黃 琦，徐少林，徐 磊，韓博平

(暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，廣州 510632)

廣東流溪河水庫盔型溞(Daphniagaleata)休眠種群與現(xiàn)生種群的單倍型多樣性和遺傳分化

黃 琦，徐少林，徐 磊，韓博平

(暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，廣州 510632)

休眠卵庫作為淡水枝角類生物與遺傳信息的儲藏庫，從沉積物休眠卵庫中萌發(fā)的枝角類對現(xiàn)生種群的數(shù)量與種群遺傳結(jié)構(gòu)有著直接的影響. 分別采集流溪河水庫盔型溞的現(xiàn)生種群和沉積物表層(0～10 cm)的休眠卵，擴(kuò)增現(xiàn)生種群與休眠卵的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因，構(gòu)建了單倍型網(wǎng)絡(luò). 休眠種群相比現(xiàn)生種群有著較高的單倍型多樣性和核酸多樣性，初期現(xiàn)生種群分別為0.562、0.00104，末期現(xiàn)生種群分別為0.726、0.00331，休眠種群分別為0.815、0.00761. 流溪河盔型溞現(xiàn)生種群與休眠種群存在雙向基因流，現(xiàn)生種群到休眠種群的有效遷移率為490.9，休眠種群到現(xiàn)生種群的有效遷移率為527.5. 通過構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)樹驗(yàn)證了休眠種群和現(xiàn)有種群中并不存在隱種或者亞種的分化，休眠種群與現(xiàn)生種群之間沒有出現(xiàn)較大的遺傳分化，現(xiàn)生種群遺傳多樣性來自于休眠種群，水庫的休眠種群更能反映種群真實(shí)的遺傳多樣性. 休眠種群與現(xiàn)生種群之間的基因流與休眠卵庫大小無關(guān)，與休眠卵的萌發(fā)有關(guān).

流溪河水庫；休眠卵庫；線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因；基因流；盔型溞

枝角類是淡水生態(tài)系統(tǒng)中浮游動物的重要類群，也是水體食物網(wǎng)的主要組分. 枝角類通常具有兩種生殖方式：一般情況下，枝角類以孤雌生殖為主，此時雌體所產(chǎn)的卵稱為孤雌生殖卵，因不需要受精，也稱非受精卵；在環(huán)境條件發(fā)生不利的變化(極端溫度、干旱、缺氧等)時，一些孤雌生殖卵會發(fā)育成雄體，與雙性雌體交配，進(jìn)行有性生殖，產(chǎn)生的有性生殖卵稱為休眠卵. 休眠卵在母體脫殼時，與殼瓣一同脫出，受水流及風(fēng)浪的影響漂浮至沿岸帶或者沉入水底[1]. 不同時期產(chǎn)生的具有萌發(fā)活性的休眠卵沉積到水體底部，以休眠卵的形式形成種子庫[2]. 休眠卵庫導(dǎo)致了世代周期重疊，形成了種群的存儲機(jī)制，這種機(jī)制有利于維護(hù)種群遺傳多樣性[3-4]，并在不利環(huán)境條件下，使種群在時間尺度上得到延續(xù)[5-7].

對一個具體的水體而言，我們通常是以枝角類現(xiàn)生種群為對象，通過測定現(xiàn)生種群的遺傳信息來推斷其遺傳結(jié)構(gòu). 對產(chǎn)生休眠卵的枝角類而言，由現(xiàn)生種群產(chǎn)生的這些可完好保存于底泥中的休眠卵形成了不同世代現(xiàn)生種群的種子庫，特別是位于底泥表層 2～10 cm 中的休眠卵具有較高的活性，容易獲得環(huán)境條件的直接誘導(dǎo)萌發(fā)，休眠卵萌發(fā)后形成的個體對于現(xiàn)生種群不僅是數(shù)量上的補(bǔ)充，同時也進(jìn)行了遺傳上的補(bǔ)充，這種遺傳補(bǔ)充也可稱為水體內(nèi)部發(fā)生的跨世代的基因流(持續(xù)奠基者效應(yīng))[8]，在很大程度上影響枝角類現(xiàn)生種群的遺傳多樣性和結(jié)構(gòu). 然而，枝角類在通常情況下依靠孤雌生殖來快速擴(kuò)張其種群數(shù)量，如果在缺少來自外部和休眠卵庫的持續(xù)基因流時，孤雌生殖產(chǎn)生的不同克隆系，在強(qiáng)選擇壓力下被排除在水體之外，導(dǎo)致水體現(xiàn)生種群的遺傳多樣性下降. 在時間尺度上，這一過程被稱為種群遺傳多樣性的克隆侵蝕[9]，這種現(xiàn)象在一些輪蟲和大型枝角類的研究中得到證實(shí)[10-13].

