0.5℃進(jìn)行1次熒光監(jiān)測(cè)。每個(gè)階段睪丸組織均有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次qRT-PCR，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

1.5 表達(dá)數(shù)據(jù)分析

GeNorm程序的原理是根據(jù)基因相對(duì)表達(dá)水平的幾何平均值計(jì)算候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性值（M值），根據(jù)M值的大小篩選出最穩(wěn)定的參考基因，M值越小，表明內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，反之則越差[19]。數(shù)據(jù)讀取由CFX Connect（Bio Rad，美國(guó)）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)完成，通過(guò)CFX Manager軟件中的GeNorm程序獲得內(nèi)參基因在各時(shí)期表達(dá)穩(wěn)定度的平均M值，從而篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)參基因引物的特異性

對(duì)、、、、、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR- 103等10個(gè)候選內(nèi)參基因的熔解曲線(xiàn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，均無(wú)非特異擴(kuò)增及引物二聚體，說(shuō)明各內(nèi)參基因特異性良好，qRT-PCR反應(yīng)的專(zhuān)一性高, 結(jié)果準(zhǔn)確可靠，滿(mǎn)足試驗(yàn)要求（圖1，2）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的構(gòu)建

以Ct值為縱坐標(biāo)，相對(duì)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析，由表2可知，各內(nèi)參基因在系列稀釋的濃度梯度內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，滿(mǎn)足qRT-PCR的擴(kuò)增條件。

2.3 內(nèi)參基因在不同時(shí)期表達(dá)的穩(wěn)定性

通過(guò)對(duì)10個(gè)內(nèi)參基因在不同時(shí)期豬睪丸組織中的表達(dá)穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，蛋白編碼基因中，最穩(wěn)定的為，最不穩(wěn)定的是（圖3）；miRNA中，最穩(wěn)定的為U6，最不穩(wěn)定的是ssc-miR-26a（圖4）。

(A) β-actin; (B) TBP; (C) SDHA; (D) GAPDH; (E) B2M

(A) ssc-miR-27a; (B) ssc-miR-17-5p; (C) U6; (D) ssc-miR-26a; (E) ssc-miR-103

圖2 豬睪丸組織中5個(gè)候選miRNA內(nèi)參基因Real-time PCR熔解曲線(xiàn)

Fig. 2 Real-time PCR melting curves of 5 candidate miRNA reference genes of porcine testis tissues

表2 豬睪丸組織10個(gè)候選內(nèi)參基因的qRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖3 豬睪丸組織中內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定度

圖4 豬睪丸組織中miRNA內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定度

3 討論

內(nèi)參基因也叫看家基因，指在檢測(cè)基因表達(dá)水平的試驗(yàn)中，通常用來(lái)作為參照物，對(duì)試驗(yàn)誤差進(jìn)行校正的基因。理想的內(nèi)參基因要求在各種試驗(yàn)條件及各組織、細(xì)胞和發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)均相對(duì)恒定[20]。采用穩(wěn)定的內(nèi)參基因能對(duì)定量試驗(yàn)中qRT-PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，但尚未發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)內(nèi)參基因能在所有試驗(yàn)條件下均穩(wěn)定表達(dá)，而是在不同的組織或同一組織的不同發(fā)育時(shí)期均存在差異表達(dá)[21-23]。因此在對(duì)特定基因表達(dá)研究中，篩選出最穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行校正，才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[24]。本試驗(yàn)首次對(duì)豬睪丸組織基因表達(dá)分析中適宜的內(nèi)參基因進(jìn)行研究。結(jié)果表明，豬睪丸組織8個(gè)發(fā)育時(shí)期的10個(gè)候選基因中蛋白編碼基因和miRNA表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是和U6，穩(wěn)定性最差的分別是和ssc-miR-26a。

是轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物TFIID 的核心組分，與相關(guān)啟動(dòng)子結(jié)合后，能識(shí)別并特異性結(jié)合TATA元件，進(jìn)而指導(dǎo)RNA 聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄因子有序裝配，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，并直接影響基因的轉(zhuǎn)錄水平[25-26]。本研究結(jié)果揭示在豬睪丸組織中的表達(dá)穩(wěn)定性與之前在豬各組織中的研究結(jié)果一致。例如，ERKENS等[27]研究發(fā)現(xiàn)和可作為最合適、表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因用于豬的背脂和背肌的基因表達(dá)研究。在NYGARD等的研究中，分析了9個(gè)內(nèi)參基因在豬的不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)、、和這4個(gè)基因的表達(dá)最穩(wěn)定，而表達(dá)最不穩(wěn)定[28]。對(duì)豬外周血基因表達(dá)分析中適宜的內(nèi)參基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明，6個(gè)候選內(nèi)參基因在全血中穩(wěn)定表達(dá)順序中穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因的是和，最差的是[29]。

