楊丙燁，付丹，胡方平，蔡學(xué)清

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西瓜細(xì)菌性果斑病菌鞭毛基因的功能分析

楊丙燁，付丹，胡方平，蔡學(xué)清

（福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州350002）

【目的】西瓜細(xì)菌性果斑病由西瓜噬酸菌(,) 引起，是一種嚴(yán)重的世界性病害。細(xì)菌的鞭毛通常被認(rèn)為是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，在細(xì)菌的侵染過(guò)程中也起重要作用，已有報(bào)道表明這種作用可受鞭毛蛋白基因的調(diào)控，目前西瓜細(xì)菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因的功能及其調(diào)控機(jī)理尚不清楚，本研究旨在探討該基因在鞭毛形成和致病性等生物學(xué)特性中的作用?！痉椒ā恳怨卟【吧椭虏【?號(hào)基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)一系列引物，PCR擴(kuò)增敲除基因的上下游片段，通過(guò)回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟構(gòu)建敲除載體和互補(bǔ)載體，然后采用三親雜交法，根據(jù)同源重組的原理，構(gòu)建基因缺失突變菌株及其互補(bǔ)菌株，并對(duì)其鞭毛的形態(tài)特征、致病性、過(guò)敏反應(yīng)、游動(dòng)性、群體感應(yīng)、菌膜、生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)等生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定；進(jìn)一步提取細(xì)菌總RNA，以谷氨酰胺合成酶基因?yàn)閰⒄諄?lái)校正目標(biāo)基因的表達(dá)量，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法，比較野生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株部分鞭毛蛋白基因、、、、、和的表達(dá)量差異?！窘Y(jié)果】通過(guò)抗性基因的篩選和PCR驗(yàn)證，成功構(gòu)建了果斑病菌鞭毛蛋白基因缺失突變菌株1-fliS及其互補(bǔ)菌株1-fliShb，并對(duì)所得菌株的生物學(xué)特性和鞭毛進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，與野生菌株相比，鞭毛蛋白基因缺失突變菌株的游動(dòng)性、菌膜形成能力減弱，互補(bǔ)后游動(dòng)性、菌膜形成能力基本恢復(fù)；缺失突變菌株對(duì)甜瓜、西瓜幼苗以及西瓜果實(shí)的致病性降低，互補(bǔ)后對(duì)西瓜、甜瓜幼苗及西瓜果實(shí)的致病力完全恢復(fù)。電鏡測(cè)試顯示，突變菌株鞭毛變短，長(zhǎng)度約為野生菌株的1/3—1/4，互補(bǔ)后鞭毛合成能力基本恢復(fù)，鞭毛長(zhǎng)度約為野生菌的4/5；光學(xué)顯微鏡下，可觀察到在NA平板上的野生菌株菌落周?chē)忻黠@的由細(xì)菌顫泳形成的特殊暈圈，而缺失突變菌株在NA平板上不能形成這種暈圈，互補(bǔ)后暈圈形成能力部分恢復(fù)；缺失突變菌株的生長(zhǎng)速率比野生菌株慢，互補(bǔ)后生長(zhǎng)速率沒(méi)有恢復(fù)；野生菌株、突變菌株和互補(bǔ)菌株在過(guò)敏性反應(yīng)和群體感應(yīng)方面無(wú)差異。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，基因缺失突變后，表達(dá)量較野生菌株明顯降低，、和表達(dá)量較野生菌株明顯升高，和表達(dá)量略微上升，表達(dá)量基本不變；互補(bǔ)菌株中、和表達(dá)量部分恢復(fù)，、和表達(dá)量沒(méi)有恢復(fù)，與突變菌株相同?！窘Y(jié)論】鞭毛基因?qū)卟【廾z的形成、游動(dòng)性、菌膜形成能力、生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)、致病性等均有調(diào)控作用。

