方曉麗

（平陽縣疾病預(yù)防控制中心，浙江平陽325400）

超高效液相色譜法測(cè)定飲料中6種合成色素

方曉麗

（平陽縣疾病預(yù)防控制中心，浙江平陽325400）

建立超高效液相色譜同時(shí)測(cè)定飲料中6種人工合成色素（檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)）的方法。飲料用聚酰胺粉吸附色素，除去雜質(zhì)后用乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）洗脫色素，以甲醇-0.02 mol/L乙酸銨為流動(dòng)相，梯度洗脫，在ACQUITY UPLCRBEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱上分離，在254 nm波長處檢測(cè)。6種色素分離效果良好，線性范圍寬，相關(guān)系數(shù)r≥0.999 5，實(shí)際樣品加標(biāo)回收率為82.2%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%～4.6%。

超高效液相色譜；合成色素；飲料

飲料是日常生活中的常見飲品，市場(chǎng)上色彩斑斕的飲料數(shù)量眾多，但這些外觀絢麗的飲料大部分人為添加了各種色素，其中尤以人工合成色素為多。人工合成色素大多為含有苯環(huán)或氧雜蒽結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，結(jié)構(gòu)上分為：偶氮色素，如檸檬黃、誘惑紅等；三苯甲烷系色素，如亮藍(lán)等；氧雜蒽色素，如赤蘚紅等。研究表明，人工合成色素過量食用對(duì)人體有害，甚至對(duì)兒童智力產(chǎn)生不利影響，部分偶氮類的合成色素已被證明有致癌作用，GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]也明確規(guī)定了飲料中各種人工合成色素允許的最大允許添加量，但由于與天然色素相比，人工合成色素因價(jià)格便宜、色澤鮮艷、色調(diào)多樣、性質(zhì)穩(wěn)定而被生產(chǎn)廠家更廣泛使用并時(shí)有過量添加的現(xiàn)象曝光，所以建立人工合成色素的快速有效檢測(cè)方法對(duì)市場(chǎng)飲料安全及消費(fèi)者權(quán)益維護(hù)均有重要意義。

大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道采用液相色譜法[2-4]檢測(cè)人工合成色素。國標(biāo)GB/T 5009.35-2003《食品中合成色素的測(cè)定》[5]第一法是高效液相色譜法，但沒有給出同時(shí)檢測(cè)含誘惑紅在內(nèi)的多種合成色素的方法。最新公布的標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.141-2003《食品中誘惑紅的測(cè)定》[6]規(guī)定誘惑紅的檢測(cè)方法為紙色譜法，此方法操作麻煩，檢出限高（取樣量10 g，檢出限為25 mg/kg），已經(jīng)超出了某些食品的最大允許添加量（如肉灌腸類為15 mg/kg），無法滿足日常檢測(cè)工作的需要。普通液相色譜法在多目標(biāo)物檢測(cè)時(shí)，往往存在分離困難、分析時(shí)間長、試劑消耗量大等問題，且國標(biāo)采用同一波長（254 nm）檢測(cè)不同色素，特異性不強(qiáng)，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本文建立的超高效液相色譜法采用二極管陣列檢測(cè)器，可掃描分離物全波段的紫外吸收光譜，顯著降低假陽性結(jié)果出現(xiàn)的概率，且與普通液相色譜相比，超高效液相色譜采用了小顆粒雜化填料（1.7 μm），極大地提高了分離度，從而有效提高了分析速度和靈敏度，適用于飲料中多種人工合成色素同時(shí)檢測(cè)，對(duì)其他類食品中合成色素的檢測(cè)也有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY UPLC-CLASS超高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器：美國WATERS公司；SQP萬分之一天平：賽利多斯公司；5430R高速冷凍離心機(jī)：CEN TRIFU公司；Milli-Q Direce純水處理器：德國默克密理博公司。

