武輝 向鏡 陳惠哲 張玉屏 張義凱 姬廣梅 王亞梁 史鴻志 朱德峰

（中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室，杭州310006；第一作者：wuhuiscience@163.com；*通訊作者：cnrice@qq.com）

花前氮虧缺對水稻葉片氮代謝酶活性的影響

武輝 向鏡 陳惠哲 張玉屏 張義凱 姬廣梅 王亞梁 史鴻志 朱德峰*

（中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室，杭州310006；第一作者：wuhuiscience@163.com；*通訊作者：cnrice@qq.com）

以秈型雜交稻中浙優(yōu)1號和秈粳型雜交稻甬優(yōu)12為材料，試驗分析了花前不同時期氮虧缺處理對水稻葉片氮代謝酶活性的影響。結果表明，花前氮虧缺導致植株上3葉氮濃度、NR、GS、GOGAT、GOT和GPT酶活性大幅下降，GDH活性顯著增長，且各葉位對花前氮虧缺敏感度總體上表現(xiàn)為劍葉＞倒2葉＞倒3葉；破口期虧氮對秈型雜交稻中浙優(yōu)1號上3葉氮同化酶活性的影響遠小于減數(shù)分裂期處理，與之相比，秈粳雜交稻甬優(yōu)12對破口期虧氮脅迫仍較敏感，表明中浙優(yōu)1號植株氮代謝酶的虧氮敏感性由減數(shù)分裂期至破口期逐步下降，對土壤速效氮的需求同步降低，甬優(yōu)12則對土壤供氮存在更高需求。

水稻；氮虧缺；花前；氮代謝；減數(shù)分裂期；破口期

我國水稻栽培普遍存在氮肥用量過高、施用方式不合理、養(yǎng)分損失嚴重等問題[1-2]，導致氮肥利用率低[3]、地下水污染、江河湖泊水體富營養(yǎng)化、溫室氣體的增加等問題[4-6]。實現(xiàn)農業(yè)節(jié)氮減氮、提高氮肥利用率的同時做到穩(wěn)產增產，已成為農業(yè)生產和環(huán)境和諧共存、可持續(xù)發(fā)展的必然趨勢。研究表明，拔節(jié)至抽穗期是水稻吸氮高峰期[7-8]，穗分化期特別是減數(shù)分裂期至始穗期對氮的響應非常敏感[9]，此時供氮或虧氮，會對穎花退化、功能葉片氮代謝生理[10]、源庫器官NSC積累[11]產生重要影響。硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、谷草轉氨酶（GOT）和谷丙轉氨酶（GPT）是作物氮素吸收、同化和循環(huán)過程中的關鍵酶，GS/GOGAT偶聯(lián)形成的循環(huán)是高等植物氨同化的主要途徑，在無機氮轉化為有機氮的過程中起關鍵作用[10-13]，全生育期或某時期缺氮均顯著影響植株氮代謝酶活性[14-16]，進而影響氮的轉化和利用。本試驗通過一種簡易、有效的土壤速效氮淋洗減氮方法，并分別于減數(shù)分裂期和破口期進行淋洗處理，探討土壤氮虧缺對秈型雜交稻和秈粳型雜交稻主功能葉氮代謝酶活性的影響，以期為闡明水稻氮素積累及轉運特征、大田生產減氮技術應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年在中國水稻研究所富陽試驗基地進行。供試材料選用秈粳型雜交稻品種甬優(yōu)12和秈型雜交稻品種中浙優(yōu)1號。試驗采用自行設計的盆栽土壤速效氮淋洗結構（圖1）進行水稻栽植，盆栽土壤理化性質：pH值5.80，有機質42.57 g/kg，全氮0.19%，堿解氮73.54 mg/kg，有效磷54.30 mg/kg，速效鉀44.22 mg/kg。采用162穴大缽盤育秧，水稻機插專用育秧基質育秧，催芽種2粒/穴，移栽秧齡21～22 d，葉齡5.1～5.5，1叢/盆。全生育期施尿素3 g/盆，按基肥∶分蘗肥∶穗肥=4∶3∶3的比例施用?；视谝圃郧? d施入，分蘗肥于移栽后7 d施入，穗肥于倒3～4葉施入。過磷酸鈣（含P2O512%）3 g，隨基肥一次性施入。氯化鉀（含K2O 40%）2 g，按基肥和穗肥分2次等量施入。主要生育期情況見表1。

圖1 盆栽土壤淋洗結構

表1 參試品種主要生育期以及生育階段天數(shù)