西瓜果斑病菌（西瓜噬酸菌）；細(xì)菌性果斑??；；生物學(xué)特性

0 引言

【研究意義】西瓜噬酸菌（）可以引起包括西瓜和甜瓜在內(nèi)的葫蘆科作物細(xì)菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB），是一種嚴(yán)重的世界性病害[1]。該病一般由種子傳播，在西瓜整個(gè)生長(zhǎng)期均可侵染，致使果肉腐爛，失去食用價(jià)值。在適宜的環(huán)境條件下，果斑病一旦暴發(fā)，難以控制，常常給瓜農(nóng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。從1987年開(kāi)始，該病在中國(guó)海南、甘肅、吉林、黑龍江等地陸續(xù)被報(bào)道[3-6]。細(xì)菌的鞭毛蛋白基因與病菌的致病性相關(guān)，但是有關(guān)果斑病菌鞭毛蛋白基因的研究較少，因而開(kāi)展果斑病菌鞭毛蛋白基因研究，對(duì)進(jìn)一步探明該基因在果斑病菌致病性等生物學(xué)功能中的作用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】現(xiàn)已研究表明，鞭毛蛋白基因與鞭毛的形成、菌株的游動(dòng)性、毒性等有著密切的關(guān)系，如Yokoseki等對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌（）突變體的研究表明，鞭毛蛋白基因的缺失導(dǎo)致該菌的鞭毛變短且數(shù)量是野生菌的2倍左右[7-8]；Xu等[9]研究顯示，在假結(jié)核耶爾森菌（）中，缺失突變株鞭毛明顯變短、游動(dòng)性減弱，菌膜形成能力增強(qiáng)，互補(bǔ)后菌株鞭毛長(zhǎng)度恢復(fù)野生狀態(tài)；RADOMSKA等[10]對(duì)空腸彎曲桿菌（）的鞭毛蛋白基因研究表明，該基因的缺失導(dǎo)致其喪失游動(dòng)性，且鞭毛變短；劉麗云等[11]研究認(rèn)為，在弗氏枸櫞酸桿菌（）中缺失菌株游動(dòng)性降低，可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的黏附性減弱和細(xì)胞毒性下降。【本研究切入點(diǎn)】果斑病菌的鞭毛蛋白基因是否具有相同或相似的生物學(xué)功能，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者課題組從構(gòu)建的果斑病菌Tn5插入突變體庫(kù)中篩選到一株鞭毛蛋白基因（Aave_4398）被插入突變的突變株，該突變株的致病性顯著降低，該基因在果斑病菌生物學(xué)特性中的作用需要進(jìn)一步明確。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)構(gòu)建敲除載體和互補(bǔ)載體，獲得鞭毛蛋白基因突變株和互補(bǔ)菌株，分析該基因?qū)卟【飳W(xué)功能的影響，為解析果斑病菌鞭毛蛋白基因的功能，進(jìn)一步明確果斑病菌的致病機(jī)理和鞭毛調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年10月至2017年1月在福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

1.1 菌株和質(zhì)粒

西瓜果斑病菌野生菌株1號(hào)（RifR）、敲除菌株1-fliS（RifR、GmR）、互補(bǔ)菌株1-fliShb（RifR、GmR、KmR）。大腸桿菌DH5、質(zhì)粒PBBR1MCS-2（KmR）、質(zhì)粒pMD19T-Gm由筆者實(shí)驗(yàn)室保存；助手菌DH5（PRK 600）（CmR）、群體感應(yīng)信號(hào)報(bào)告菌NTL4由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)張力群教授惠贈(zèng)；群體感應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照菌株Ecc-1、敲除載體PK18mobsacB（KmR）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院趙廷昌研究員惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基

LB、NA、KB培養(yǎng)基配制參照方中達(dá)《植病研究方法》[12]，ABM培養(yǎng)基配制參照劉鵬[13]的方法，半固體M9DCAA培養(yǎng)基參照Tremblay等[14]的方法。

1.3 引物

本試驗(yàn)中所用的引物見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)所用的引物

下劃線表示酶切位點(diǎn) The restriction enzyme cutting sites were underlined

1.4 敲除載體的構(gòu)建

參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[17]，分別使用引物fliSup F/R、fliSdown F/R擴(kuò)增基因的上游和下游片段，回收PCR液；用限制性內(nèi)切酶R I、I分別酶切上游PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pMD19T-Gm質(zhì)粒DNA，通過(guò)T4 ligase連接，將上游片段連接到pMD19T-Gm質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證，并委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序，得到質(zhì)粒pMD19T-up-Gm；同樣，將基因的下游片段連接到pMD19T-up-Gm質(zhì)粒上，得到質(zhì)粒pMD19T-up- Gm-down；用限制性內(nèi)切酶R I和d III分別酶切質(zhì)粒pMD19T-up-Gm-down和敲除載體PK18mobsacB的質(zhì)粒DNA。將up-Gm-down基因片段連接到敲除載體PK18mobsacB上，轉(zhuǎn)化，挑陽(yáng)性克隆子進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證，得到的質(zhì)粒命名為PK18-up-Gm-down，即敲除載體。

