朱碧紅+張慧芳+林鐲+張磊+董培紅+潘珍珍+陳永平

[摘要] 目的 探討大鼠肝纖維化組織中骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）的表達趨勢及意義。 方法 用皮下注射四氯化碳構建大鼠肝纖維化模型，造模后4周、8周、12周分別檢測血清層粘蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）的變化，采用HE及Masson染色光學顯微鏡下觀察肝組織損傷情況，采用Real-Time PCR、免疫組織化學和Western印跡檢測各組大鼠肝組織中BMP-2的表達。采用單因素方差分析進行多組均數(shù)間的比較。 結果 肝纖維化模型組血清LN、HA明顯升高。在對照組和肝纖維化模型組中BMP-2 mRNA均有表達。模型組4周時BMP-2 mRNA表達與對照組無顯著差異（P>0.05），模型組8周、12周較對照組顯著下降（P均<0.05）。與模型組4周相比，模型組BMP-2 mRNA的表達在8周、12周顯著下降（P均<0.05），12周達最低。免疫組織化學證實，BMP-2在肝纖維化模型組較對照組大鼠肝組織中表達減少。在對照組和肝纖維化模型組中BMP-2蛋白均有表達。模型組4周時BMP-2蛋白表達與對照組無顯著差異（P>0.05），模型組8周、12周較對照組顯著下降（P均<0.05）。與模型組4周相比，模型組BMP-2蛋白的表達在8周、12周顯著下降（P均<0.05），12周達最低。 結論 BMP-2在正常SD大鼠肝臟有表達，隨著肝纖維化進展，表達減少，提示BMP-2參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程。

[關鍵詞] 骨形成蛋白2；肝纖維化；四氯化碳；大鼠

[中圖分類號] R575.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）20-0032-04

[Abstract] Objective To explore the expression and significance of bone morphogenetic protein-2（BMP-2） in rats models of hepatic fibrosis. Methods SD rat models with hepatic fibrosis were established by injecting carbon tetrachloride（CCl4）. Serum laminin（LN） and hyaluronic acid（HA） levels were tested from hepatic fibrosis group at the time of 4 week， 8 week， 12 week. Pathological characters of liver tissue were observed under optical microscope after hematoxylin-eosin and Masson staining. And the expressions of BMP-2 were detected by the methods of Real-Time polymerase chain reaction（Real-Time PCR）， immunohistochemistry and Western blot in rat fibrosis tissues. Comparisons between groups were analyzed by one-way ANOVA. Results LN and HA in model group were significantly higher than those in control group. All of normal control group and hepatic fibrosis groups expressed BMP-2 mRNA. Compared with control group， the expression of BMP-2 mRNA of the model group at week 4 had no significant difference， but were significantly lower at week 8 to 12. Compared with model group at week 4， the expression of BMP-2 mRNA of the model group at week 8 to 12 decreased significantly， and reached the nadir at week 12. Immunohistochemistry proved that the expressions of BMP-2 in hepatic fibrosis groups were all significantly lower than control group. All of normal control group and hepatic fibrosis groups expressed BMP-2 protein. Compared with control group， the expression of BMP-2 protein of the model group at week 4 had no significant difference， but were significantly lower at week 8 to 12. Compared with model group at week 4， the expression of BMP-2 protein of the model group at week 8 to 12 decreased significantly， and reached the nadir at week 12. Conclusion BMP-2 expressed in the liver of normal SD rats， and decreased along with the progress of hepatic fibrosis. These indicated that BMP-2 might be involed in the pathogenesis and development of hepatic fibrosis.

[Key words] Bone morphogenetic protein-2； Hepatic fibrosis； Carbon tetrachloride； Rats

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是由各種致病因子（如肝炎病毒、乙醇、自身免疫、化學毒物或藥物等）引起的肝臟損傷和炎癥，導致細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過量沉積，是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)之階段。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）可影響多種細胞的增殖、分化和凋亡，參與組織的再生和修復，屬于TGF-β超家族成員[1]。骨形成蛋白2（BMP-2）是其中研究最活躍的成員之一[2]，已知具有調(diào)控細胞生長、分化及骨質(zhì)生成等功能，與肝纖維化的關系研究甚少。本研究通過觀察BMP-2在大鼠肝纖維化模型中的動態(tài)表達，初步探討B(tài)MP-2在肝纖維化進程中的可能作用，為進一步研究其作用機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑

