□ 蘇妙貞 曾曉琮 韓志杰 周 露 廣東省食品檢驗所

金黃色葡萄球菌定量檢測中四種培養(yǎng)基的比較

□ 蘇妙貞 曾曉琮 韓志杰 周 露 廣東省食品檢驗所

使用Baird-Parker平板、RPF平板、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基平板及3M PerifilmTM金黃色葡萄球菌測試片對金黃色葡萄球菌檢測，濃度范圍在103～104CFU/mL，3M測試片、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、RPF平板與BP平板結(jié)果相當(dāng)。在實際檢測中，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基輔助檢測，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

金黃色葡萄球菌；定量檢測；培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌是我國細(xì)菌性食物中毒的致病菌之一，致病力與產(chǎn)生腸毒素相關(guān)。而腸毒素的產(chǎn)生與樣品中金黃色葡萄球菌濃度有關(guān)，一般認(rèn)為濃度≥105CFU/g，即可能產(chǎn)生腸毒素[1]。因此國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會（ICMSF）采樣方案設(shè)定指南中，把金黃色葡萄球菌的危險性列為中度危害，偶爾會使人嚴(yán)重不適，治療后無后遺癥，病程較短，癥狀可治愈。中度危害菌采用三級采樣方案，即允許一定量的金黃色葡萄球菌存在于樣品中。GB 29921-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》是根據(jù)風(fēng)險監(jiān)測和評估結(jié)果，參考CAC、ICMSF和澳大利亞、新西蘭、香港、臺灣等國際組織、國家和地區(qū)不同類別即食食品中金黃色葡萄球菌限量標(biāo)準(zhǔn)，按三級采樣方案設(shè)置肉制品、水產(chǎn)制品、糧食制品、即食豆類制品、即食果蔬制品、飲料、冷凍飲品及即食調(diào)味品8類食品中金黃色葡萄球菌限量[2]。

金黃色葡萄球菌定量檢測在日常微生物檢驗工作中所占比重越來越大，選出一個簡便、快捷并準(zhǔn)確的方法變得十分有必要。本文通過對四種培養(yǎng)基比較，得出它們優(yōu)缺點(diǎn)，為提高檢測效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

2015年食藥總局組織的金黃色葡萄球菌盲樣考核樣品，共10份。樣品為10個西林瓶裝金黃色葡萄球菌菌球和10袋奶粉樣品，每袋奶粉質(zhì)量為25 g，每個相同編碼金黃色葡萄球菌樣品和奶粉樣品作為1件樣品檢測，以平板計數(shù)法報告檢測結(jié)果，單位為CFU/g。將奶粉與小球放入盛有225 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，均質(zhì)1 min。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

成品Baird-Parker瓊脂平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；成品兔血漿纖維蛋白原瓊脂平板（RPF平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（法國科馬嘉公司）；金黃色葡萄球菌測試片（美國3M公司）；金黃色葡萄球菌反應(yīng)確認(rèn)片（美國3M公司）；凍干血漿（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的檢驗

Baird-Parker平板、 RPF平板、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基平板均依據(jù)GB 4789.10-2010 第二法 平板計數(shù)法檢驗涂布法涂布，三塊平板即吸取2～3個稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別加在三塊平板上，涂布均勻、培養(yǎng)[3]。3M金黃色葡萄球菌測試片按說明書測試，即吸取1 mL樣品勻液，揭起上層膜，將樣品滴加在測試片中央處，使用壓板將樣品均勻覆蓋于培養(yǎng)面積上，等樣品吸收完畢后培養(yǎng)。

1.2.2 選擇性鑒定實驗

Baird-Parker平板依據(jù) GB 4789. 10-2010《第二法鑒定可疑菌落》，即革蘭氏染色及血漿凝固酶實驗。RPF平板血漿凝固酶陽性菌落為灰黑色菌落，外圍是一個渾濁沉淀環(huán)?？岂R嘉的金黃色葡萄球菌顯色平板根據(jù)說明書判斷，一般金黃色葡萄球菌為紫紅色菌落。3M金黃色葡萄球菌測試片上的金黃色葡萄球菌一般為紫紅色，如有黑色菌落則需使用反應(yīng)確認(rèn)片確定，即掀開測試片上層膜，將確認(rèn)片置入小心壓緊，不能殘留氣泡，36 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1～3 h后觀察結(jié)果，金黃色葡萄球菌會在菌落周圍出現(xiàn)粉紅色環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基選擇性比較