1.5 基因敲除及驗(yàn)證

基因敲除采用三親雜交的方法[18]；使用引物Gm F/R、fliS F/R、fliS F/fliSin、fliSupout/GENT3OUT、fliSdown out/GENT5OUT進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證基因是否敲除。

1.6 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建

利用引物fliS F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因片段，用限制性內(nèi)切酶I和I分別酶切目的基因片段和質(zhì)粒PBBR1MCS-2，通過(guò)T4 ligase連接，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，測(cè)序，NCBI比對(duì)，得到互補(bǔ)載體PBBR-fliS。采用三親雜交的方法將互補(bǔ)載體PBBR-fliS轉(zhuǎn)入敲除菌株1-fliS，挑選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證。

1.7 生物學(xué)測(cè)定

1.7.1 煙草過(guò)敏性反應(yīng) 參照汪新等[19]的方法，煙草葉片背面注射OD600=0.6的菌液，24 h內(nèi)觀察過(guò)敏性反應(yīng)。

1.7.2 游動(dòng)性測(cè)定 參照Tremblay等[14]的方法，取1 μl OD600=1.0細(xì)胞懸浮液點(diǎn)接于半固體M9DCAA培養(yǎng)基，28℃正置培養(yǎng)2 d或以上，比較觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)痕跡，測(cè)量游動(dòng)半徑，使用SPSS軟件中LSD法進(jìn)行單因素方差分析，比較野生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株之間的差異。

1.7.3 菌落形態(tài) 參照Bahar等[20]的方法，稀釋涂布NA平板，培養(yǎng)96 h后，于體式顯微鏡（Nikon SMZ800N）下觀察并拍照。

1.7.4 菌膜測(cè)定 參照Petrocelli等[21]的方法，略加改進(jìn)。吸取OD600=1.5菌液150 μl，加至盛有15 ml新鮮KB液體的大試管中，并在試管中放置一個(gè)玻璃片，28℃靜置培養(yǎng)。7 d后，向培養(yǎng)液中加入750 μl 1%的結(jié)晶紫染色40 min，吸出試管中液體，用蒸餾水沖洗3次，觀察被結(jié)晶紫染色的菌膜，并拍照；另外，結(jié)晶紫染色后用1 mL的95%（v/v）乙醇脫色，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)A570。

1.7.5 群體感應(yīng)測(cè)定 參照劉鵬等[22]的方法，將待測(cè)菌液調(diào)至OD600=1.5，Ecc-1為陽(yáng)性對(duì)照，每種菌液吸2 μl點(diǎn)接于ABM平板上，12 h后觀察結(jié)果。

1.7.6 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 參照陳嬌梅[23]的方法，按1﹕1 000的比例取OD600=1.5的菌液，加到50 ml新鮮的KB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，28℃振蕩培養(yǎng)，4 h后開(kāi)始取樣并測(cè)OD600，每2 h測(cè)一次，直到進(jìn)入穩(wěn)定期。

1.7.7 電鏡觀察 參照Gavin等[24]的方法，將活化后的待測(cè)菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，加無(wú)菌水沒(méi)過(guò)菌苔，靜置10 min后，將銅網(wǎng)置于菌液中吸附1—2 min，用1%磷鎢酸鉀負(fù)染后，在透射電鏡下（Hitachi，HT7700）觀察鞭毛并拍照。

1.7.8 致病性測(cè)定 甜瓜菌液浸種：參照李俊閣[25]的方法，將甜瓜種子于OD600=0.8待測(cè)菌液中浸泡20 min，放置于1%的水瓊脂上，28℃光照12 h，黑暗12 h交替培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