在溫帶水體，枝角類生長季節(jié)初期，卵庫中的枝角類休眠卵孵化，進(jìn)入現(xiàn)生種群，形成休眠種群到現(xiàn)生種群的基因流，增加現(xiàn)生種群遺傳多樣性，經(jīng)過整個生長季節(jié)的克隆侵蝕，現(xiàn)生種群遺傳多樣性下降并通過有性生殖產(chǎn)生的休眠卵進(jìn)入休眠卵庫，形成現(xiàn)生種群到休眠種群的基因流，因此，休眠種群與現(xiàn)生種群存在一個雙向的基因流過程[9]. 在熱帶亞熱帶水庫中，由于全年的水溫較高，有利于枝角類在水體中常年存在，但誘導(dǎo)枝角類形成休眠卵的外部條件不如溫帶水體強(qiáng)烈，休眠卵庫在規(guī)模上(保存的種類少、數(shù)量低)也大大小于溫帶水體[14]. 另一方面，熱帶和亞熱帶水庫的枝角類面臨魚類的選擇壓力要強(qiáng)于溫帶地區(qū)，在夏季魚類捕食壓力達(dá)到最大時，大型枝角類種群數(shù)量降至最低時(常規(guī)采樣難以獲得)[15-16]，大型枝角類以小種群通過垂直遷移的方式逃避魚類捕食[16]. 因此，在熱帶亞熱帶大型深水水庫中，根據(jù)大型枝角類休眠卵庫對現(xiàn)生種群的補(bǔ)充相對較弱[16]，即休眠種群到現(xiàn)生種群的基因流較弱，同時，魚類捕食壓力較強(qiáng)，現(xiàn)生種群面臨的克隆侵蝕較強(qiáng)，我們推斷現(xiàn)生種群與休眠種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性會存在較大差異. 本文以熱帶水庫——廣東流溪河水庫大型枝角類盔型溞(Daphniagaleata)為研究對象，利用線粒體DNA信息，比較分析盔形溞現(xiàn)生種群和休眠種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性是否存在較大差異.

1 材料與方法

1.1 樣本采集與DNA提取

于2010年5月，在廣東省流溪河水庫枝角類豐度較高的敞水區(qū)，同時考慮沉積特點(diǎn)選擇采樣點(diǎn)(23°45′N，113°46′E)，使用Uwitec柱狀采泥器(奧地利)采集沉積物. 分別采集4～5柱保存較好的沉積物，沉積物長度為30～40 cm. 每柱沉積物取表層10 cm現(xiàn)場切割后轉(zhuǎn)移至封口袋中，為避免由于采泥器PVC柱子滑動造成不同泥層間的沉積物交叉污染，泥層外圍的沉積物切割后需要舍棄[17-18]. 切割后的樣品分別用孔徑為600、200和35 μm的網(wǎng)篩依次過濾篩選，過濾后殘留的液體轉(zhuǎn)移至100 ml塑料小白瓶中，保存于4℃冰箱中. 分離出含有休眠卵的殘余液體在20～50倍放大的解剖鏡(Olympus SZX71)和顯微鏡(Olympus CX21)下進(jìn)行觀察，挑取盔型溞休眠卵[19]，并轉(zhuǎn)移至無水乙醇中于4℃下保存. 現(xiàn)生種群使用 110 μm浮游生物網(wǎng)定性拖網(wǎng)采集，現(xiàn)場用 75%乙醇固定. 帶回實(shí)驗(yàn)室，鏡檢后置換無水乙醇，并置于 4℃下保存. DNA的提取參考Montero-Pau等[20]和徐磊等[21]的方法，使用試劑盒提取溞屬DNA.

