吳平平

【摘要】 目的 探討納米囊制劑對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞的影響。方法 采用溶劑揮發(fā)法制備共載中藥甘草酸（GA）及化療藥物柔紅霉素（DNR）的納米囊， 將其分為P-gp Ab修飾共載中藥GA及化療藥物DNR組（A組）；P-gp Ab修飾裝載DNR化療藥物組（B組）；DNR化療藥物組（C組）；DNR+GA組（D組）；P-gp Ab修飾納米囊空載組（E組）；GA組（F組）；生理鹽水對(duì)照組（G組）。采用體外四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒作用（白血病多藥耐藥細(xì)胞K562/A02）， 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況， 采用化學(xué)發(fā)光自顯影免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）的表達(dá)。結(jié)果 A組的K562/A02的半抑制濃度指數(shù)（IC50）為（3.65±1.06）， 其降低效果優(yōu)于其他組（P<0.05）。B組IC50為（3.12±0.96）， 低于C、D、F組的（0.95±0.04）、（0.96±0.03）、（0.94±0.05）（P<0.05）。C、D、F組的耐藥指數(shù)（RE）均接近1， 故認(rèn)為對(duì)K562/A02的細(xì)胞無(wú)增強(qiáng)耐藥作用， 也無(wú)毒性作用。E組和G組為對(duì)照組， 檢測(cè)到的細(xì)胞掉凋亡率較小， 不計(jì)入比較。A組的細(xì)胞總凋亡率高于其他各組（P<0.05）。B組的細(xì)胞凋亡率高于C、D、F組（P<0.05）。A組的Bcl-2的表達(dá)低于其他各組， Bax的表達(dá)高于其他各組（P<0.05）。E組和G組的Bcl-2表達(dá)均高于其他各組， Bax的表達(dá)均低于其他各組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 納米囊制劑對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞具有細(xì)胞毒性， 中藥GA+化療藥物DNR具有明顯的協(xié)同效果， 其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax表達(dá)與下調(diào)Bcl-2有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 納米囊制劑；白細(xì)胞；多藥耐藥；K562/A02；體外實(shí)驗(yàn)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.23.002

In vitro experimental study of effects of nanocapsules on multidrug resistance of leukemia cells WU Ping-ping. Department of Internal Medicine-Oncology， Jiangsu Province Tumor Hospital， Nanjing 210009， China

【Abstract】 Objective To investigate the effect of nanocapsules on multidrug resistance of leukemia cells. Methods Nanocapsules containing Chinese medicine glycyrrhizin （GA） and chemotherapy drug daunorubicin （DNR） were prepared by solvent evaporation method. They were divided into P-gp Ab modified loading traditional Chinese medicine GA and chemotherapy drug DNR group （group A） and P-gp Ab modified loading DNR chemotherapy group （group B）， DNR chemotherapy drug group （group C）， DNR+GA group （group D），

P-gp Ab modified nanocapsules empty group （group E）， GA group （group F） and saline control group（group G）. The cytotoxicity （leukemia multidrug resistance cell K562 / A02） was evaluated by methylthio tetrazole （MTT） colorimetric assay， apoptosis was detected by flow cytometry， and the expression of B-cellymphoma-2 associated X protein （Bax） and B-cellymphoma-2 （Bcl-2） were detected by chemiluminescence autoradiography （Western Blot）. Results Group A had semi inhibitory concentration index （IC50） of K562/A02 as （3.65±1.06）， and its reduction effect was better than the other groups （P<0.05）. Group B had IC50 as （3.12±0.96）， which were lower than （0.95±0.04）， （0.96±0.03） and （0.94±0.05） in group C， group D and group F （P<0.05）. The resistance factor （RI） of group C， D and F was close to 1， so it was considered that the K562/A02 cells had no enhanced drug resistance and non-toxic effect. Group E and group G as the control group， their detected cell outage rate was small， so they were not included in the comparison. Group A had higher total cell apoptosis rate than the other groups （P<0.05）. Group B had higher cell apoptosis rate than group C， group D and group F （P<0.05）. Group A had lower expression of Bcl-2 than the other groups， and higher expression of Bax than the other groups （P<0.05）. Group E and group G had higher expression of Bcl-2 than the other groups， and lower expression of Bax than the other groups. Their difference was statistical significant （P<0.05）. Conclusion Nanocapsules can be cytotoxic to leukemia multidrug resistance cells， and the Chinese medicine GA+ chemotherapy drug DNR has obvious synergistic effect， and its mechanism may be related to up-regulation of Bax expression and down-regulation of Bcl-2 expression.