西瓜苗噴霧接種：參照李明明等[26]的方法，將待測(cè)菌株過(guò)夜搖培，調(diào)OD600=0.8，噴霧接種至2葉期西瓜苗，清水為對(duì)照，第3天開(kāi)始觀察發(fā)病情況。

西瓜果實(shí)接種：參照蔡學(xué)清等[27]的方法，略加改進(jìn)，用滅過(guò)菌的小槍頭針刺西瓜果皮造成傷口，將OD600=0.8的菌液用無(wú)菌棉涂抹在傷口上并將棉花敷于傷口上，清水對(duì)照。28℃培養(yǎng)，3 d后觀察發(fā)病情況。

1.8 部分鞭毛相關(guān)基因表達(dá)量分析

在菌液OD600約為1.0時(shí)，使用TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司）提取RNA。使用Promega公司的GoScriptTMReverse Transcription system和GoTaq?qPCR Mix分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。以谷氨酰胺合成酶基因?yàn)閮?nèi)參，使用Eppendorf Realplex實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 敲除菌株的獲得

通過(guò)PCR分別擴(kuò)增基因的上下游片段，并將擴(kuò)增獲得的片段分別連接到敲除載體PK18mobsacB，轉(zhuǎn)化挑取陽(yáng)性克隆子，利用引物fliSup F/fliSdown R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)凝膠電泳獲得一條大小約2 600 bp的片段，即up-Gm-down基因片段；另外，通過(guò)雙酶切得到一條約5 600 bp（PK18mobsacB）的片段和一條約2 600 bp（up-Gm-down）的片段，這表明已將基因的上下游片段連接到敲除載體PK18mobsacB上，將獲得的敲除載體命名為PK18-up-Gm-down。

通過(guò)三親雜交的方法將敲除載體PK18-up-Gm- down導(dǎo)入西瓜果斑病菌1號(hào)菌株中，挑取陽(yáng)性克隆子，用引物Gm F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增得到大小855 bp的單一條帶，表明敲除載體成功導(dǎo)入果斑病菌中；由于引物fliS F/R位于上下游片段內(nèi)部，使用其擴(kuò)增也得到大小為855 bp的條帶，為了明確被代替，在基因內(nèi)部設(shè)計(jì)fliSin引物，使用fliS F/fliSin擴(kuò)增，野生菌株可以擴(kuò)增得到約300 bp條帶，克隆子擴(kuò)增不到相應(yīng)片段，表明基因被抗性基因代替；使用引物GENT3OUT和fliSup out引物以及GENT5OUT和fliSdown out進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到大小1 031、942 bp單一條帶，說(shuō)明敲除過(guò)程中基因交換的位置和其在基因組中的位置一致；將敲除獲得的菌株命名為1-fliS。

2.2 互補(bǔ)菌株的獲得

通過(guò)PCR擴(kuò)增基因片段，并將擴(kuò)增獲得的片段連接到互補(bǔ)載體PBBR1MCS-2，轉(zhuǎn)化挑取陽(yáng)性克隆子，以fliS F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小605 bp單一片段。送生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI與西瓜噬酸菌基因組AAC00-1（GenBank登錄號(hào)NC-008752）進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果一致性為100%，互補(bǔ)載體構(gòu)建成功，命名為PBBR-fliS。

通過(guò)三親雜交的方法將互補(bǔ)載體PBBR-fliS導(dǎo)入敲除菌株1-fliS中，挑取陽(yáng)性克隆子，使用引物fliS F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小605 bp單一片段，敲除菌株1-fliS得到855 bp的單一片段，表明基因轉(zhuǎn)入敲除菌株中；用果斑病菌特異性引物SEQID5/4m擴(kuò)增，可得到與野生菌一致的單一目標(biāo)條帶；將獲得的菌株命名為1-fliShb。

2.3 生物學(xué)測(cè)定

2.3.1 煙草過(guò)敏反應(yīng) 煙草過(guò)敏反應(yīng)測(cè)定結(jié)果表明，野生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株接種煙草葉片后24 h均可觀察到壞死斑。