1.2 線粒體COI序列擴(kuò)增與測序

COI基因擴(kuò)增引物為ZplankF1(TGTAAAACGACGGCCAGTTCTASWAATCATAARGATATTGG)和ZplankR1(CAGGAAACAGCTATGACTTCAGGRTGRCCRAARAATCA)[22]. 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為30 μl，包括：3 μl 10×buffer(Mg2+plus)，dNTP Mixture 2.5 mmol/L，引物各0.5 μmol/L， 0.5 U Taq酶(TaKaRa)和3 μl模板DNA. 擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性1 min， 94℃變性40 s， 51℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃ 3 min 充分延伸4℃結(jié)束. 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，選取目的條帶清晰且亮度大的PCR反應(yīng)產(chǎn)物送華諾基因進(jìn)行測序. 所有樣品均采用雙向測序，正反向互補(bǔ)拼接后得到較完整序列. 現(xiàn)生種群和休眠種群提取DNA個體數(shù)為20～30個個體或休眠卵.

1.3 數(shù)據(jù)處理及系統(tǒng)學(xué)分析

1.3.1 數(shù)據(jù)處理 測序獲得的COI基因序列先在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索比對以保證序列的可靠性. 用BioEdit 7[23]軟件及其附帶的Clustal W比對軟件將實(shí)驗(yàn)獲得的和GenBanK中下載的COI基因序列進(jìn)行同源比對，獲得的COI基因序列用于分析. 單倍型多樣性及核算多樣性等在DnaSP 5.10軟件[24]中分析計(jì)算. 遺傳差異度在MEGA 6.06軟件[25]中分析，其中COI基因序列遺傳差異度采用Kimura雙參模型(Kimura 2-parameter)計(jì)算；變異估算方法為自舉法(bootstrapping method)，運(yùn)行次數(shù)為1000；核苷酸替代包括轉(zhuǎn)換和顛換，序列間位點(diǎn)選擇相同進(jìn)化率，刪除缺失位點(diǎn). 在HAPLOVIEWER中構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖[26]. 根據(jù)溞屬枝角類線粒體基因的突變率[27]，使用 Migrate-n version 3.6軟件計(jì)算有效群體大小(Ne)及群體間的長期有效遷移率M(M=m/μ，m為每世代有效種群遷移率，μ為供點(diǎn)突變率)，判斷種群間基因流強(qiáng)度分析使用 Bayesian MCMC 方法(迭代次數(shù)為10000，重復(fù)計(jì)算5次，加熱方案為默認(rèn)的 1.0、1.5、3、1000000). 有效種群大小是指在一個理想種群中，和該種群隨機(jī)遺傳漂變下的等位基因傳播或者近親繁殖等同的個體數(shù)量.

1.3.2 系統(tǒng)學(xué)分析 構(gòu)建COI系統(tǒng)樹之前，將獲得的所有序列用 Mrmodeltest 2.3 軟件進(jìn)行AIC最適核酸替換模型篩選[28]，選用MrBayes v. 3.1.2[29-30]構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)樹. 詳細(xì)參數(shù)設(shè)置如下：同時起始4條馬爾科夫鏈，即3條熱鏈和l條冷鏈，以隨機(jī)樹為起始樹，共運(yùn)行1000000代，每100代抽樣1次，重復(fù)1次. 在舍棄老化樣本后，根據(jù)剩余的樣本構(gòu)建一致樹. 以后驗(yàn)概率來表示各分支的置信度， 95%以上為接受PP值，認(rèn)定為可靠分支. 外類群選自長刺溞復(fù)合種(Daphnialongispinacomplex)中的Daphniadentifera和Daphnialongispina，序列來自NCBI(登錄號為KM555366；EF375860). 分析完成的系統(tǒng)樹通過treeviewv. 1.6.6[31]展示.