【Key words】 Nanocapsules； White blood cell； Multidrug resistance； K562/A02； In vitro experiment

白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病， 其原因不明， 發(fā)病率居惡性腫瘤的第六位。化療是治療白血病的首選治療方法， 但由于腫瘤多藥耐藥性現(xiàn)象的出現(xiàn)， 化療失敗以及難治性白血病時(shí)有發(fā)生。尋找低毒高效的白血病多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。納米粒是一種新型的藥物載體系統(tǒng)， 其能改變藥物在人體內(nèi)的分布， 可延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間 [1]。本研究旨在納米囊制劑對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞的影響， 以期為白血病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞株 白血病多藥耐藥細(xì)胞K562/A02（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供）。

1. 2 試劑與儀器

1. 2. 1 主要試劑 IMDM培養(yǎng)基， 胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）， 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒（武漢博士的生物制藥有限公司）， 兔抗人P-gp抗體（Abcam， 美國(guó)）， B淋巴細(xì)胞瘤-2基因、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白上下引物（上海英維捷基有限公司）， 二甲基亞砜（DMSO， Sigma， 純度>99%， 美國(guó)）， MTT（AMRESCO， 美國(guó)）， 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（日本同仁公司）等。

1. 2. 2 主要儀器 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）， 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）， 熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad 公司， CFX96型）， 倒置生物顯微鏡（日本尼康 TS100-F）， 冷凍離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf 公司）， SDS 凝膠電泳槽（大連競(jìng)邁生物）等。

1. 3 方法

1. 3. 1 納米囊制劑的制備 采用溶劑揮發(fā)法制備共載中藥GA及化療藥物DNR的納米囊， 采用差速離心分離法可對(duì)納米囊進(jìn)行不同粒徑的分離和篩選， 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要收集直徑<1000 nm的納米囊溶液樣品， 進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)分析和研究。戊二醛交聯(lián)法構(gòu)建P-gp Ab偶聯(lián)納米囊。將其分為P-gp Ab修飾共載中藥GA及化療藥物DNR組（A組）；P-gp Ab修飾裝載DNR化療藥物組（B組）；DNR化療藥物組（C組）；DNR+GA組（D組）；P-gp Ab修飾納米囊空載組（E組）；GA組（F組）；生理鹽水對(duì)照組（G組）。

1. 3. 2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 白血病多藥耐藥細(xì)胞K562/A02， 置于含有10% 新生牛血清的RPMI 1640（鏈霉素100 μg/ml、青霉素100 IU/ml）培養(yǎng)基中， 于含有5%二氧化碳、95%濕度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 3. 3 細(xì)胞毒性測(cè)定 采用MTT法[2]測(cè)定波長(zhǎng)為540 nm， 繪制生長(zhǎng)曲線， 計(jì)算IC50及RF。

1. 3. 4 細(xì)胞凋亡 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況， 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/A02細(xì)胞， 加入6孔板內(nèi)， 根據(jù)分組的情況加入不同藥物。培養(yǎng)24 h。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次， 加入相關(guān)藥物混勻后， 4℃避光保存。

1. 3. 5 Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá) 采用Western Blot檢測(cè)， 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/A02細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞濃度， 收集細(xì)胞。按照常規(guī)方法裂解細(xì)胞提取總蛋白， 二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度， 將聚偏氟乙烯（PVDF）膜置于其中封閉2 h。一抗4℃過(guò)夜， 加入二抗后室溫孵育 2 h， 將PVDF膜從一抗中取出TBS-T中漂洗3次， 以凝膠成像儀對(duì)條帶進(jìn)行成像， 用Image圖像分析軟件計(jì)算的灰度值。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 納米囊制劑的細(xì)胞毒性作用 A組的K562/A02的IC50為（3.65±1.06）， 其降低效果優(yōu)于其他組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B組IC50為（3.12±0.96）， 低于C、D、F組的（0.95±0.04）、（0.96±0.03）、（0.94±0.05）， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C、D、F組的RF均接近1， 故認(rèn)為對(duì)K562/A02的細(xì)胞無(wú)增強(qiáng)耐藥作用， 也無(wú)毒性作用。