2.3.2 菌落形態(tài)觀察 NA平板上培養(yǎng)4 d后觀察，野生菌1號(hào)菌株，中間凸起，菌落邊緣具有一圈較透明的由細(xì)菌顫泳形成的特殊暈圈；敲除菌株1-fliS菌落邊緣較光滑，沒(méi)有暈圈形成；互補(bǔ)菌株1-fliShb菌落邊緣也能形成較透明的暈圈，但暈圈直徑較野生菌小（圖1）。

2.3.3 菌膜測(cè)定 敲除菌株1-fliS形成菌膜的能力明顯弱于野生菌1號(hào)菌株和互補(bǔ)菌株1-fliShb（圖2）；定量測(cè)定結(jié)果表明，野生菌株和互補(bǔ)菌株的菌膜之間沒(méi)有顯著差異（＞0.05），但與敲除菌株差異顯著（＜0.05）（圖3）。

2.3.4 游動(dòng)性測(cè)定 在0.3%的半固體M9DCAA培養(yǎng)基上靜置5 d后觀察，敲除菌株1-fliS相對(duì)游動(dòng)面積為0，互補(bǔ)菌株1-fliShb游動(dòng)面積略小于野生菌株（圖4），方差分析表明，野生菌株和敲除菌株以及互補(bǔ)菌株和敲除菌株游動(dòng)半徑之間均顯著差異（＜0.05）（表2），由此說(shuō)明基因與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性相關(guān)。

1號(hào)：野生菌株Wild strain；1-fliS：敲除菌株Deletion mutant；1-fliShb：互補(bǔ)菌株Complementary strain。圖2—圖11同 The same as Fig. 2- Fig. 11實(shí)心箭頭指示菌落周?chē)臅炄he solid arrow pointed to bacterial haloes

圖2 不同菌株產(chǎn)生的菌膜

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（鄧肯氏新復(fù)極差法，P＜0.05）。表2同

圖4 不同菌株的游動(dòng)性測(cè)定

2.3.5 群體感應(yīng) 陽(yáng)性對(duì)照（CK）平均顯色直徑為3.83 cm，突變菌株1-fliS及其互補(bǔ)菌株1-fliShb和野生菌1號(hào)菌株沒(méi)有明顯差異，顯色平均直徑均為0.45 cm（圖5）。說(shuō)明基因在西瓜果斑病菌1號(hào)菌株中，對(duì)病原菌的高絲氨酸內(nèi)酯類(lèi)群體感應(yīng)信號(hào)分子的分泌沒(méi)有影響。

表2 不同菌株游動(dòng)性

圖5 不同菌株的群體感應(yīng)信號(hào)測(cè)定

2.3.6 生長(zhǎng)曲線 野生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，但野生菌1號(hào)菌株的生長(zhǎng)速度最快，敲除菌株和互補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)速度較野生菌株慢，特別是生長(zhǎng)初期，這可能是由于插入外源基因，菌株在生長(zhǎng)初期受到干擾所造成的（圖6）。

圖6 西瓜果斑病菌的生長(zhǎng)曲線

2.3.7 電鏡觀測(cè) 透射電子顯微鏡（Hitachi HT7700）觀測(cè)結(jié)果顯示，敲除菌株1-fliS鞭毛長(zhǎng)度明顯比野生菌1號(hào)菌株的鞭毛短，約為其1/3—1/4；互補(bǔ)菌株1-fliShb的鞭毛長(zhǎng)度約為野生菌株的4/5，說(shuō)明互補(bǔ)后鞭毛合成能力基本恢復(fù)（圖7）。

2.3.8 致病性測(cè)定 甜瓜菌液浸種：浸種接種后4 d，野生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株處理長(zhǎng)出的幼苗子葉均出現(xiàn)水漬狀病斑；接種后8 d，野生菌株和互補(bǔ)菌株處理長(zhǎng)出的幼苗子葉全部褐變壞死，幼苗死亡，而敲除菌株1-fliS處理長(zhǎng)出的幼苗子葉發(fā)病明顯低于野生菌株和互補(bǔ)菌株，清水對(duì)照未發(fā)?。▓D8）。

西瓜苗噴霧接種：西瓜苗噴霧接種后3 d，野生菌和互補(bǔ)菌株處理的出現(xiàn)病斑，敲除菌株處理的未見(jiàn)發(fā)病，接種后5 d，野生菌株處理產(chǎn)生的病斑嚴(yán)重程度較互補(bǔ)菌株的高，但敲除菌株處理的仍未見(jiàn)病斑出現(xiàn)（圖9）。