2 結(jié)果

2.1 COI基因分歧度和單倍型

共獲得71條COI序列(每條COI基因序列對應(yīng)1個個體)，長度為581 bp，其中初期現(xiàn)生種群24個，末期現(xiàn)生種群20個，休眠種群27個(表1). COI基因序列比對結(jié)果顯示序列可識別位點(diǎn)(包括缺失與丟失的位點(diǎn))581個，其中保守位點(diǎn)546個，變異位點(diǎn)35個，單一位點(diǎn)23個，簡約信息點(diǎn)12個. 基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算的初期現(xiàn)生種群遺傳差異度為0.1%，末期現(xiàn)生種群遺傳差異度為0.33%，休眠種群的遺傳差異度為0.77%，初期和末期現(xiàn)生種群與休眠種群間的遺傳差異度均為0.6%，初期現(xiàn)生種群與末期現(xiàn)生種群間的遺傳差異度為0.2%(表2). 初期現(xiàn)生種群、末期現(xiàn)生種群和休眠種群的單倍型多樣性分別為0.562、0.726和0.815：核酸多樣性分別為0.00104、0.00331和0.00761(表1). 現(xiàn)生種群獲得的44條COI基因序列和休眠種群獲得的27條COI基因序列共產(chǎn)生15個單倍型(圖1).

表1 流溪河水庫盔型溞現(xiàn)生種群和休眠種群的單倍型多樣性和核酸多樣性

2.2 基因流

通過Migrate-n version 3.6軟件基于溯祖理論對種群間基因流水平進(jìn)行分析，并使用群體間的長期有效遷移率M對基因流強(qiáng)度進(jìn)行描述.M值衡量的是在一定突變率下，每個世代遷入的個體對整個種群遺傳變異的影響程度. 分析發(fā)現(xiàn)休眠種群的有效種群為192107，休眠種群到現(xiàn)生種群的M值為527.5，現(xiàn)生種群的有效種群為7285，現(xiàn)生種群到休眠種群的M值為490.9，流溪河盔型溞現(xiàn)生種群與休眠種群存在雙向較強(qiáng)的基因流.

表2 流溪河水庫盔形溞現(xiàn)生種群和休眠種群種間和種內(nèi)的遺傳差異度(%)

圖1 基于COI基因序列構(gòu)建的盔型溞現(xiàn)生種群和休眠種群的單倍型網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Haplotype network for the dormant and active populations of Daphnia galeata with mitochondria COI gene sequences

2.3 系統(tǒng)學(xué)分析

由貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖2)可知，休眠種群與現(xiàn)生種群間并未出現(xiàn)較大分化，且并不存在隱種或者亞種的分化.

圖2 基于COI基因序列構(gòu)建盔形溞現(xiàn)生種群和休眠種群貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹(pop1為休眠種群；pop2為末期現(xiàn)生種群；pop3為初期現(xiàn)生種群)Fig.2 Bayes tree for the dormant and active populations of Daphnia galeata with mitochondria COI gene sequences (pop1 is dormant population; pop2 is end active population; pop3 is initial active population)

3 討論

3.1 休眠種群與現(xiàn)生種群的單倍型多樣性

流溪河盔型溞的休眠種群相比現(xiàn)生種群有著較高的單倍型多樣性(克隆多樣性)(圖1和表1)，這與休眠卵庫的形成過程和補(bǔ)充機(jī)制有關(guān). 當(dāng)一個水體新形成時，不同水體的盔型溞孤雌生殖個體或者休眠卵通過水流、鳥類遷徙、人類活動等途徑進(jìn)入水體，通過快速的孤雌生殖方式，快速占據(jù)水體中的生態(tài)位，形成穩(wěn)定種群(克隆系組成)，直到生長季節(jié)末期，水溫或其他水環(huán)境條件發(fā)生改變，盔型溞通過有性生殖產(chǎn)生休眠卵，進(jìn)入休眠卵庫. 春季枝角類生長季節(jié)初期，底泥中的休眠卵隨著水體全同溫水流擾動等影響，遷移至水層區(qū)或沿岸帶萌發(fā)誘導(dǎo)，萌發(fā)后的盔型溞通過孤雌生殖形成現(xiàn)生種群. 最終，休眠種群與現(xiàn)生種群形成一個動態(tài)平衡過程，而隨后外源新遷入的盔型溞(新的克隆系)面臨現(xiàn)生種群的競爭優(yōu)勢與該生境下的選擇壓力，難以直接形成有效的基因流進(jìn)入現(xiàn)生種群[32]，更多是以休眠卵的形式保存在底泥中，等待獲得萌發(fā)的機(jī)會，經(jīng)過長期的積累，使得休眠種群具有較高的遺傳多樣性(克隆多樣性).