圖2 水稻不同生長時期淋洗對上3葉氮濃度的影響

1.2 土壤速效氮淋洗結構

土壤淋洗結構如圖1，栽培盆內從下到上依次為：浮石、帶孔排水板（PVC材質）、無紡布（40 g/m2）、沙土混合基質。栽培盆內徑為25.5 cm×20.0 cm×26.5 cm（長×寬×高），均裝入沙土混合基質10±0.2 kg，土表距盆口約4 cm。栽培盆側下方開有排水孔1個，并用橡膠塞堵塞。盆底部放置若干浮石，上置裁剪好的帶孔排水板。排水板表面墊2層無紡布，防止淋洗過程中土壤隨水淋失堵塞排水孔。沙土混合基質為過篩干土與粗沙按4∶1（w/w）混勻。

1.3 試驗設計

試驗分別于植株減數(shù)分裂期（MS，抽穗前14～15 d，劍葉抽出1/2）和破口期（RS，主莖抽穗前3 d），選擇發(fā)育進程一致的植株進行淋洗處理，以不淋洗植株作為對照（CK）。淋洗前1 d，所有栽培盆澆水1 L確保土壤水飽和，第二天下午拔掉橡膠塞，開始第1次淋洗。12 h后收集周轉箱內淋洗溶液，各盆加橡膠塞并澆水1 L，12 h后開始第2次淋洗，共淋洗3次。淋洗過程中花盆略微傾斜放置，便于淋洗液盡快排出。所有栽培盆置于遮雨棚下，淋洗均于夜間進行，減少日間高溫引起的淋洗液蒸發(fā)和氨揮發(fā)的損耗。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 植株上3葉氮濃度測定均于淋洗處理結束后，取主莖上3葉烘干，磨成細粉，用消煮法測定上3葉氮濃度（%，F(xiàn)OSS全自動定氮儀），各處理5次重復。

1.4.2 植株上3葉氮代謝酶活性測定分別于淋洗處理結束后，取主莖上3葉液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存，用于硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、谷草轉氨酶（GOT）和谷丙轉氨酶（GPT）的測定。所取葉片組織鮮質量為0.100 g，使用全自動樣品快速研磨儀（Tissuelyser-48，上海凈信）液氮條件下磨粉，采用試劑盒（蘇州科銘）提取組織樣品的原液，經試劑盒待測液用酶標儀（Tecan Infinite M200 PRO）測定各指標。各指標均測4次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2016和SPSS 23.0軟件結合進行；Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗；Origin 8.5軟件制圖，圖中誤差線均為標準誤差。

2 結果與分析

2.1 植株上3葉氮濃度

土壤中90%以上的氮素以有機形態(tài)存貯，只有經過礦化轉變成無機態(tài)的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，才可被作物吸收利用[17]。筆者之前試驗采用淋洗結構+沙土混合基質，分別于水稻減數(shù)分裂期和破口期進行淋洗處理，土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量降幅分別達42.1%～59.3%和35.0%～43.9%，可實現(xiàn)預期的土壤減氮效果，短期內對土壤速效氮供應能力形成有效抑制（論文待審）。與此同時，參試品種上3葉氮濃度均同步大幅下降（圖2），意味著淋洗處理對水稻造成短期氮虧缺。

圖3 水稻氮虧缺對上3葉NR活性的影響

圖4 水稻氮虧缺對上3葉GS活性的影響

與CK相比，減數(shù)分裂期（MS）淋洗處理導致中浙優(yōu)1號葉片氮濃度顯著下降，各葉位降低幅度為13.2%～19.5%，破口期（RS）淋洗處理下中浙優(yōu)1號各葉位氮濃度僅下降5.2%～7.1%，與CK差異未達顯著水平。淋洗處理導致甬優(yōu)12葉片氮濃度顯著下降，降幅分別達18.2%～23.3%（MS）和11.3%～15.8%（RS）?？傮w上，各葉位氮濃度降幅排序為劍葉＞倒2葉＞倒3葉，品種間則表現(xiàn)為甬優(yōu)12＞中浙優(yōu)1號。與破口期淋洗處理相比，水稻減數(shù)分裂期淋洗處理劍葉僅抽出一半，倒2葉和倒3葉氮積累時間亦比破口期少11～14 d，植株上3葉氮濃度對淋洗處理的響應遠大于破口期。