U6是剪接體的組成元件之一，參與mRNA前體的加工過(guò)程[30]。U6在真核生物各種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而且表達(dá)水平恒定，因此，常被選作內(nèi)參基因用于miRNA的定量表達(dá)分析[31-32]。本研究結(jié)果也表明，在豬睪丸組織miRNA表達(dá)水平的研究中，U6為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。但U6作為理想內(nèi)參基因其穩(wěn)定性也一直受到質(zhì)疑。例如，在豬肝臟、脾臟、胰臟、心臟、胃、肺、小腸、大腦、小腦和腿肌的正常組織中篩選出miR-103實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)分析的合適內(nèi)參時(shí)，采用GeNorm 算法和擴(kuò)增效率試驗(yàn)對(duì)miR-196、U6和總RNA[33]（以總RNA為標(biāo)準(zhǔn)歸一化各候選基因的表達(dá)水平）3個(gè)候選內(nèi)參進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，miR-196的表達(dá)穩(wěn)定性和擴(kuò)增效率均優(yōu)于U6；以miR-196為內(nèi)參的miR-103 相對(duì)定量結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性[34]。李春枚[35]選擇13個(gè)在豬的miRNA定量中常被用作內(nèi)參的基因（5S，Met-rRNA，ssc-miR-16，ssc-miR-17，ssc-miR-23a，ssc-miR-24，ssc-miR-27a，ssc-miR-103，ssc-miR-106a，ssc-miR-107，ssc-miR-186，ssc-miR-221和U6），通過(guò)EvaGreenq-PCR法分別比較其在47個(gè)不同組織，10個(gè)脂肪組織和4個(gè)肌肉組織中的表達(dá)差異，然后利用GeNorm軟件評(píng)估這些基因在3個(gè)不同樣本分類(lèi)中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，通過(guò)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析，在全部47個(gè)組織中，有7個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)顯示出可靠的穩(wěn)定性，其中ssc-miR-17和ssc-miR-103是最穩(wěn)定的兩個(gè)內(nèi)參基因。而在3個(gè)不同樣本分類(lèi)中，U6的表達(dá)都是最不穩(wěn)定的。由此可見(jiàn)，不同組織中最適用的內(nèi)參基因并不完全一致，因此有必要針對(duì)豬不同組織進(jìn)行內(nèi)參基因的優(yōu)選。

4 結(jié)論

本研究成功篩選了豬睪丸組織基因表達(dá)分析中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因（和U6），為準(zhǔn)確定量不同時(shí)期豬睪丸組織目的基因的表達(dá)提供了可靠的依據(jù)。但是本試驗(yàn)結(jié)果并不是絕對(duì)的，在其他試驗(yàn)條件下，還需要通過(guò)系統(tǒng)的試驗(yàn)分析重新確定合適的編碼基因或miRNA作為內(nèi)參基因，盲目地選擇內(nèi)參基因可能會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果出現(xiàn)偏差，甚至得到錯(cuò)誤的結(jié)論。

References

[1] 蔣春燕, 王泰健, 王琴, 范學(xué)政. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù). 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2005, 26(12) : 97-101.

JIANG C Y, WANG T J, WANG Q, FAN X Z. Real-time fluorescence quantitative PCR., 2005, 26(12): 97-101. (in Chinese)

[2] 吳文凱, 劉成前, 周志剛, 盧山. 用于萊茵衣藻熒光定量PCR分析的內(nèi)參基因選擇. 植物生理學(xué)通訊, 2009(7): 667-672.

WU W K, LIU C Q, ZHOU Z G, LU S. The selection of reference genes inP. A. Dangeard by real-time quantitative PCR., 2009(7): 667-672. (in Chinese)

[3] 陳瑞, 楊曉農(nóng), 曾婉秋, 文娟. 家兔不同發(fā)育階段和組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, 47(3) : 477-483.

