程 賓 張紅宇 何道慧 王 莉

1.云南省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650011；2.云南省食品藥品監(jiān)督管理局藥品和醫(yī)療器械審評中心，云南 昆明 650101

血塞通注射液指紋圖譜的聚類分析及溶血性相關(guān)分析

程 賓1張紅宇1何道慧2王 莉1

1.云南省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650011；2.云南省食品藥品監(jiān)督管理局藥品和醫(yī)療器械審評中心，云南 昆明 650101

目的：研究血塞通注射液的HPLC指紋圖譜，并進行聚類分析，探討品種的聚類分析與溶血性的相關(guān)性。方法：建立血塞通注射液的HPLC指紋圖譜，對10批樣品相對峰面積進行聚類，并進行溶血率測定。結(jié)果：根據(jù)聚類分析結(jié)果，可將血塞通注射液樣品分為3類，與溶血性測定結(jié)果相似。結(jié)論：血塞通注射液的HPLC指紋圖譜聚類分析結(jié)果與溶血性結(jié)果有一定相關(guān)性。

指紋圖譜；溶血性；聚類分析

血塞通注射液主要成份為三七總皂苷，具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)的功效，主要用于中風偏癱、瘀血阻絡(luò)證，動脈粥樣硬化性血栓性腦梗塞、腦栓塞、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞見瘀血阻絡(luò)證者。該品種臨床應(yīng)用廣泛，但皂苷是一類表面活性劑，有很強的乳化力，可使紅細胞破裂給機體帶來嚴重危害，其溶血引起的不良反應(yīng)在臨床上也時有報道[1-2]，因此筆者以化學(xué)指紋圖譜技術(shù)展現(xiàn)不同廠家血塞通注射液化學(xué)成分的差異，以期尋找到影響血塞通注射液溶血性的主要化學(xué)成分。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀( Waters 2996二極管陣列檢測器，Empower pro色譜工作站，Waters公司)；SUB28恒溫水浴(Grant Instrument Ltd. England)；TLM16M型高速冷凍離心機(湘儀離心機廠)；LD4-2離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；UV-2550 PC型紫外分光光度計(島津儀器)；DHG-9075 A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 材料 氯化鈉注射液(500 mL/瓶；500mL：4.5g；批號：A100205p2；昆明南疆制藥有限公司)，乙腈為色譜純，水為高純水。供試品共來源于五個企業(yè)，每個企業(yè)兩批樣品。見表1。

表1 血塞通注射液樣品來源

1.3 實驗動物 普通級日本大耳白兔，1.7～3.0kg/只，日常行為體征無異常，由昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK[滇]2005—0008，發(fā)證機關(guān)：云南省科學(xué)技術(shù)廳；實驗動物使用許可證：SYXK(滇)2005—0005，發(fā)證機關(guān)：云南省科學(xué)技術(shù)廳。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；檢測波長203nm；流速1.5mL/min；柱溫為25 ℃；流動相：A相為乙腈，B相為水，線性梯度洗脫，0～20min保持A∶B=20∶80,20～45min線性至A∶B=46∶54,45～55min線性至A∶B=55∶45,55～60min保持A∶B=55∶45。

2.2 供試品溶液的制備 分別精密吸取格批樣品，加70%甲醇稀釋至含三七總皂苷2.5mg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.3 測定方法 各供試品溶液進樣10μL,在上述色譜條件下進行分離測定，記錄色譜圖。以各色譜峰保留時間為分子，參照物保留時間為分母，計算各色譜峰的相對保留時間；以各色譜峰峰面積為分子，以參照物峰面積為分母，計算各色譜峰的相對峰面積值。見表2。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣5次，考察主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，其RSD均小于1%，儀器精密度良好。

2.4.2 重現(xiàn)性試驗 取同一樣品5份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，考察主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，其RSD均小于2%，指紋圖譜的全貌無明顯變化，符合指紋圖譜要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液,分別在0、2、4、8、16、24、48h進樣，考察主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，其RSD均小于2%，表明樣品在48h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.5 不同來源血塞通注射液HPLC指紋圖譜分析

2.5.1 HPLC指紋圖譜的測定 取不同企業(yè)血塞通注射液按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下條件測定并記錄色譜圖，每個企業(yè)取兩批樣品。不同企業(yè)的血塞通注射液色譜圖中主要有24個色譜峰，其中6個色譜峰分別在不同企業(yè)的血塞通注射液中未檢測到，其余19個色譜峰在各企業(yè)樣品中均可檢測到。以各樣品均含有且峰面積較大的第2號色譜峰(人參皂苷Rg1)為參照峰，計算各樣品的相對峰面積見表2。不同血塞通樣品的典型色譜圖見圖1。

表2 不同樣品色譜峰的相對峰面積

注：峰1為三七皂苷R1；峰2為人參皂苷Rg1；峰3為人參皂苷Re；峰7為人參皂苷Rb1；峰14為人參皂苷Rd

2.5.2 指紋圖譜系統(tǒng)聚類分析 采用SPSS統(tǒng)計軟件對上述指紋圖譜數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析(Ward`s method)，以相對峰面積值為變量，以歐氏距離( Euclidean distance) 對樣品聚類，結(jié)果見圖2，橫坐標為樣品間的距離系數(shù)，縱坐標為樣品編號。由圖2可以看出：樣品間距離設(shè)為5時，10個樣品聚為3類，第一類包含樣品B、F、G、D、I，第二類包含樣品E、H、A、J，樣品C單獨為一類，結(jié)果與其溶血性測定結(jié)果有一定的相關(guān)性。