2.2 硝酸還原酶（NR）

NR是催化硝態(tài)氮轉化為銨態(tài)氮過程中的限速酶，不同時期土壤速效氮供應不足則導致水稻葉片NR活性大幅下降。由圖3可知，與CK相比，中浙優(yōu)1號上3葉NR活性在減數(shù)分裂期（MS）和破口期（RS）虧氮處理中分別下降7.3%～33.9%和5.1%～13.0%，特別是劍葉和倒2葉NR活性與CK呈顯著或極顯著差異?；ㄇ皟蓵r期氮虧缺均導致甬優(yōu)12葉片NR活性顯著下降，降幅分別達8.1%～46.9%（MS）和11.2%～28.5%（RS）。2個品種各葉位NR活性降幅排序為劍葉＞倒2葉＞倒3葉，品種間NR活性水平及對氮虧缺敏感性均表現(xiàn)為甬優(yōu)12＞中浙優(yōu)1號。

2.3 谷氨酰胺合成酶（GS）

GS將植物吸收的無機態(tài)銨轉為有機態(tài)的谷氨酰胺，是處于氮代謝中心的多功能酶，其活性對花前土壤氮虧缺的響應與NR變化相似（圖4）。與CK相比，中浙優(yōu)1號上3葉GS活性在減數(shù)分裂期（MS）和破口期（RS）虧氮處理中分別下降13.9%～26.3%和3.9%～23.8%，且均與CK呈顯著差異（除破口期處理倒3葉）?；ㄇ皟蓵r期氮虧缺均導致甬優(yōu)12葉片GS活性顯著下降，降幅分別達19.9%～41.6%（MS）和8.6%～35.5%（RS）。與NR類似，兩品種各葉位GS活性降幅排序為劍葉＞倒2葉＞倒3葉，品種間GS對氮虧缺敏感性表現(xiàn)為甬優(yōu)12＞中浙優(yōu)1號。

2.4 谷氨酸合酶（GOGAT）

圖5 水稻氮虧缺對上3葉GOGAT活性的影響

圖6 水稻氮虧缺對上3葉GDH活性的影響

由圖5可知，減數(shù)分裂期氮虧缺條件下，中浙優(yōu)1號上3葉GOGAT活性較CK下降12.5%～26.1%，差異達顯著水平；破口期虧氮導致劍葉GOGAT活性下降18.9%，對倒2葉和倒3葉則幾無影響?；ㄇ皟蓵r期氮虧缺導致甬優(yōu)12葉片GOGAT活性分別下降20.3%～30.6%（MS）和6.9%～22.0%（RS），除破口期倒3葉外均與CK差異顯著。MS處理正值劍葉抽出階段，參試的2個品種各葉位GOGAT活性高低排序均為劍葉＜倒2葉＜倒3葉，RS時期主功能葉全部展平，中浙優(yōu)1號各葉位GOGAT活性高低排序為劍葉＞倒2葉＞倒3葉，而甬優(yōu)12上3葉仍表現(xiàn)為劍葉＜倒2葉＜倒3葉。參試的2個品種各葉位對氮虧缺敏感性均表現(xiàn)為劍葉＞倒2葉＞倒3葉。

2.5 谷氨酸脫氫酶（GDH）

GDH在銨同化中起補充GS/GOGAT循環(huán)的作用，當作物遇到環(huán)境脅迫和作物發(fā)育后期時發(fā)揮著重要作用[18]。由圖6可知，中浙優(yōu)1號葉片GDH活性在減數(shù)分裂期和破口期虧氮處理中較CK分別增長19.7%～49.7%（MS） 和 10.0%～53.0%（RS），上3葉增幅排序為倒2葉＞倒3葉＞劍葉，甬優(yōu)12同比增長9.9%～21.0%（MS）和2.7%～21.7%（RS），上3葉增幅排序為倒3葉＞倒2葉＞劍葉。

2.6 谷草轉氨酶（GOT）

GOT、GPT是作物體內2種主要的轉氨酶，涉及合成限制性必需氨基酸，并與光合作用、呼吸代謝間聯(lián)系緊密，是反映葉片氨轉運和貯藏、氮同化及氮代謝與碳代謝的協(xié)調方面的主要指標之一。由圖7可見，花前不同時期虧氮處理導致參試2個品種葉片GOT活性顯著下降，中浙優(yōu)1號上3葉降幅達16.0%～29.8%（MS）和15.9%～22.5%（RS），甬優(yōu)12同比降低了13.7%～19.1%（MS）和10.0%～18.0%（RS），各葉位對氮虧缺敏感性均表現(xiàn)為倒2葉＞倒3葉＞劍葉。

2.7 谷丙轉氨酶（GPT）

花前不同時期虧氮處理中，參試2個品種葉片GPT活性均呈下降趨勢，但與GOT存在明顯差異。減數(shù)分裂期虧氮處理導致參試2個品種上3葉GPT活性分別下降7.9%～20.1%（中浙優(yōu)1號）和8.8%～19.1%（甬優(yōu)12），各葉位降幅排序為倒2葉＞倒3葉＞劍葉；破口期則同比降低7.1%～31.3%（中浙優(yōu)1號）和2.9%～24.3%（甬優(yōu)12），各葉位降幅排序為劍葉＞倒2葉＞倒3葉。

