閆孌 楊德琴

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147

尼古丁通過調(diào)控Toll樣受體4抑制牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力

閆孌 楊德琴

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147

目的探討尼古丁對(duì)牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）增殖和成骨分化能力的調(diào)控作用，檢測尼古丁能否通過調(diào)控Toll樣受體4（TLR4）抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。方法培養(yǎng)PDLSCs，采用流式細(xì)胞儀檢測PDLSCs表面抗原標(biāo)志，WST-1試劑盒檢測不同濃度尼古丁刺激后PDLSCs增殖能力的改變。采用茜素紅染色觀察PDLSCs經(jīng)不同濃度尼古丁刺激和成骨誘導(dǎo)后的礦化結(jié)節(jié)生產(chǎn)情況。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot檢測經(jīng)尼古丁刺激后，PDLSCs成骨能力相關(guān)基因和蛋白的改變，以及尼古丁聯(lián)合TLR4抑制劑TAK-242刺激后，PDLSCs成骨能力相關(guān)基因及蛋白的改變。。結(jié)果培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90和CD105，證實(shí)為PDLSCs。與對(duì)照組相比，培養(yǎng)3 d后，尼古丁濃度為10-4mol·L-1的PDLSCs的增殖能力受到明顯抑制（P＜0.05）；成骨誘導(dǎo)21 d后，10-4mol·L-1尼古丁刺激組茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)明顯減少。RT-PCR反應(yīng)及Western blot顯示：與對(duì)照組相比，尼古丁刺激組PDLSCs的堿性磷酸酶、骨鈣素、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的基因及蛋白表達(dá)量均降低（P＜0.05），加入TLR4抑制劑TAK-242后，尼古丁的抑制效應(yīng)減弱。結(jié)論 尼古丁可能通過TLR4信號(hào)通路抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。

尼古??； 牙周膜干細(xì)胞； Toll樣受體4； 成骨分化

慢性牙周炎是最常見的口腔疾病之一，可引起中老年人牙齒缺失，嚴(yán)重影響口腔健康。吸煙是導(dǎo)致慢性牙周炎的關(guān)鍵因素，煙葉中所含的尼古丁是損害牙周組織的重要危險(xiǎn)因子[1]。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，在牙周治療期間，不吸煙的牙周炎患者的療效明顯好于吸煙者，吸煙會(huì)加重牙周炎患者牙周組織的附著喪失及牙槽骨的吸收和破壞。牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）具有干細(xì)胞所特有的自我更新和多向分化能力，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后能向成骨方向分化。臨床上可運(yùn)用該特性進(jìn)行牙周組織缺損的修復(fù)[4]。PDLSCs可表達(dá)Toll樣受體4（Tolllike receptors 4，TLR4），其表達(dá)受到尼古丁的調(diào)控，尼古丁可以使炎癥因子分泌增加，加重牙周組織喪失[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，在慢性牙周炎的發(fā)生及發(fā)展過程中，TLR4參與了牙周組織的破壞，并且在這個(gè)過程中始終都有牙周組織的再生與修復(fù)。目前對(duì)尼古丁影響牙周組織再生修復(fù)機(jī)制的研究還較為少見。本研究目的在于研究尼古丁對(duì)PDLSCs成骨能力的影響及其作用機(jī)制，為臨床治療慢性牙周炎提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（杭州四季青生物工程有限公司），抗 CD105、抗Stro-1抗體（eBioscience公司，美國），抗CD90、抗CD31抗體（Biolegend公司，美國），Ⅰ型膠原酶（Gibco公司，美國），尼古丁硫酸鹽（Sigma公司，美國），胰蛋白酶（Gibco公司，美國），TLR4抑制劑TAK-242（Apexbio公司，美國），RNA提取試劑盒、WST-1試劑盒（Takara公司，日本），實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real timepolymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（Life technologies公司，美國），抗堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）一抗（Abcam公司，英國），兔抗人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）一抗（Santa Cruz公司，美國），鼠抗人骨鈣素（osteocalcin，OCN）一抗（Abcam公司，英國），鼠抗人β-actin一抗、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PDLSCs培養(yǎng) 2016年于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院收集新鮮拔除的完整無齲前磨牙，經(jīng)PBS沖洗后用刀片刮下根中份1/3的牙周膜組織，離心，收集組織加入膠原酶，吹打成懸液，滴入6孔板，每孔加入2 mL含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基，置于孵箱中于37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2 PDLSCs表型鑒定 將第3代 PDLSCs消化，PBS沖洗，重懸，依照試劑盒說明進(jìn)行操作，在各管內(nèi)分別加入規(guī)定濃度的抗CD31-FITC、抗CD90-PE、抗CD105-PE、抗Stro-1-FITC。輕輕吹打，在4 ℃冰箱中避光孵育1 h，PBS清洗后置于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況。