與休眠種群不同，現(xiàn)生種群在生長季節(jié)初期完全依賴于休眠種群的補(bǔ)充，即休眠種群的萌發(fā)，決定了生長季節(jié)初期現(xiàn)生種群的遺傳結(jié)構(gòu). 流溪河水庫處于在我國熱帶亞熱帶地區(qū)，枝角類群落結(jié)構(gòu)以及所面臨的選擇壓力與溫帶湖泊都有著明顯的區(qū)別[15-16]. 由于全年的水溫較高，有利于一些枝角類種類的種群在水體中常年存在，誘導(dǎo)枝角類形成休眠卵的外部條件(如低溫)不如溫帶水體強(qiáng)烈，導(dǎo)致熱帶水體休眠卵庫相對較小[14]. 此外，我國熱帶亞熱帶地區(qū)的水庫受人為控制水量(防洪、發(fā)電和灌溉等)的影響，休眠卵庫的動態(tài)變化與水庫的水文過程有著更為緊密的聯(lián)系. 特別是受季風(fēng)氣候影響降水較為集中的雨季，水庫水位波動和水滯留時間變化較大，沿岸帶形成的休眠卵被水流沖刷帶入敞水區(qū)，因此而減小接觸孵化刺激的機(jī)會. 而在敞水區(qū)形成的休眠卵卻很少有機(jī)會進(jìn)入淺水區(qū)，現(xiàn)生種群和休眠種群的種群數(shù)量都會受水流沖刷帶來的平流損失的影響，從而使得現(xiàn)生種群缺失來自于休眠卵庫的持續(xù)補(bǔ)充[33-34]. 另一方面，熱帶亞熱帶水庫中，魚類捕食壓力較強(qiáng)，枝角類生長季節(jié)較短[15]，枝角類現(xiàn)生種群的遺傳多樣性面臨的克隆侵蝕較強(qiáng). 而本文所采集的現(xiàn)生種群為生長季節(jié)初期和末期種群，在經(jīng)歷了整個生長季節(jié)的克隆侵蝕后[9,35]，現(xiàn)生種群的單倍型多樣性降至最低，因此，流溪河盔型溞的休眠種群相比現(xiàn)生種群有著較高的單倍型多樣性(克隆多樣性).