圖7 水稻氮虧缺對上3葉GOT活性的影響

圖8 水稻氮虧缺對上3葉GPT活性的影響

3 討論與結論

本研究發(fā)現(xiàn)，水稻花前短期氮虧缺后，不同葉位葉片NR、GS和GOGAT酶活性均顯著下降，表明植株短期內對無機氮的吸收同化受到限制，導致葉片氮濃度降低，且各葉位對土壤短期氮虧缺敏感度表現(xiàn)為劍葉＞倒2葉＞倒3葉，這與前人研究結果相反[19]。其原因在于長期氮饑餓引起下位葉含氮物質持續(xù)分解并向上轉運[10]，而短期虧氮則僅引起氮同化受限，且新葉受限最為嚴重，因此減數(shù)分裂期氮虧缺葉片氮濃度和氮同化酶活性下降幅度遠大于破口期氮虧缺。氨通過GS/GOGAT循環(huán)后，進一步通過GOT和GPT催化轉入到其他氨基酸中，兩者均能在營養(yǎng)生長期消耗谷氨酸提供氮源，在衰老期產生谷氨酸供應植物[20]，其酶活性的顯著下降表明氨轉化途徑受阻，植株生長所需氨基酸來源不足，而GDH的顯著增高意味著葉片儲存蛋白快速降解[21]，以補償?shù)澣币鸬陌被峁蛔恪?/p>

此外，不同類型水稻葉片的氮同化酶活性對花前氮虧缺的響應存在明顯差異。破口期虧氮處理對秈型雜交稻中浙優(yōu)1號上3葉氮濃度、NR、GS和GOGAT活性的影響遠小于減數(shù)分裂期處理，表明中浙優(yōu)1號植株氮代謝酶對虧氮敏感性由減數(shù)分裂期至破口期逐步下降，對土壤速效氮的需求同步降低。與之相比，兩時期減氮處理均導致秈粳雜交稻甬優(yōu)12上3葉氮濃度和氮同化酶活性顯著下降，這意味著此類型水稻在開花前后對虧氮敏感性和土壤速效氮需求較秈型雜交稻更高。同時，花前植株GDH酶活性和氮虧缺引起的增幅均表現(xiàn)為中浙優(yōu)1號遠大于甬優(yōu)12，說明中浙優(yōu)1號主要依賴快速降解存儲蛋白質來應對短期氮虧缺，而甬優(yōu)12則更多通過氮吸收、同化和氨轉化來進行氨基酸循環(huán)。

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Effects of Pre-anthesis Nitrogen Deficiency on Nitrogen Metabolism Enzyme Activities of Rice Leaves

WU Hui,XIANG Jing,CHEN Huizhe,ZHANG Yuping,ZHANG Yikai,WANG Yaliang,JI Guangmei,SHI Hongzhi,ZHU Defeng*
（State Key Laboratory of Rice Biology/China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China;1st author:wuhuiscience@163.com;*Corresponding author:cnrice@qq.com）

Effects of pre-anthesis nitrogen deficiency at different growth stages on nitrogen metabolism enzyme activities in main functional leaves were studied,using indica-japanica hybirid rice variety Yongyou 12,and indica hybrid rice variety Zhongzheyou 1 as materials.The results showed that,affected by nitrogen deficiency at meiosis stage and rupturing stage,nitrogen concentration,NR, GS,GOGAT,GOT and GPT enzyme activities of top-three leaves were dramatically decreased,but GDH activity was increased significantly.In general,the sensitivity of enzyme activities of leaves at different leaf positions to nitrogen deficiency were enhanced from bottom to top.Furthermore,the effects of nitrogen deficiency at rupturing stage on nitrogen assimilation enzyme activities of indica hybrid rice Zhongzheyou1 was much less than that of meiosis stage.However,indica-japanica hybirid rice Yongyou 12 was still sensitive to nitrogen deficiency during rupturing stage.This indicated that the nitrogen deficiency sensitivity of nitrogen metabolism enzymes in Zhongzheyou 1 plants decreased gradually from meiosis stage to rupturing stage,and the demand for soil available nitrogen was decreased synchronously,while Yongyou 12 had higher demand for soil nitrogen supply.

rice;nitrogen deficiency;pre-anthesis;nitrogen metabolism;meiosis stage;rupturing stage

S511.04

A

1006-8082（2017）04-0014-06

2017－06－21

糧豐工程項目（2016YFD0300502）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31501272）；2015年浙江省“三農六方”項目