1.2.3 PDLSCs增殖能力的檢測 取第3代 PDLSCs，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，分別采用濃度為10-4、10-5、10-6mol·L-1的尼古丁進(jìn)行刺激，采用WST-1試劑盒檢測各組PDLSCs的增殖能力[7]。

1.2.4 PDLSCs成骨誘導(dǎo) 取第3代PDLSCs，消化計(jì)數(shù)后按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，待細(xì)胞長至孔底90%后，換成骨誘導(dǎo)液。將PDLSCs根據(jù)加入尼古丁濃度的不同分為10-4、10-5、10-6mol·L-1尼古丁刺激組和對(duì)照組。成骨誘導(dǎo)PDLSCs時(shí)每3 d換液1次，共誘導(dǎo)21 d。PBS清洗，多聚甲醛固定，加入茜素紅染液，行茜素紅染色[7]。

1.2.5 相關(guān)成骨基因的檢測 取第3代 PDLSCs，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于12孔板，分為10-4mol·L-1尼古丁刺激組和對(duì)照組。待其長至孔底90%后，換為成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)7 d后按試劑盒說明書提取RNA進(jìn)行RT-PCR，檢測PDLSCs中ALP、OCN和Runx2基因的表達(dá)水平

1.2.6 相關(guān)成骨蛋白的檢測 將第3代 PDLSCs按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，分為10-4mol·L-1尼古丁刺激組和對(duì)照組。待其長至孔底90%后，換為成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)至第14天，裂解細(xì)胞，提取總蛋白進(jìn)行Western blot檢測。檢測步驟：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，洗膜，封閉一抗，4 ℃冷藏過夜；第2天TBST液洗膜3次，每次5 min，封閉二抗2 h，洗膜，顯影。

1.2.7 加入拮抗劑TAK-242后PDLSCs相關(guān)成骨基因及蛋白的檢測 根據(jù)是否加入尼古丁和抑制劑TAK-242，分為4組：對(duì)照組，10-4mol·L-1尼古丁組，尼古丁聯(lián)合TAK-242 組，TAK-242組。實(shí)驗(yàn)方法同1.2.5 及1.2.6。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PDLSCs鑒定

倒置顯微鏡下觀察可見PDLSCs呈梭形或長梭形，體積較小，貼壁生長（圖1）。采用流式細(xì)胞儀檢測PDLSCs表面抗原標(biāo)志，結(jié)果可見：2.6%的CD31表達(dá)陽性，96.3%的CD90表達(dá)陽性，95.6%的CD105表達(dá)陽性，6.6%的Stro-1表達(dá)陽性，說明培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，證實(shí)為PDLSCs。

圖 1 PDLSCs形態(tài) 倒置顯微鏡Fig 1 PDLSCs morphology inverted microscope

2.2 不同濃度尼古丁刺激PDLSCs的增殖能力

在不同濃度的尼古丁刺激后，PDLSCs的增殖情況見表1。自培養(yǎng)第3天開始，與對(duì)照組相比較，10-6mol·L-1濃度組PDLSCs的增殖能力未發(fā)現(xiàn)明顯改變，而10-4mol·L-1濃度組的PDLSCs的增殖能力受到了明顯抑制（P＜0.05）。

表 1 4組PDLSCs增殖能力檢測的光密度值Tab 1 The optical density of proliferation in four groups of PDLSCs±s

表 1 4組PDLSCs增殖能力檢測的光密度值Tab 1 The optical density of proliferation in four groups of PDLSCs±s