1.2 試劑

甲醇（色譜純）：默克股份有限公司；乙醇（分析純）：安徽安特食品有限公司；乙酸銨（分析純）、冰乙酸（分析純）、聚酰胺粉（100目～200目）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；氨水（分析純）：西隴化工有限公司；甲酸（分析純）：上海化學(xué)試劑總廠；檸檬酸（分析純）：無錫市民豐試劑廠；試驗(yàn)用水為超純水；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品：百靈威試劑公司。

1.3 樣品

5種飲料樣品均購于正規(guī)超市，分別為蘋果醋飲料（1#）、橙味汽水（2#）、維生素飲料（3#）、葡萄味汽水（4#）、果粒橙飲料（5#）。

1.4 樣品處理

吸取10.0mL樣品于150mL燒杯中，碳酸飲料需經(jīng)15 min超聲脫氣，有沉淀的果汁飲料應(yīng)先5 000 r/min離心5 min。加入約1g聚酰胺粉，攪拌片刻，以G3垂融漏斗抽慮，用pH=4的水洗4次，然后用甲醇-乙酸（9∶1，體積比）混合溶液洗4次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）混合溶液解吸4次，每次約5 mL，收集解吸液至150 mL錐形瓶中，蒸發(fā)至近干，用純水定容至10mL，過0.22μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.5 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCR BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長：254 nm；流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣量：5.0 μL；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為0.02 mol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

為使前處理過程盡量簡(jiǎn)便，本試驗(yàn)嘗試將樣品直接過0.22 μm濾膜后即上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明，1#～4#樣品可過0.22 μm濾膜，但檢測(cè)顯示目標(biāo)峰附近有較多干擾，且樣品中的未知成分可能有損色譜柱和整個(gè)色譜系統(tǒng)，因此樣品需經(jīng)處理后上機(jī)，處理過程參考國標(biāo)GB/T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測(cè)定》[5]，并對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 樣品pH值

聚酰胺粉只有在酸性條件下才可完全吸附色素。經(jīng)檢測(cè)，試驗(yàn)選取的飲料樣品呈弱酸性，直接加聚酰胺粉色素即可被完全吸附，若選取的飲料呈堿性，則需用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值到6左右。

2.1.2 吸附溫度

試驗(yàn)表明，樣品在室溫下和加熱至60℃聚酰胺粉吸附率無顯著差異，故樣品無需加熱。

2.1.3 雜質(zhì)洗脫

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，本試驗(yàn)選用乙酸-甲醇（1 ∶9，體積比）洗脫雜質(zhì)，目標(biāo)物的回收率優(yōu)于國標(biāo)法（國標(biāo)法所用的洗脫液甲醇-甲酸（6∶4，體積比）洗脫雜質(zhì)，洗脫液呈藍(lán)色，檢測(cè)結(jié)果顯示有部分色素被洗脫）。

2.1.4 解析液蒸發(fā)

收集的解吸液需除去氨水和乙醇，本試驗(yàn)將解吸液直接蒸發(fā)至近干即可完全除去氨水和乙醇，相較于國標(biāo)先中和后蒸發(fā)的方法更為簡(jiǎn)便，且不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

2.2 色譜分析條件選擇

2.2.1 檢測(cè)波長的選擇

由于色素的特殊結(jié)構(gòu)，其不僅在紫外區(qū)有吸收，在可見光區(qū)也有最大吸收。國標(biāo)及大多數(shù)文獻(xiàn)選用254 nm為6種色素的檢測(cè)波長，考慮到檢測(cè)靈敏度的問題，也有選擇626 nm為亮藍(lán)的檢測(cè)波長。本試驗(yàn)在210 nm～700 nm進(jìn)行光譜掃描，考察并比較了6種色素在可見光區(qū)的最大吸收波長和254 nm波長處的信號(hào)值響應(yīng)比（見表2），結(jié)果顯示僅亮藍(lán)在兩波長處的響應(yīng)值有較大差別，為避免多波長檢測(cè)時(shí)數(shù)據(jù)處理的繁瑣，初選254 nm作為檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落紅和誘惑紅的檢測(cè)波長，以626 nm為亮藍(lán)的檢測(cè)波長，但后期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)亮藍(lán)在626 nm波長處的線性范圍為0.10 mg/L～10.0 mg/L，檢測(cè)上限濃度太低，只適合低濃度目標(biāo)物的測(cè)定，考慮到國標(biāo)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]規(guī)定飲料類食品中亮藍(lán)所允許的最大添加量為0.02 g/kg，而亮藍(lán)在254 nm處的線性范圍為1.00 mg/L～200 mg/L，既能滿足一般樣品檢測(cè)靈敏度的要求，高濃度的樣品無需稀釋即可進(jìn)行樣品處理，因此選擇254 nm為6種色素的檢測(cè)波長。