選擇性比較結(jié)果見表1。

10份樣品中，在BP平板上生長的菌落均為黑色，區(qū)分金黃色葡萄球菌主要看渾濁帶及透明圈的大小。當(dāng)平板上菌落數(shù)較少時，很容易從板上分辨出金葡菌，但菌落數(shù)達(dá)到100個左右時，由于采用涂布法，菌分布在培養(yǎng)基表面，不同菌落容易互相重疊，渾濁帶與透明圈交叉，影響典型菌落的計數(shù)。顯色平板和3M測試片的典型菌落均為紫紅色，與非金葡菌區(qū)分開來。在RPF平板上生長的菌落也是黑色的，血漿凝固酶陽性的菌落會在外圍形成渾濁帶，用于區(qū)分金黃色葡萄球菌。RPF平板與BP平板相似，同樣存在平板上菌落較多時渾濁帶互相影響導(dǎo)致計數(shù)不準(zhǔn)確。四種培養(yǎng)基檢出金黃色葡萄球菌的數(shù)量見表2。

2.2 測試結(jié)果

使用SPSS軟件分析以上結(jié)果，BP平板的測試結(jié)果與顯色平板（P=0.747＞0.05）、3M紙片（P=0.826＞0.05）、RPF平板（P=0.909＞0.05）無顯著性差異。

3 結(jié)論

從此次考核樣品結(jié)果來看，金黃色葡萄球菌的濃度范圍在103～104，這個范圍落在了GB 29921-2013設(shè)定金黃色葡萄球菌最高安全限量值M內(nèi)，具有日常檢驗的參考意義。在此濃度范圍內(nèi)，使用BP平板、顯色平板和RPF平板作涂布法檢測結(jié)果與3M紙片法結(jié)果相當(dāng)，無顯著差異。由于涂布法使用涂布棒會帶走一部分菌體，所以理論上直接加樣的3M紙片結(jié)果會比涂布法高。要降低涂布帶來的菌體損失，使用疏水材質(zhì)的一次性涂布棒。

對比幾種培養(yǎng)基，3M金黃色葡萄球菌測試片操作方便，能夠縮短檢測時間，易于觀察。但樣品出現(xiàn)黑色菌落時，需要附加使用反應(yīng)確認(rèn)片確認(rèn)，菌量較多時粉紅色暈圈的重疊現(xiàn)象會影響觀察，此時需要加大稀釋度。顯色平板同樣具有縮短檢測時間，結(jié)果容易觀察，可采用傾注法和涂布法實驗。顯色培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，直接加熱溶解即可，能減少工作量。金黃色葡萄球菌在科馬嘉顯色培養(yǎng)基上為粉紅色菌落，雜菌一般為藍(lán)綠色菌落及白色菌落，易于區(qū)分，無需實驗。RPF培養(yǎng)基與BP培養(yǎng)基類似，以氯化鋰和亞碲酸鉀抑制非葡萄球菌生長，但RPF培養(yǎng)基添加牛纖維蛋白原和兔血漿，能使血漿凝固酶陽性葡萄球菌形成灰黑色菌落，周圍有乳白色沉淀環(huán)，直觀區(qū)分血漿凝固酶陽性菌落，不需如BP培養(yǎng)基可疑的菌落，純培養(yǎng)做血漿凝固酶實驗，大大節(jié)省時間。不過RPF培養(yǎng)基也存在當(dāng)菌落數(shù)較大時沉淀環(huán)互相重疊影響觀察的問題，需要通過多做稀釋度控制平板上菌落數(shù)量。

表1 選擇性比較結(jié)果

表2 四種培養(yǎng)基檢出金黃色葡萄球菌的數(shù)量

雖然3M測試片、顯色培養(yǎng)基和RPF培養(yǎng)基對比BP培養(yǎng)基均具有一定優(yōu)勢，但成本高于BP培養(yǎng)基。BP培養(yǎng)基在檢測實驗室中通常只需購買基礎(chǔ)，再用雞蛋與亞碲酸鉀加入即可配好，其他三種培養(yǎng)基則需要直接購買成品，不利于控制成本，而且不是GB 4789.10-2010中指定的培養(yǎng)基，不能用于此方法數(shù)據(jù)的出具。但在使用BP培養(yǎng)基進(jìn)行檢測的同時，可以附加幾種培養(yǎng)基實驗，既可縮短檢測時間，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1]劉海卿,佘之蘊(yùn),陳丹玲,等.金黃色葡萄球菌三種定量檢驗方法的比較[J].食品研究與開發(fā),2014,35(13):113-115.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 29921-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.10-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.