清潔級24只健康雄性SD大鼠，體重（200±10）g，由上海劍鈍生物科技有限公司提供。HE染色和Masson染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；放射免疫沉淀法（RIPA）組織細胞快速裂解液購自基爾頓生物科技（上海）有限公司；SYBR Green PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自Thermo公司；BMP-2免疫組織化學試劑盒購自Abcam公司；GAPDH購自CST公司；HRP標記的抗兔（鼠）IgG購自上海碧云天公司；DAB濃縮型試劑盒購自上海長島生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化模型的制備和取材 清潔級喂養(yǎng)SD大鼠，隨機分為正常對照組6只，肝纖維化模型組18只。肝纖維化模型組給予皮下注射40%的四氯化碳溶液0.3 mL/100 g，每周3次，持續(xù)注射12周。正常對照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，每周3次，持續(xù)注射12周。肝纖維化模型組大鼠分別于4、8、12周處死，正常對照組于12周處死，留取血清和肝臟組織-80℃保存；部分肝組織以10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制備組織切片。

1.2.2 肝臟組織病理學檢查 HE染色和Masson染色肝組織石蠟切片后，光學顯微鏡下觀察肝組織病理改變情況。按2000年《病毒性肝炎防治方案》中慢性肝炎的分期標準，判定肝纖維化程度，若出現(xiàn)正常肝小葉結構破壞或消失，增生的纖維組織分隔、包繞肝細胞，纖維間隔見大量炎癥細胞及成纖維細胞等浸潤，表明肝纖維化模型成功建立。

1.2.3 肝纖維化指標檢測 放射免疫法測定大鼠血清LN和HA的變化。

1.2.4 Real-Time PCR檢測大鼠肝組織BMP-2 mRNA的表達 取適量-80℃冷凍肝組織標本，按試劑盒說明書抽提總RNA，反轉錄合成cDNA。Real-Time PCR擴增BMP-2 mRNA。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照基因。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。BMP-2上游引物：5'-CTGTCCCTACTGATGAGTTTC-3'，下游引物：5'-CTAACCTGGTGTCCAATAGTC-3'，產(chǎn)物長度174 bp。GAPDH上游引物：5'-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物：5'-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'，產(chǎn)物長度181 bp。用2 -△△CT值表示mRNA的相對表達量。

1.2.5 免疫組織化學法檢測肝組織BMP-2的表達 將經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋標本制成5 μm厚的切片。采用過氧化物酶標記鏈霉親和素（SP）法。60℃烤片，脫蠟水化，3%過氧化氫溶液溫育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，高壓修復，冷卻后滴加BMP-2一抗，4℃溫育過夜。滴加二抗及SP試劑，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，用IMS圖像分析系統(tǒng)測量肝組織平均吸光度值（積分吸光度/組織面積）代表蛋白表達水平。

1.2.6 Western blot法檢測肝組織BMP-2的表達 采用RIPA快速裂解液抽提各組大鼠肝組織總蛋白，于-80℃保存。BMP-2一抗?jié)舛劝?：1000稀釋，GAPDH一抗?jié)舛劝?：1500稀釋。二抗均為1：1000稀釋，ECL 增強化學發(fā)光法顯示蛋白條帶，顯影、定影后保存圖像。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用（x±s）表示。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布者多組間比較采用單因素方差分析，樣本方差齊性用Levene法檢驗，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者用Dunnett T3檢驗。雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝臟病理組織學變化

大鼠肝組織經(jīng)HE及Masson染色后，普通光學顯微鏡下觀察：正常對照組肝小葉結構清楚，肝細胞形態(tài)正常，以小葉中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝小葉內(nèi)未見纖維組織形成，無炎癥細胞浸潤。肝纖維化模型組肝小葉結構破壞或消失，增生的纖維組織分隔、包繞肝細胞，部分肝細胞核大或雙核，有壞死出血，纖維間隔見炎癥細胞浸潤。見封三圖1、圖2。

2.2各組大鼠血清LN、HA檢測結果

肝纖維化模型組血清LN、HA逐漸升高，于12周時達高峰，與正常對照組比較，肝纖維化模型組各時間點LN、HA的差異均有統(tǒng)計學意義（LN的t值分別為-9.387，-12.310，-22.710；HA的t值分別為-104.110，-177.660，-284.110，P均<0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肝組織中BMP-2 mRNA的表達