表2 6種合成色素在254 nm和最大吸收波長處的信號(hào)值響應(yīng)比Table 2 Signal value response ratio of six kinds of synthetic pigment at 254 nm and maximum absorption wavelength

2.2.2 色譜分離條件

色譜柱的選擇及流動(dòng)相的設(shè)置極大地影響了目標(biāo)物分離效果。ACQUITY UPLC○R BEH C18色譜柱適用的pH值范圍為1～12，本試驗(yàn)上機(jī)液近中性，0.02 mol/L乙酸銨流動(dòng)相pH=4，此色譜柱可滿足試驗(yàn)要求。試驗(yàn)還考察了色譜柱長度對(duì)分離效果的影響，6種合成色素在不同長度（150、100、50 mm）色譜柱上均可較好分離，但選用50 mm色譜柱可大大縮短分析時(shí)間，且相同流量下短柱柱壓低，可減小色譜柱損耗。試驗(yàn)表明，飲料樣品經(jīng)前處理后，檢測(cè)時(shí)可適當(dāng)提高流動(dòng)相中有機(jī)相的含量，使目標(biāo)峰較早出峰，因此甲醇初始比例設(shè)為13%，經(jīng)多次優(yōu)化梯度洗脫程序后，6種色素混標(biāo)溶液的分離效果良好，分離時(shí)間僅為2.2 min（見圖1），有效地節(jié)約了分析時(shí)間，試驗(yàn)將檢測(cè)時(shí)間延長至5 min，是為使柱壓穩(wěn)定不影響下個(gè)樣品的進(jìn)樣以及考慮到樣品中可能存在較晚出現(xiàn)的雜質(zhì)峰。

2.2.3 檢測(cè)器

普通的紫外檢測(cè)器以色譜峰保留時(shí)間作為定性的唯一依據(jù)，此定性方法在樣品檢測(cè)中存在風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)使用的二極管陣列檢測(cè)器（PDA）可獲得色譜分離組分全波段的紫外吸收光譜圖，為分析者提供更準(zhǔn)確的定性信息。以4#樣品為例，首先以保留時(shí)間定性，樣品檢出的色素有檸檬黃、莧菜紅和亮藍(lán)，再提取目標(biāo)峰的紫外吸收光譜圖，結(jié)果顯示，樣品檢出物和標(biāo)樣紫外吸收光譜圖基本一致（4#樣品和標(biāo)樣紫外吸收光譜圖分別見圖2和圖3），提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 檸檬黃（20.0mg/L）、莧菜紅（30.0mg/L）、胭脂紅（20.0mg/L）、日落黃（20.0mg/L）、誘惑紅（80.0mg/L）、亮藍(lán)（80.0mg/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of Tartrazine（20.0 mg/L），Amaranth（30.0 mg/L），Ponceau 4R（20.0 mg/L），Sunset yellow（20.0 mg/L），Allura Red（80.0 mg/L），Brilliant Blue（80.0 mg/L）standard

圖2 4#樣品紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorption spectra of 4#sample

圖3 檸檬黃、莧菜紅、亮藍(lán)標(biāo)樣紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectra of Tartrazine，Amaranth，Brilliant Blue standard

2.3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

在試驗(yàn)條件下，對(duì)6種色素的標(biāo)準(zhǔn)系列混合溶液進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的線性回歸方程，同時(shí)以3倍信噪比考察了6種色素的檢出限，具體結(jié)果見表3。

表3 6種合成色素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linearity range，calibration curve，correlation and detection limit of six synthetic pigments