2. 2 納米囊制劑對(duì)耐藥細(xì)胞K562/A02凋亡率的影響 E組和G組為對(duì)照組， 檢測(cè)到的細(xì)胞掉凋亡率較小， 不計(jì)入比較。A組的細(xì)胞總凋亡率高于其他各組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B組的細(xì)胞凋亡率高于C、D、F組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 3 納米囊制劑對(duì)耐藥細(xì)胞K562/A02細(xì)胞Bax、Bcl-2的表達(dá)的影響 A組的Bcl-2的表達(dá)低于其他各組， Bax的表達(dá)高于其他各組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。E組和G組的Bcl-2表達(dá)均高于其他各組， Bax的表達(dá)均低于其他各組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

多藥耐藥可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)化療藥物的敏感性較低， 是白血病化療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因， 已經(jīng)成為臨床上亟待解決的問(wèn)題。多藥耐藥的作用與酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 抗凋亡通路激活和抗凋亡基因表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞凋亡受到細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控， 該類蛋白分為兩種， 促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。當(dāng)兩種蛋白比例失衡時(shí)容易引發(fā)細(xì)胞凋亡[3， 4]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白， 通過(guò)其編碼的Bcl-2蛋白而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bax是一種抗凋亡蛋白， 其表達(dá)水平增高時(shí)責(zé)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2決定細(xì)胞是生存還是凋亡。通過(guò)藥物干預(yù)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)， 調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑， 以減少細(xì)胞凋亡， 可能會(huì)成為克服多藥耐藥醫(yī)學(xué)難題的重要突破點(diǎn)。

本研究采用納米囊制劑對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)， P-gp Ab修飾共載中藥GA及化療藥物DNR對(duì)耐藥菌株K562/A02細(xì)胞毒性較強(qiáng)， 能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡， 效果均好于化療DNR+中藥組、單純中藥組、單純化療DNR組以及P-gp Ab修飾裝載DNR化療藥物組， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納米粒子是指粒度在1～100 nm之間的粒子， 粒徑小且分布窄， 容易穿過(guò)生理屏障， 達(dá)到藥物本身無(wú)法到達(dá)的地方， 并具有緩、控釋作用， 不僅藥物作用時(shí)間長(zhǎng)， 而且可主動(dòng)達(dá)到鞭向部位[5， 6]。納米載體治療已經(jīng)成為抗腫瘤藥物的新興熱點(diǎn)， 其無(wú)論單方藥還是復(fù)方藥均可包載。中藥逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的作用已經(jīng)陸續(xù)被報(bào)道， 其可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性， 抑制外排泵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性[7， 8]。本研究采用P-gp Ab修飾共載中藥GA及化療藥物DNR對(duì)白血病耐藥菌株K562/A02的逆轉(zhuǎn)效果好。

綜上所述， 納米囊制劑對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞具有細(xì)胞毒性， 中藥GA+化療藥物DNR具有明顯的協(xié)同效果， 其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax表達(dá)與下調(diào)Bcl-2有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉苒. 轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的新型多聚物載藥納米粒的研制及靶向逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的體外研究. 東南大學(xué)， 2015.

[2] 李秀軍， 姚宇紅， 嚴(yán)魯萍. 干擾素對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞HL60/VCR的影響. 廣東醫(yī)學(xué)， 2014（12）：1836-1837.

[3] 李秀軍， 姚宇紅， 嚴(yán)魯萍. 干擾素對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞HL60/VCR的影響// 中西醫(yī)結(jié)合血液高峰論壇， 2014：1836-1837.

[4] 林婷， 廖斌， 徐成波， 等. 中藥復(fù)方君子湯聯(lián)合阿霉素逆轉(zhuǎn)白血病K562/VCR細(xì)胞多藥耐藥及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 34（1）：95-100.

[5] 廖斌， 葛仁英， 徐成波， 等. 中藥復(fù)方君子湯對(duì)白血病細(xì)胞株K562/VCR耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用. 康復(fù)學(xué)報(bào)， 2011， 21（4）：9-12.

[6] 何玉芳. 川芎嗪主動(dòng)靶向納米粒逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用研究. 大連醫(yī)科大學(xué)， 2013.

[7] 劉向陽(yáng). 多肽殼聚糖川芎嗪納米粒逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥作用研究. 大連醫(yī)科大學(xué)， 2016.

[8] 吳玉強(qiáng)， 薛文翰. 中藥逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞多藥耐藥的研究進(jìn)展. 甘肅醫(yī)藥， 2016， 35（4）：267-269.

[收稿日期：2017-05-19]