對照組和肝纖維化模型組中BMP-2 mRNA均有表達。模型組4周時BMP-2 mRNA表達與對照組無顯著差異（t=0.004，P>0.05），模型組8周、12周較對照組顯著下降（P均<0.05）。與模型組4周相比，模型組BMP-2 mRNA的表達在8周、12周顯著下降（P均<0.05），12周達最低。見表2。

2.4免疫組織化學檢測結果

BMP-2在各組大鼠肝組織中均有陽性表達，表現(xiàn)為細胞質(zhì)內(nèi)棕黑色或棕黃色顆粒沉積。與對照組相比，BMP-2在肝纖維化模型組12周時表達細胞數(shù)最少且著色最淡。見封三圖3。

2.5各組大鼠肝組織BMP-2蛋白的表達

Western blot法檢測結果顯示，在對照組和肝纖維化模型組中BMP-2蛋白均有表達。模型組4周時BMP-2蛋白表達與對照組無顯著差異（t=-0.068，P>0.05），模型組8周、12周較對照組顯著下降（P均<0.05）。與模型組4周相比，模型組8周、12周顯著下降（P均<0.05），12周達最低。這與Real-Time PCR檢測BMP-2 mRNA表達結果一致。見表3，圖1。

3討論

肝纖維化是肝臟對慢性損傷的一種修復反應。任何破壞肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程如炎癥、化學毒物和毒性藥物、先天性代謝障礙、先天性異常等均可導致肝纖維化，引起細胞外基質(zhì)（ECM）、細胞群和細胞因子的復雜改變[3]，出現(xiàn)肝臟內(nèi)纖維結締組織異常沉積[4，5]，過度的纖維化最終導致肝硬化、門靜脈高壓和肝衰竭[6]。CCl4是氯化烷烴類化合物，可選擇性損害肝、腎功能，誘導形成的化學性肝纖維化動物模型與人類肝纖維化病程相似。

骨形成蛋白2（BMP-2）是天然骨形成蛋白提取物中最主要的形式，位于第20號染色體p12區(qū)，是影響免疫調(diào)節(jié)、細胞增殖、分化和凋亡的重要因子[7]。目前對BMP-2的研究大多集中在骨骼系統(tǒng)、肺、腎、眼、惡性腫瘤等方面[8，9]。體外實驗表明，BMP-2可影響成骨細胞的增殖和分化[10-12]。Shlyonsky V等[13]報道BMP-2參與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程。在人動脈粥樣硬化的鈣化斑中已經(jīng)檢測到了BMP-2 mRNA，推測BMP-2與動脈粥樣硬化密切相關[14]。Yang YL等[15]認為BMP-2通過延緩間質(zhì)-上皮細胞轉化（EMT）抑制腎間質(zhì)纖維化。姚海佩等[16]認為在眼科諸多纖維化疾病如角膜潰瘍、青光眼等中，BMP-2參與了不同的功能性細胞轉分化成為成纖維細胞的過程，并抑制纖維化進程。有研究報道，BMP-2參與胰腺炎的炎癥、纖維化反應[17]，通過Smad1信號通路拮抗TGF-β的作用抑制胰腺纖維化[18]。BMP-2通過AKT和ERK信號通路在胃癌中進行上皮間質(zhì)轉化，從而促進胃癌的侵襲和轉移[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)BMP-2 在正常對照組大鼠肝組織中有表達，在CCl4誘導建立大鼠肝纖維化模型的初期，即模型組4周時，大鼠肝組織中BMP-2 表達與對照組無顯著差異，隨著大鼠肝纖維化的加重，模型組8周、12周BMP-2表達逐漸減少，12周達最低。免疫組織化學證實，BMP-2在肝纖維化模型組較對照組大鼠肝組織中表達減少。綜上所述，考慮BMP-2可能參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程，并與肝纖維化的嚴重程度密切相關。這與姚頤等[20]研究發(fā)現(xiàn)的隨著腎纖維化的進展，BMP-2表達顯著下調(diào)的結果相似。

肝纖維化是諸多慢性肝病共同的病理過程，存在復雜的細胞因子網(wǎng)路調(diào)控。肝纖維化機制的研究是為肝纖維化治療提供依據(jù)。本實驗結果表明，BMP-2在正常SD大鼠肝臟有表達，隨著肝纖維化進展，表達減少，提示BMP-2參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程，在肝纖維化中可能扮演抑制的角色。但BMP-2如何影響纖維化基因表達與組織纖維化的分子機制，尚有待進一步的研究。

[參考文獻]

[1] Heldin CH，Miyazono K.TGF-β signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins[J]. Nature，1997，390（6659）：465-471.