由表3可知，6種合成色素線性范圍寬，線性關(guān)系良好，檢出限低。

2.4 樣品測(cè)定、回收率及精密度試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法分別測(cè)定1#～5#飲料中的6種合成色素含量，結(jié)果顯示1#～4#樣品均不同程度地添加了人工合成色素，實(shí)際測(cè)出的色素種類與樣品標(biāo)簽一致，測(cè)定值均低于國標(biāo)[1]規(guī)定允許的最大添加量。做加標(biāo)回收試驗(yàn)時(shí)加標(biāo)量對(duì)回收率的影響較大，本試驗(yàn)參考張虹的文獻(xiàn)報(bào)道[8]并結(jié)合試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，確定加標(biāo)量如下：對(duì)于飲料中檢出的色素，加標(biāo)量分別為本底值的50%、100%和200%；未檢出的色素加標(biāo)量為線性范圍內(nèi)低、中、高3種濃度。每個(gè)添加水平平行添加3份，計(jì)算回收率，每份測(cè)定6次，計(jì)算精密度，詳細(xì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。實(shí)際樣品的色譜圖和加標(biāo)色譜圖分別見圖4和圖5。

表4 6種合成色素的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precision of the six pigments in spiked samples（n=6）

圖4 1#樣品譜圖Fig.4 Chromatogram of 1#sample

圖5 1#樣品加標(biāo)譜圖Fig.5 Chromatogram of 1#spiked sample

3 結(jié)論

本試驗(yàn)方法采用超高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)飲料樣品中6種人工合成色素，試驗(yàn)過程處理較國標(biāo)法有所優(yōu)化，分離效果、回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果令人滿意，顯著降低了假陽性結(jié)果出現(xiàn)的概率，大大節(jié)約了分析時(shí)間（單個(gè)樣品分析時(shí)間僅需5 min），有效地減少了試劑消耗（單個(gè)樣品檢測(cè)流動(dòng)相消耗為1.50 mL），綜上，本試驗(yàn)方法可作為檢測(cè)飲料中上述6種人工合成色素的切實(shí)可行的檢測(cè)分析方法。

[1]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 2760-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社.2015

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[3] 李幫銳,馮家力,潘振球,等.高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定飲料中的人工合成色素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(4):579-580

[4] 崔小軍.關(guān)于運(yùn)用HPLC同時(shí)測(cè)定飲料中安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸以及合成色素的研究[J].食品研究與開發(fā),2004,25(3):117-118

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[6]中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.141-2003食品中誘惑紅的測(cè)定[S].2004

[7] 閆正,李盈辰,張玉.改良聚酰胺吸附-高效毛細(xì)管電泳內(nèi)標(biāo)法測(cè)定飲料中的亮藍(lán)和莧菜紅[J].色譜,2010,28(12):1185-1188

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Simultaneous Determination of Six Synthetic Pigments in Beverage with Ultra High Performance Liquid Chromatography

FANG Xiao-li
（Pingyang Center for Disease Control and Prevention，Pingyang 325400，Zhejiang，China）

An ultra-high performance liquid chromatography （UPLC）method was developed for the simultaneous determination of six kinds of synthetic pigment，including Tartrazine，Amaranth，Ponceau 4R，Sunset yellow，Allura red，Brilliant blue in beverage samples.Synthetic pigments were adsorbed by polyamide，eluted by ethanol-ammonia-water（7 ∶2 ∶1，volume ratio）after the removal of impurities，separated on an ACQUITYUPLCRBEH C18column（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）in gradient elution mode using a mobile phase made up of methanol and 0.02mol/L ammonium acetate，and detected at 254 nm.The method had good effect in separating six kinds of pigment.The calibration curves had wide linearity range with correlation coefficient r≥0.999 5.The recoveries in spiked samples were in the range of 82.2%-104.5%and the relative standard deviations（RSD）were 0.04%-4.6%.

ultra high performance liquid chromatography；synthetic pigments；beverage samples

2016-12-23

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.034

方曉麗（1986—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品和生活飲用水理化檢測(cè)。