CHEN R, YANG X L, ZENG W Q, WEN J. Expression stability analysis of reference genes in different development periods and tissues in., 2016, 47(3): 477-483. (in Chinese)

[4] 彭然.家蠶常用內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析及兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較[D]. 蘇州: 蘇州大學(xué), 2012.

PENG R. Analysis of reference gene expression for real time PCR based on relative quantitative and dual spike-in strategy in the silkworm[D]. Suzhou: Suzhou University, 2012. (in Chinese)

[5] 陳利, 趙薇, 占思遠(yuǎn), 李丹, 李利, 仲濤, 王林杰, 張紅平. 山羊不同組織及不同發(fā)育時(shí)期骨骼肌內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 45(8) : 1228-1236.

CHEN L, ZHAO W, ZHAN S Y, LI D, ZHONG T, WANG L J, ZHANG H P. The expression stability analysis of reference genes in different tissues and skeletal muscle of different development periods in goat., 2014, 45(8): 1228-1236. (in Chinese)

[6] 張曉東. 山羊卵巢microRNA的鑒定及生物學(xué)功能分析[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

ZHANG X D. Identification and biological role analysis of microRNAs in goat ovaries[D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[7] GARCIA-CRESPO D, JUSTE R A, HURTADO A. Selection of ovine housekeeping genes for normalisation by real-time RT-PCR; analysis ofgene expression and genetic susceptibility to scrapie., 2005, 1:3.

[8] LISOWSKI P, PIERZCHALA M, GOSCIK J, PAREEK C S, ZWIERZCHOWSKI L. Evaluation of reference genes for studies of gene expression in the bovine liver, kidney, pituitary, and thyroid., 2008, 49(4) : 367-372.

[9] 冉茂良, 陳斌, 尹杰, 楊岸奇, 蔣明.睪丸發(fā)育和精子生成相關(guān)miRNA研究進(jìn)展. 遺傳, 2014, 36(7) : 646-654.

RAN M L, CHEN B, YIN J, YANG A Q, JIANG M. Advances in miRNA research related to testis development and spermatogenesis., 2014, 36(7) : 646-654. (in Chinese)

[10] 蔡婷, 劉志紅, 王志新, 趙濛, 俎紅麗, 李金泉. miRNA在調(diào)控皮膚和毛囊發(fā)育中的作用. 遺傳, 2013, 35(9) : 1087-1094.

CAI T, LIU Z H, WANG Z X, ZHAO M, JU H L, LI J Q. miRNA in regulation of skin and hair follicle development., 2013, 35(9) : 1087-1094. (in Chinese)

[11] SCHAEFER A, JUNG M, MILLER K, LEIN M, KRISTIANSEN G, ERBERSDOBLER A, JUNG K. Suitable reference genes for relative quantification of miRNA expression in prostate cancer., 2010, 42(11) : 749-758.

[12] WOTSCHOFSKY Z, MEYER H A, JUNG M, FENDLER A, WAGNER I, STEPHAN C, BUSCH J, ERBERSDOBLER A, DISCH A C, MOLLENKOPF H J, JUNG K. Reference genes for the relative quantification of microRNAs in renal cell carcinomas and their metastases., 2011, 417(2): 233-241.

[13] 陳旭. miRNA定量檢測(cè)中內(nèi)參基因的選擇. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 33(11): 1338-1340.

CHEN X. The selection of reference genes for miRNA quantitative detection., 2012, 33(11): 1338-1340. (in Chinese)

[14] 臺(tái)玉磊, 韓立強(qiáng), 楊國(guó)慶, 王艷玲, 常磊, 臧猛, 武宇曉, 王靜, 張志強(qiáng), 楊國(guó)宇. 仔豬組織基因表達(dá)中實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的選擇. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2010, 18(4): 732-736.

TAI Y L, HAN L Q, YANG G Q, WANG Y L, CHANG L, ZANG M, WU X Y, WANG J, ZHANG Z Q, YANG G Y. Selection of the reference genes of real-time quantitative PCR in the gene expression of piglet tissues., 2010, 18(4): 732-736. (in Chinese)

[15] 馮小婷. 梅山-大白豬肌肉組織差異表達(dá)基因的篩選、鑒定及功能研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

FENG X T. Screening, identification and function analysis of genes differentially expressed in porcine skeletal muscle between Meishan and Yorkshire pigs[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2011. (in Chinese)

[16] 朱鑫, 吳巧, 馮曉輝, 湯承, 岳華. H1N1豬流感病毒感染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞后內(nèi)參基因的篩選. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2014, 40(4): 489-494.