3.2 休眠種群與現(xiàn)生種群的基因流

我們假設(shè)在熱帶亞熱帶大型深水水庫中，由于大型枝角類休眠卵數(shù)量較小(密度為103～104ind./m2)，比溫度地區(qū)水體低1～2個數(shù)量級[14]，休眠種群對現(xiàn)生種群的補(bǔ)充相對較弱，即休眠種群到現(xiàn)生種群的基因流較弱，然而，研究結(jié)果顯示，流溪河盔型溞現(xiàn)生種群與休眠種群存在雙向較強(qiáng)的基因流，現(xiàn)生種群到休眠種群的M值為490.9，休眠種群到現(xiàn)生種群的M值為527.5，這與我們的推斷不同，由此可見，休眠種群到現(xiàn)生種群的基因流與休眠卵庫大小無關(guān)，但與休眠卵的萌發(fā)有關(guān). 不同時期的現(xiàn)生種群單倍型多樣性對比發(fā)現(xiàn)，生長季節(jié)初期現(xiàn)生種群的單倍型多樣性低于生長季節(jié)末期，可見，整個生長季節(jié)過程中，休眠卵不斷從休眠卵庫萌發(fā)，補(bǔ)充進(jìn)入現(xiàn)生種群. 溫帶地區(qū)的研究表明，溞屬枝角類休眠卵的萌發(fā)主要與水溫有關(guān)，孵化時間與水溫呈負(fù)相關(guān). 以蚤狀溞(Daphniapulex)為例，當(dāng)水溫為7℃時，孵化時間在10 d以上，當(dāng)水溫達(dá)到12℃時，孵化時間為7～10 d，而當(dāng)水溫達(dá)到15℃時，孵化時間為3～6 d，對于大型溞(Daphniamagna)，前7 d的萌發(fā)率達(dá)到66%，15 d的萌發(fā)率更是高達(dá)81.9%，由休眠卵孵化的個體中，至少有57%的個體可以發(fā)育為成體，完成一次孤雌生殖[36-40]. 如此高的休眠卵萌發(fā)效率，使得在溫帶及高海拔分布的溞屬枝角類休眠種群可以在湖泊冰層消失之后的兩周內(nèi)迅速萌發(fā)，進(jìn)入現(xiàn)生種群[41]. 在流溪河水庫，冬季(12-2月)底層平均水溫為13℃，而在枝角類生長季節(jié)初期(2月末，3月初)底層平均水溫可達(dá)15℃以上，意味著盔型溞的休眠卵可以達(dá)到最適萌發(fā)條件，并在短時間內(nèi)完成萌發(fā)，因此，較高的萌發(fā)率和較短的萌發(fā)時間使得盔型溞的休眠種群可以在短時間內(nèi)進(jìn)入現(xiàn)生種群. 盔型溞現(xiàn)生種群在經(jīng)歷了整個生長季節(jié)的克隆侵蝕后，在生長季節(jié)末期，盔型溞又通過有性生殖產(chǎn)生休眠卵，進(jìn)入底泥，從而形成現(xiàn)生種群到休眠種群的基因流. 可見，流溪河盔型溞現(xiàn)生種群與休眠種群始終存在雙向的基因流，因此，休眠種群與現(xiàn)生種群沒有出現(xiàn)較大的遺傳分化，現(xiàn)生種群遺傳多樣性來自于休眠種群，因此，在水庫中，休眠種群更能反映種群真實(shí)的遺傳多樣性.

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Haplotype diversity and genetic differentiation of dormant and active populations ofDaphniagaleatain Liuxihe Reservoir of Guangdong Province, southern China

HUANG Qi, XU Shaolin, XU Lei**& HAN Boping

(DepartmentofEcology,JinanUniversity,Guangzhou510632,P.R.China)

The dormant egg bank in sediments has been regarded as a pool of species diversity and genetic information of freshwater Cladocera. Hatchings from the sediments strongly and directly affect the abundance and genetic structure of active population of Cladocera. In the present study, we sampled the active population in water column and picked up dormant eggs ofDaphniagaleatain the top 10 cm of the sediment in Liuxihe Reservoir. We used cytochrome C oxidase subunit I gene to reveal the haplotype diversity and genetic differentiation of active and dormant populations ofDaphniagaleatain the reservoir. Our results showed the dormant population had higher haplotype diversity and nucleotide diversity than the active population. The haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.562 and 0.00104 for the initial active population, 0.726 and 0.00331 for the end active population, and 0.815 and 0.00761 for the dormant population, respectively. The coalescent calculation suggested that there was a bi-directional gene flow between the active and dormant populations: the effective migration rate was 490.9 from active population to dormant population and 527.5 from dormant population to active population. We did not find hidden or subspecies differentiation in the dormant population and the active population by means of a Bayesian system tree. No significant genetic differentiation between the dormant population and the active population suggested that the genetic diversity of the active population was contributed by the dormant population. Therefore, the dormant population reflects the total genetic diversity of populations in the reservoir. The gene flow between the dormant and active populations was related to the hatching of dormant eggs rather than the size of the dormant eggs.

Liuxihe Reservoir; dormant egg bank; cytochrome C oxidase subunit I gene; gene flow;Daphniagaleata

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400344, 30970467)資助. 2016-10-21收稿; 2017-01-15收修改稿. 黃琦(1995～)，女，碩士研究生； E-mail: qqhuang@yeah.net.

； E-mail: cloud_xu@hotmail.com.

DOI 10.18307/2017.0519