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別1 d2 d3 d4 d5 d 10-4mol·L-10.37±0.270.37±0.710.37±0.02*0.20±0.02*0.17±0.01* 10-5mol·L-10.35±0.010.43±0.031.01±0.071.25±0.061.50±0.05* 10-6mol·L-10.34±0.010.57±0.021.38±0.031.78±0.032.13±0.12對(duì)照組0.34±0.010.48±0.011.29±0.021.97±0.032.25±0.06

2.3 尼古丁刺激PDLSCs后礦化物沉積

PDLSCs經(jīng)不同濃度的尼古丁刺激，成骨誘導(dǎo)21 d后行茜素紅染色，結(jié)果見圖2。與空白對(duì)照組相比，不同濃度的尼古丁對(duì)PDLSCs的成骨分化均有一定影響，當(dāng)尼古丁濃度為10-4mol·L-1時(shí)，PDLSCs成骨分化晚期礦化結(jié)節(jié)的形成最少，抑制作用最明顯。

2.4 尼古丁刺激PDLSCs后相關(guān)成骨基因和蛋白的檢測結(jié)果

PDLSCs在成骨誘導(dǎo)的過程中經(jīng)濃度為10-4mol·L-1的尼古丁刺激，其成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況見圖3，蛋白的表達(dá)情況見圖4。與對(duì)照組相比，ALP、OCN 和Runx2基因表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），3種相關(guān)成骨蛋白的表達(dá)情況同樣減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖 3 尼古丁刺激PDLSCs后相關(guān)成骨基因的檢測結(jié)果Fig 3 Detection results of osteogenic genes of PDLSCs stimulated by nicotine

圖 4 尼古丁刺激PDLSCs后相關(guān)成骨蛋白的檢測結(jié)果Fig 4 Detection results of osteogenic protein of PDLSCs stimulated by nicotine

2.5 TAK-242部分逆轉(zhuǎn)尼古丁對(duì)PDLSCs成骨相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用

加入拮抗劑TAK-242后PDLSCs相關(guān)成骨蛋白及基因的檢測結(jié)果見圖5、6。對(duì)PDLSCs成骨誘導(dǎo)7 d，檢測相關(guān)成骨基因和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，成骨相關(guān)基因及蛋白水平在10-4mol·L-1的尼古丁作用下的表達(dá)量均有所下降，與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；加入TAK-242后，成骨相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平上升，與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與尼古丁組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見TAK-242部分抑制了尼古丁對(duì)PDLSCs的負(fù)向效應(yīng)。

圖 5 加入拮抗劑TAK-242后PDLSCs成骨相關(guān)蛋白檢測結(jié)果Fig 5 Detection results of osteogenic protein of PDLSCs after given TAK-242

圖 6 加入拮抗劑TAK-242后PDLSCs成骨相關(guān)基因檢測結(jié)果Fig 6 Detection results of osteogenic genes of PDLSCs after given TAK-242

3 討論

吸煙對(duì)慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。Duane[8]指出，吸煙者的牙槽骨吸收嚴(yán)重程度明顯大于不吸煙者。成年吸煙者齦溝液尼古丁濃度為10-7～10-3mol·L-1[9]，本實(shí)驗(yàn)采用相似的濃度進(jìn)行研究。