西瓜果實(shí)接種：接種后3 d，野生菌株和互補(bǔ)菌株處理的開(kāi)始發(fā)病，敲除菌株處理和清水對(duì)照未見(jiàn)病斑，接種后5 d，敲除菌株1-fliS處理的發(fā)病程度明顯低于野生菌株和互補(bǔ)菌株處理的（圖10）。

2.4 部分鞭毛相關(guān)基因表達(dá)量分析

瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度檢測(cè)（BioDrop）結(jié)果顯示提取細(xì)菌總RNA質(zhì)量高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，基因缺失突變后，表達(dá)量明顯降低，、和表達(dá)量明顯升高，和表達(dá)量略微上升，表達(dá)量基本不變（圖11）。其中，、和表達(dá)量在基因互補(bǔ)后均有所恢復(fù)，認(rèn)為這3個(gè)基因表達(dá)量的變化可能與的缺失有直接關(guān)系。

實(shí)心箭頭表示鞭毛The solid arrow pointed to flagella

圖8 甜瓜浸種致病性測(cè)定（接種后8 d）

圖9 西瓜苗致病性測(cè)定（接種后5 d）

圖10 西瓜果實(shí)致病性測(cè)定（接種后5 d）

3 討論

研究表明，細(xì)菌的鞭毛蛋白基因與鞭毛的形成、菌株的游動(dòng)性、毒性等有著密切的關(guān)系，然而目前關(guān)于果斑病菌鞭毛蛋白基因的生物學(xué)功能還不是十分清楚。筆者課題組曾通過(guò)構(gòu)建Tn5突變體庫(kù)篩選獲得一株被插入的突變株，在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)基因定點(diǎn)敲除的方法獲得該基因的敲除突變株，結(jié)果表明該基因突變導(dǎo)致其對(duì)西瓜、甜瓜的致病性降低，游動(dòng)性、菌膜形成能力減弱等。對(duì)假結(jié)核耶爾森菌、弗氏枸櫞酸桿菌和空腸彎曲桿菌的研究結(jié)果均顯示突變菌株的游動(dòng)性明顯降低[9-11]，本研究結(jié)果也顯示突變菌株1-fliS的游動(dòng)性明顯弱于野生菌。Capdevila等[28]研究表明，鞭毛蛋白特異的胞漿伴侶蛋白基因的缺失可以引起多數(shù)FliC蛋白堆積在細(xì)胞質(zhì)形成包涵體而不能分泌出去，或FliC錯(cuò)誤聚合或不能形成穩(wěn)定的聚合體，不能運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外從而影響正常的鞭毛絲的形成，電鏡下表現(xiàn)為鞭毛的又短又細(xì)；Furukawa等[29]研究表明，缺失突變體中形成非折疊的FliC，其輸出被限制，表現(xiàn)為FliC的表達(dá)水平明顯增加，影響正常的鞭毛絲的形成，電鏡下也表現(xiàn)為鞭毛變短。本研究在對(duì)突變菌株進(jìn)行鞭毛觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，敲除菌株1-fliS的鞭毛長(zhǎng)度變短，約為野生菌株的1/3—1/4，與Capdevila等的研究結(jié)果一致[28-29]，但Yokoseki等對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變體的研究發(fā)現(xiàn)，插入突變基因?qū)е卤廾兌糖覕?shù)量增多[7-8]，這可能與細(xì)菌種類(lèi)或鞭毛調(diào)控機(jī)制差異有關(guān)，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。另外，本試驗(yàn)對(duì)缺失突變菌株和互補(bǔ)菌株實(shí)時(shí)定量PCR研究表明，缺失突變菌株表達(dá)量上升，表達(dá)量降低，而基因互補(bǔ)后，和的表達(dá)量沒(méi)有完全恢復(fù)到野生菌株的水平，在電子顯微鏡下觀察到的互補(bǔ)菌株的鞭毛長(zhǎng)度也沒(méi)能完全恢復(fù)到野生菌株?duì)顟B(tài)，筆者推測(cè)鞭毛蛋白基因通過(guò)調(diào)控和的表達(dá)從而調(diào)控果斑病菌鞭毛的形成，至于對(duì)其他鞭毛基因的影響尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖11 部分鞭毛相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