ZHU X, WU Q, FENG X H, TANG C, YUE H. Selection of reference genes in porcine umbilicus vein endothelial cells infected with H1N1 swine influenza virus., 2014, 40(4): 489-494. (in Chinese)

[17] 張晶. 骨骼肌發(fā)育中miR-148a功能與qPCR內(nèi)參基因的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

ZHANG J. Study on function of miR-148a and the reference genes for qPCR in skeletal muscle development [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2012. (in Chinese)

[18] VANDSOMPELE J, PRETER K D, PATTYN F, POPPE B, ROY N V,

PAEPE A D, SPELEMAN F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes., 2002, 3(7) : 1-12.

[19] AIROLDI M, AMADORI D, BARNI S, CINIERI S, PLACIDO S D, LEO A D, GENNARI A, IACOBELLI S, IONTA M T, LORUSSO V, LOTRIONTE M, MARCHETTI P, MATTIOLI R, MINOTTI G, PAONZATO P, ROSTI G, TONDINI C A, VERONESI A. Clinical activity and cardiac tolerability of non-pegylated liposomal doxorubicin in breast cancer: a synthetic review., 2012, 97(6): 690-692.

[20] SEHLOTTER Y M, VEENHOF E Z, BRINKHOF B, RUTTEN V P M G, SPEE B, WILLEMSE T, PENNING L C. A GeNorm algorithm-based selection of reference genes for quantitative real-time PCR in skin biopsies of healthy dogs and dogs with atopic dermatitis., 2009, 129(l/2): 115-118.

[21] JAIN M, NIJHAWAN A, TYAGI A K, KHURANA J P. Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR., 2006, 345: 646-651.

[22] FACCI M R, AURAY G, MEURENS F, BUCHANAN R, KESSEL J V, GERDTS V. Stability of expression of reference genes in porcine peripheral blood mononuclear and dendritic cells., 2011, 141(1/2): 11-15.

[23] VANDESOMPELE J, PRETER K D, PATTYN F, POPPE B, ROY N V, PAEPE A D, SPELEMAN F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes., 2002, 3(7): research0034.1-0034.11.

[24] 胡金川. 如何利用geNorm軟件篩選基因表達(dá)測(cè)定的內(nèi)參基因. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 31(8) : 918.

HU J C. How to screen the gene expression of reference genes determined by geNorm software., 2008, 31(8): 918. (in Chinese)

[25] AKHTAR W, VEENSTRA G C. TBP-related factors: a paradigm of diversity in transcription initiation., 2011(1): 23.

[26] THOMAS M C, CHIANG C M. The general transcription machinery and general cofactors., 2006, 41: 105-178.

[27] ERKENS T, POUCKE M V, VANDESOMPELE J, GOOSSENS K, ZEVEREN A V, PEELMAN L J. Development of a new set of reference genes for normalization of real-time RT-PCR data of porcine backfat and longissimus dorsi muscle, and evaluation with PPARGC1A., 2006, 6: 41.

[28] NYGARD A B, JORGENSEN C B, CIRERA S, FREDHOLM M. Selection of reference genes for gene expression studies in pig tissues using SYBR green qPCR., 2007, 8(1): 67.

[29] 王繼英, 王彥平, 郭建鳳, 王懷中, 林松, 張印, 武英. 仔豬外周血中內(nèi)參基因的篩選及細(xì)胞因子和受體的表達(dá)水平. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(7): 1437-1444.

WANG J Y, WANG Y P, GUO J F, WANG H Z, LIN S, ZHANG Y, WU Y. Selection of reference genes and determination of cytokines and receptor mRNA expression in peripheral blood of piglets., 2015, 48(7): 1437-1444. (in Chinese)

[30] BESSONOV S, ANOKHINA M, WILL C L, URLAUB H, LUHRMANN R. Isolation of an active step I spliceosome and composition of its RNP core., 2008, 452(7189): 846-850.

[31] 張曉軍, 李傳民, 趙偉, 于海濱, 趙志輝, 孫博興. 豬睪丸組織中miR-375的表達(dá)及靶基因預(yù)測(cè). 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 34(11): 1846-1849.