PDLSCs具有干細(xì)胞所特有的增殖和多向分化的能力，在牙周組織再生與修復(fù)的過程中有至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的尼古丁刺激PDLSCs，檢測PDLSCs的增殖能力，結(jié)果顯示：經(jīng)過不同濃度的尼古丁刺激后，PDLSCs的增殖能力均在一定程度上受到了抑制，提示吸煙患者的牙槽骨再生及牙周修復(fù)能力較弱的原因之一可能就是尼古丁在一定程度上抑制了PDLSCs的增殖。PDLSCs經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后能夠表達(dá)成骨相關(guān)基因和蛋白，表明PDLSCs能向成骨細(xì)胞分化，具有形成牙周骨組織的潛力。本實(shí)驗(yàn)在基因水平和蛋白水平證實(shí)，一定濃度的尼古丁能抑制PDLSCs的成骨能力?；蛩綑z測結(jié)果表明，經(jīng)過一定濃度尼古丁刺激后，相關(guān)成骨基因，包括ALP、Runx2和OCN，在PDLSCs中的表達(dá)水平均存在著一定程度的下降。相關(guān)成骨蛋白（ALP、Runx2和OCN蛋白）的表達(dá)水平同樣有所降低。有學(xué)者[10]認(rèn)為，尼古丁改變了吸煙者齦溝液的局部微環(huán)境，影響了細(xì)胞的增殖能力，致使吸煙者牙周骨質(zhì)再生修復(fù)能力較弱。PDLSCs表達(dá)TLR4，尼古丁通過調(diào)控TLR4作用于PDLSCs，引起下游信號(hào)通路的變化[10]。Tilp等[11]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過尼古丁刺激牙周組織后，牙周組織中TLR4表達(dá)增加，說明TLR4可能是尼古丁破壞牙周組織的重要途徑。TLR4在牙周組織炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，一方面，TLR4特異性激動(dòng)劑尼古丁促進(jìn)乙酰膽堿的釋放，導(dǎo)致牙周組織的炎癥因子增加[12]；另一方面，尼古丁可以直接同免疫炎癥細(xì)胞表達(dá)的TLR4結(jié)合，影響腫瘤壞死因子-α等促炎因子的釋放，加劇牙周組織的破壞[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，受體TLR4同特異性激動(dòng)劑尼古丁結(jié)合的過程受到調(diào)控之后，經(jīng)過尼古丁和/或其競爭性拮抗劑TAK-242刺激，PDLSCs所表達(dá)的成骨相關(guān)基因及蛋白存一定程度的降低，提示尼古丁可能通過調(diào)控TLR4抑制牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力。

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（本文編輯 吳愛華）

The effect of Toll-like receptor 4 in nicotine suppressing the osteogenic potential of periodontal ligament stem cells

Yan Luan, Yang Deqin.
(Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China)

ObjectiveTo explore the impact of nicotine on proliferation and osteogenic capability of periodontal ligament stem cells (PDLSCs), and the role of Toll-like receptor 4 (TLR4) in nicotine, suppressing the osteogenic capability of PDLSCs.MethodsPDLSCs were cultured in vitro, and the fow cytometer was used to identify the surface antigen markers of PDLSCs. WST-1 was used to detect the proliferation ability of PDLSCs, which were stimulated by different concentrations of nicotine. Alizarin red staining was used to observe the formation of mineralized nodules after PDLSCs stimulation with different concentrations of nicotine. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to detect the change in osteogenic potential of PDLSCs stimulated by nicotine, after TAK-242, and with the inhibitor of TLR4.ResultsPDLSCs expressed mesenchymal stem cell-associated markers CD90 and CD105. When the concentration of nicotine was 10-4mol·L-1, the PDLSC proliferation could be suppressed after 3 d compared with the control group (P＜0.05). Theamount of mineralized nodules reduced after osteogenic differentiation at 21 d by alizarin red staining. RT-PCR and Western blot showed the expression levels of alkaline phosphatase (ALP), and osteocalcin (OCN), and the Runt-related transcription factor-2 (Runx-2) were lower than in the control group when nicotine suppressed the PDLSCs (P＜0.05). This effect was attenuated after TAK-242 was added.ConclusionNicotine suppresses the proliferation and osteogenic capability of PDLSCs, which may be regulated by TLR4.

nicotine; periodontal ligament stem cells; Toll-like receptors 4; osteogenic differentiation

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2017.04.005

Supported by: National Natural Science Foundation of China (31571508, 31371473); The Seventh Batch of Key Discipline Construction Project of Chongqing—Endodontics and Operative Dentistry (2011); Key Project of Medical Research Program of Chongqing Municipal Health Bureau (2011-1-062); Science and Technology Project of Yubei District in Chongqing [Yubei Finance and Education (2011) No. 33]. Correspondence: Yang Deqin, E-mail: yangdeqin@gmail.com.

2017-01-06；

2017-04-02

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571508，31371473）；重慶市第七批重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（牙體牙髓病學(xué)，2011年）；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011-1-062）；重慶市渝北區(qū)科技項(xiàng)目[渝北財(cái)教(2011)33號(hào)]

閆孌，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：24425122@qq.com

楊德琴，教授，博士，E-mail：yangdeqin@gmail.com