2.6 溶血性實驗 參考《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩⅧ B中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則[3]和中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則方法[4]，采用紫外分光光度法測定吸光度值。

2.6.1 紅細胞混懸液的配制 兔心臟取血4 mL，用玻璃珠去纖維蛋白原使成脫纖血，加氯化鈉注射液，搖勻，離心15 min(1000r/min)，棄上清液，沉淀的紅細胞用氯化鈉注射液同上法洗滌3 次，至上清液不呈紅色，取沉淀紅細胞1 mL，加氯化鈉注射液稀釋至50 mL，混勻，即為2 %紅細胞混懸液，備用，用時混勻。

2.6.2 供試品溶液配制 取血塞通注射液用氯化鈉注射液稀釋制成20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL 3個濃度作為供試液。

2.6.3 試驗方法 每批次樣品每濃度分別取潔凈試管6 支，1、2號管為樣品管，3、4號管為陰性對照管，5、6號管為陽性對照管，按表3所示，依次加入2 %紅細胞混懸液、氯化鈉注射液或蒸餾水和相應(yīng)濃度供試液，混勻，于37 ℃溫育，3h后取出，離心5 min(1000r/min)，采用分光光度法測定各管吸光度值。見表3。

表3 溶血試驗加樣比例

2.6.4 試驗結(jié)果 以兩平行管吸光度平均值帶入公式：溶血率(%)=(樣品管-陰性管)吸光度值/(陽性管-陰性管)吸光度值×100 %，計算溶血率，重復(fù)試驗，結(jié)果詳見表4。

從表4可見，溶血率從高到低的樣品順序為：H>E>A>J>C>G>D>F>B>I。

表4 血塞通注射液溶血性實驗結(jié)果

2.7 相關(guān)性分析 指紋圖譜聚類分析和溶血性實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)二者之間有一定的相關(guān)性。聚類分析結(jié)果中相似度較大的樣品溶血性也相近，如樣品H、E、A、J溶血率均大于5%，其聚類分析結(jié)果該四個樣品聚為一類；樣品C溶血率為4.982%，聚類分析顯示提高距離可以與樣品H、E、A、J聚為一類；樣品G、D、F、B、I溶血率均小于3%，聚類分析將該五個樣品聚為一類。從化學(xué)組成來看，血塞通注射液由三七總皂苷制成，其主要成份為：人參皂苷Rb1、Rg1、Re、Rd,三七皂苷R1等，而溶血性是皂苷的特性之一，致使中藥注射劑產(chǎn)生溶血不良反應(yīng)，從各個供試品的人參皂苷Rb1、Rg1、Re、Rd和三七皂苷R1的相對峰面積及溶血性的結(jié)果來看，兩者之間無明顯的相關(guān)性；但是通過全譜的聚類分析后，可以明顯看出溶血率相似的樣品均被聚為同類，結(jié)果表明一些含量較低的成分可能也會對其溶血不良反應(yīng)起到促進作用，但實際工作中較難控制，需要進一步對各個單體成分與溶血率的關(guān)系進行研究。

3 討論

溶血與凝聚是滅菌制劑安全性質(zhì)量控制指標之一，隨著國家對注射劑安全性的重視程度日漸增加，尤其是中藥注射劑，溶血與凝聚已被列為中藥注射液安全性必檢項目之一，常規(guī)的溶血實驗方法為以2%兔血紅細胞混懸液與供試液混合，保溫，目測溶血與凝聚的情況來做出判斷或保溫后離心取上清液進行UV測定并計算溶血率。筆者采用指紋圖譜技術(shù)分析中藥注射液中的成分，并結(jié)合溶血性實驗結(jié)果進行相關(guān)分析，可以快速鎖定溶血率較高的樣品。此方法適用于成分復(fù)雜、未知成分多的中藥研究，可以大大縮短研究時間，節(jié)約研究成本，是溶血性物質(zhì)研究方法或模式的新嘗試。

[1]常曉紅，申麗萍，張藜莉，等.44例血塞通注射劑不良反應(yīng)文獻分析[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2008，8(4)：304-305.

[2]彭遼宇，覃宗升，廖燕平.血塞通注射液不良反應(yīng)83例分析[J].廣西醫(yī)學(xué)，2007，29(3)：394-395.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄132.

[4]國家食品藥品監(jiān)督管理總局.中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[S].指導(dǎo)原則編號[Z]GPT4-1，2005.

Correlation Analysis on Hierarchical Cluster Analysis of Xuesaitong Injection`s Fingerprint and Hemolytic

CHENG Bin1ZHANG Hongyu1HE Daohui2WANG Li1

1.Yunnan Institute for Food and Drug Control, Kunming 650011,China;2.Center for Drug and Medical Device Evaluation,Kunming 650101,China

Objective To investigate HPLC fingerprint of Xuesaitong injection, get the result of hierarchical cluster analysis, and discuss the correlation analysis on hierarchical cluster analysis and hemolytic.Methods HPLC fingerprint of Xuesaitong injection was established, relative peak area of 10 sample were applied to grade by Hierarchical Cluster Analysis, and calculate hemolytic rate.Results The Xuesaitong injection could be divided into three grades through the result s of hierarchical cluster analysis, which it`s similar to hemolytic determination results.Conclusion The result of Xuesaitong injection`s fingerprint hierarchical cluster and hemolytic have a certain correlation.

Fingerprint;Hemolytic;Hierarchical cluster analysis

程賓(1976-)，男，漢族，碩士，副主任藥師，研究方向為食品藥品檢驗檢測。E-mail: 46049141@qq.com

R927.11

A

1007-8517(2017)15-0032-04

2017-05-31 編輯：程鵬飛)