大部分植物病原細(xì)菌的致病性與菌膜形成能力呈正相關(guān)，Luo等[30]通過(guò)Tn5插入突變研究表明，果斑病菌菌膜形成能力下降導(dǎo)致該病菌的致病性降低，本研究結(jié)果顯示，基因敲除后，導(dǎo)致果斑病菌的菌膜形成能力明顯低于野生菌株，從而導(dǎo)致該病菌的致病性降低，因而，果斑病菌的鞭毛蛋白基因與果斑病菌菌膜的形成有關(guān)，是該病菌致病的重要因子。

4 結(jié)論

獲得了果斑病菌鞭毛蛋白基因的敲除菌株和互補(bǔ)菌株，敲除菌株1-fliS鞭毛變短，游動(dòng)性減弱，菌膜形成能力減弱，對(duì)西瓜、甜瓜致病力減弱。果斑病菌胞漿伴侶蛋白基因?qū)υ摬【廾暮铣伞⒕ば纬赡芰爸虏⌒缘壬飳W(xué)特性起重要作用。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Function Analysis of Flagellar Genein

YANG BingYe, Fu Dan, Hu FangPing, CAI XueQing

(College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forest University, Fuzhou 350002)

【Objective】Bacterial fruit blotch (BFB) caused by() is one of the most serious diseases in the world. Flagella are always considered as movement organ of bacteria and play an important role in their infection, and they have been reported that they could be controlled by flagellar protein gene. The function of geneinis still unclearThe objective of this study is to investigate the function of geneofineffecting on flagellum formation and pathogenicity. 【Method】 A set of primes were designed based on the genomic DNA No.1 ofwild strain. The upstream and downstream fragments knocked out genewere amplified by PCR, respectively. The gene knockout and complementary vectors were constructed through PCR amplification, recovery, digestion, connection and transformation. The strains with knockout geneand complementation were constructed with the method of triparental hybridization. Morphological characteristics of flagella, pathogenicity, hypersensitive response, motility, quorum sensing, biofilm formation, growth rate, colonial morphology, etc have been tested among the wild type, the mutant and the complementary strains. In addition, the total RNA of the bacteria was extracted, and a real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was carried out usingas an internal control for normalization. Then the expression of genes,,,,,,andin the wild type, the mutant and the complement strains were compared.【Result】The deletion mutant and complementary strain were obtained successfully by screening of gentamicin resistance and PCR verifying, named as mutant 1-fliS and complementary strain 1-fliShb. The results showed that the deletion mutant had weakened motility and biofilm formation, and the complementary strain was almost recovered. Compared with the wild strain, the pathogenicity of the mutant on watermelon and melon was reduced and the complementary strain was recovered completely. The length of flagellum of the deletion mutant was 1/3-1/4 of that of the wild strain, and the complementary strain almost recovered and it was about 4/5 of that of the wild strain. The wild strain could form typical haloes obviously by bacteria migrating via twitching on NA medium, but the deletion mutant did not form haloes on NA medium and the complementary strain recovered partially. The growth rate of deletion mutant was slower than the wild strain and the complementary strain was not recovered. There were no difference among the wild, mutant and complement strains on hypersensitive response and quorum sensing. The results of qRT-PCR showed that in the mutant the expressions of genedecreased obviously compared with the wild strain. In addition, the expressions of,andincreased obviously, the expressions ofandincreased slightly, the expressions ofwas constant compared with the wild strain, the expressions of genes,andrecovered partially in complementary strain and, the expressions of,anddid not recover. 【Conclusion】 The flagellar genecould regulate the flagellum formation, motility, biofilm formation, growth rate, colony morphology and pathogenicity of.

; bacterial fruit blotch;; biological characteristics

2017-02-08；接受日期：2017-04-05

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201003066-2）、福建省自然科學(xué)基金（2014J01084）、福建農(nóng)林大學(xué)發(fā)展基金（KF2015058）、福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)基金（CXZX2016133）

楊丙燁，E-mail：913833576@qq.com。通信作者蔡學(xué)清，E-mail：caixq90@163.com