[2] Yoshioka Y，Ono M，Osaki M，et al.Differential effects of inhibition of bone morphogenic protein（BMP） signaling on T-cell activation and differentiation[J]. Eur J Immunol，2012，42（3）：749-759.

[3] Tsukada S，Parsons CJ，Rippe RA.Mechanisms of liver brosis[J].Clinica Acta，2006，364（1-2）：33-60.

[4] 程明亮，楊長青.肝纖維化的基礎研究及臨床[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：156-157.

[5] Pinzani M，Marra F，Carloni V.Singnal transduction in hepatic stellate cells[J].Liver，1998，18（1）：2-13.

[6] Cho YA，Noh K，Jue SS，et al.Melatonin promotes hepatic differentiation of human dental pulp stem cells： Clinical implications for the prevention of liver fibrosis[J].Journal of Pineal Research，2015，58（1）：127-135.

[7] Hager-Theodorides AL，Outram SV，Shah DK，et al.Bone morphogenetic protein 2/4 signaling regulates early thymocyte differentiation[J]. J Immunol，2002，169（10）：5496-5504.

[8] Miron RJ，Saulacic N，Buser D，et al.Osteoblast proliferation and differentiation on a barrier membrane in combination with BMP2 and TGFβ1[J].Clin Oral Investig，2013， 17（3）：981-988.

[9] Rogers MB，Shah TA，Shaikh NN. Turning bone morphogenetic protein 2（BMP2） on and off in Mesenchymal Cells[J]. Journal of Cellular Biochemistry，2015，116（10）：2127-2138.

[10] Lind M，Deleuran B，Thestrup-Pedersen K，et al.Chemotaxis of human osteoblast：Effects of ostcotropic growth factors[J].APMIS，1995，103（2）：140-146.

[11] 蔣琳，周鵬飛，王佳，等.BMPs-ERK5信號通路調(diào)控人牙周膜干細胞成骨分化的研究[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2016，38（7）：718-725.

[12] 周俊，王兆晶，陳文瑨，等.血管內(nèi)皮生長因子和骨形成蛋白2誘導犬恒牙原位牙髓再生[J]. 中華口腔醫(yī)學研究雜志，2016，10（1）：5-10.

[13] Shlyonsky V，Soussia IB，Naeije R，et al.Opposing effects of bone morphogenetic protein-2 and endothelin-1 on lung fibroblast chloride currents[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2011，45（6）：1154-1160.

[14] Bostrm K. Proinflammatory vascular calcification[J]. Circ Res，2005，96：1219-1220.

[15] Yang YL，Ju HZ，Liu SF，et al.BMP-2 suppresses renal interstitial fibrosis by regulating epithelial-mesenchymal transition[J]. J Cell Biochem，2011，112（9）：2558-2565.

[16] 姚海佩，王方.骨形態(tài)發(fā)生蛋白在眼纖維化性疾病中的作用[J]. 國際眼科縱覽，2016，40（2）：136-139.

[17] Rastellini C，Han S，Bhatia V，et al.Induction of chronic pancreatitis by pancreatic duct ligation activates BMP2， apelin， and PTHrP expression in mice[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2015，309（7）：G554-G565.

[18] Gao X，Cao Y，Yang W，et al.BMP2 inhibits TGF-β-induced pancreatic stellate cell activation and extracellular matrix formation[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2013，304（9）：G804-G813.

[19] Liao Anyan，Wang Weijie，Sun Dawei，et al.Bone morphogenetic protein 2 mediates epithelial-mesenchymal transition via AKT and ERK signaling pathways in gastric cancer[J]. Tumour biology，2015，36（4）：2773-2778.

[20] 姚頤，張杰，葉達夫，等.應用PCR芯片篩查人重度腎積水組織的纖維化相關基因[J]. 國際外科學雜志，2009， 36（7）：445-448.

（收稿日期：2017-05-20）