ZHANG X J, LI C M, ZHAO W, YU H B, ZHAO Z H, SUN B X. The expression of miR-375 and its target genes prediction in testicular tissue of junmu NO.1 white pig., 2014, 34(11): 1846-1849. (in Chinese)

[32] 羅志宇, 潘華, 冉雪琴, 王嘉福.香豬睪丸2種miRNA在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的變化.畜牧與獸醫(yī), 2015, 47(4): 91-96.

LUO Z Y, PAN H, RAN X Q, WANG J F. Changes of 2 kinds of miRNA in the testis of Xiang Pig in different developmental stages., 2015, 47(4): 91-96. (in Chinese)

[33] Esau C, Kang X L, Peralta E, Hanson E, Marcusson E G, Ravichandran L V, Sun Y Q, Koo S, Perera R J, Jain R, Dean N M, Freier S M, Frank Bennett C, Lollo B, Griffey R. MicroRNA-143 regulates adipocyte differentiation.,2004, 279(50): 52361-52365.

[34] 李國(guó)喜, 寧小敏, 李新建, 吳宗松, 楊公社.豬組織中miR-103實(shí)時(shí)定量PCR分析時(shí)合適內(nèi)參的確定. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2009(12): 1149-1154.

LI G X, NING X M, LI X J, WU Z S, YANG G S. Identification of suitable reference for quantitative RT-PCR assays of miR-103 in pig tissues., 2009(12): 1149-1154. (in Chinese)`

[35] 李春枚. 豬microRNA內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗(yàn)證[D]. 雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

LI C M. Identification of suitable endogenous control microRNA genes in normal pig tissues[D]. Yaan: Sichuan Agricultural University, 2011. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Validation of Reference Genes for Quantitative RT-PCR Analysis in Porcine Testis Tissues

PENG FuZhi, RAN MaoLiang, WENG Bo, LI Zhi, DONG LianHua, CHEN Bin

（College of Animal Science & Technology, Hunan Agricultural University / Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, Changsha 410128）

【Objective】Reference gene is the key to obtain the accurate analysis results when apply quantitative RT-PCR (qRT-PCR) technique to identify the gene expression level. However, reference gene and microRNA (miRNA) which are used in researching the molecular biology of porcine testis are not well characterized. Screening suitable reference gene will provide a reliable evidence for the quantitative analysis of target gene in different periods of porcine testis tissues.【Method】Porcine testis tissues at 8 different developmental stages (E 90, D 1, D 30, D 60, D 90, D 120, D 150, and DM) were selected as materials in this study. Trizol method was used to extract the total RNA and the concentration and purity of total RNA were detected by ND-2000 NanDrop spectrophotometer. The primers of 5 commonly used protein coding reference genes (,,,and) and 5 miRNA reference genes (U6, ssc-miR-17-5p, ssc-miR-26a, ssc-miR-27a and ssc-miR-103) were designed and synthesized to reverse transcription. cDNA templates were diluted to 7 concentration gradients with 1:10 serial dilution to construct standard curves. The expression of 10 candidate reference genes in porcine testis tissues was systematically analyzed at specified times, then the Genorm 3.5 was used to analyze the results. The most stable reference genes were picked up according to the stability value which called M value, the smaller the value of M, the better the stability of the reference gene; otherwise, the stability would be worse.【Result】The melting curves of 10 candidate reference genes (U6, ssc-miR-17-5p, ssc-miR-26a, ssc-miR-27a, and ssc-miR-103) indicated that the expression of all the candidate reference genes was of some specificity, no primer-dimers and nonspecific amplification. The relationship between Ct value and the logarithm of relative copy number was coincidence with linear relation according to the standard curves which were made with Ct value as ordinate and the logarithm of relative copy number as abscissas in a series of diluted concentration gradients. Analysis showed that the most stable reference gene of protein encoding gene wasand the most unstable was. U6 was the most suitable gene for miRNA expression analysis and ssc-miR-26a was the most unsuitable. 【Conclusion】This study has screened the most suitable reference genes (and U6) to identify porcine testis gene expression level successfully. The highly ranked reference genes identified from this study can provide a theoretical basis for the selection of the most suitable reference gene to detect differences in expression rates of genes and miRNAs in porcine testis tissues.

porcine testis tissue; reference genes; qRT-PCR; miRNA

2016-07-01；接受日期：2017-06-15

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金（CARS-36）

彭馥芝，Tel：13117516124；E-mail：pengfuzhi0809@126.com。通信作者陳斌，E-mail：chenbin7586@126.com