張松濤，趙西珍，高 黎

(1.三門峽口腔醫(yī)院，河南 三門峽472000；2.三門峽市中心醫(yī)院口腔科，河南 三門峽472000；3.鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 兒童口腔科，河南鄭州450052)

*通訊作者

mt01對人牙周膜細(xì)胞中成骨細(xì)胞相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

張松濤1，趙西珍2，高 黎3*

(1.三門峽口腔醫(yī)院，河南 三門峽472000；2.三門峽市中心醫(yī)院口腔科，河南 三門峽472000；3.鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 兒童口腔科，河南鄭州450052)

臨床上很多牙病治療需要借助牙齒的再生功能才能達(dá)到治療的目的，如口腔正畸，通過外力將牙齒移動位置后原有的牙齒發(fā)生了位移，其原有的牙骨受到破壞，需要在新位置上的牙周膜細(xì)胞重新生成牙骨，通過這種破骨-成骨過程達(dá)到實現(xiàn)骨改建的目的[1,2]。在此過程中，牙周膜細(xì)胞中成骨分化是實現(xiàn)牙槽骨改建最重要的步驟[3,4]。臨床上很多患者不具備較強(qiáng)的牙周膜細(xì)胞成骨分化能力，使正畸的效果受到影響，或者臨床為了加快正畸完成時間，需要通過一定的手段促進(jìn)牙周膜細(xì)胞成骨分化速度。目前，正畸成為大部分家庭兒童或成年人的牙保健選擇，因此，需要正畸的人群數(shù)量龐大，而大多數(shù)正畸完成的時間在1.5-2年，對患者的工作、學(xué)習(xí)造成嚴(yán)重影響[5,6]。因此，尋找可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞成骨分化的方案已成為臨床研究的熱點?；诖?，在充分研究目前促進(jìn)牙周膜細(xì)胞成骨分化臨床文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，我們選擇寡核苷酸mt01作為促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞成骨分化的切入點，分析不同濃度的寡核苷酸mt01對人牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2015年1月-2016年1月在三門峽口腔醫(yī)院行牙齒正畸時拔除的健康牙齒作為研究對象。

1.2 儀器與試劑

ODN mt01(大 連 寶 生 物 公 司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國NAPCO公司生產(chǎn))，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司生產(chǎn))胰蛋白酶(美國Sigma公司生產(chǎn))；磷酸鹽緩沖液(自制)；超凈工作臺(蘇州凈化有限公司生產(chǎn))；恒溫水浴箱(常州實驗儀器有限公司生產(chǎn))；離心機(jī)(常州實驗儀器有限公司生產(chǎn))；原位雜交儀(杭州瑞成儀器有限公司生產(chǎn)，型號：SH2000)，4塊板加熱振蕩器(杭州瑞成儀器有限公司生產(chǎn)，型號：TS300)。寡核苷酸探針：安必奇生物科技有限提供。

1.3 方法

按照人牙周膜細(xì)胞離體培養(yǎng)、寡核苷酸混合培養(yǎng)和原位雜交技術(shù)測定的步驟完成實驗過程。具體方法如下。

1.3.1 人牙周膜細(xì)胞離體培養(yǎng) 刮取健康牙齒牙周膜進(jìn)行雙抗處理，置于消化液中，于4℃冰箱中消化處理16 h，顯微鏡下夾取分離上層表層細(xì)胞，置于胰蛋白酶中，于37℃恒溫水浴箱中消化15 min，然后吹打呈單細(xì)胞懸液，離心加入培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度越為500×103個/ml，接種培養(yǎng)值細(xì)胞張曼培養(yǎng)皿，進(jìn)行后續(xù)傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)三代。收集第三代培養(yǎng)細(xì)胞備用。

1.3.2 寡核苷酸mt01+人牙周膜細(xì)胞混合培養(yǎng) 取生長良好的三代人牙周膜細(xì)胞，按照每孔鋪5×103個細(xì)胞分別接種于96孔板中的50個樣品孔中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別向孔內(nèi)加入不同濃度(1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L)的寡核苷酸mt01溶液和對照PBS各10份，繼續(xù)培養(yǎng)96 h。采用原位雜交技術(shù)檢查添加不同濃度寡核苷酸mt01的人牙周膜細(xì)胞中ALP、BGPmRNA表達(dá)結(jié)果差異，以細(xì)胞染色程度判定ALP和OCNmRNA陽性表達(dá)率。

1.3.3 原位雜交技術(shù)測定人牙周膜細(xì)胞中ALP、OCNmRNA表達(dá) 將商購的寡核苷酸探針采用3’-尾端標(biāo)記法行DIG標(biāo)記寡核苷酸探針。采用磷酸緩沖液(PBS)對培養(yǎng)得到的人牙周膜細(xì)胞逐份洗滌3次，分別采用稀鹽酸溶液室溫處理10 min，再經(jīng)PBS洗滌3次，向細(xì)胞懸液中滴加蛋白酶K溶液，于37℃水域中培養(yǎng)8 min，加入PBS洗滌、過濾3次，經(jīng)洗滌的細(xì)胞采用多聚甲醛處理固定，室溫放置10 min后，PBS洗滌2次，加入乙醇脫水15 s；向每管細(xì)胞懸液中加入雜交液(配制方法:HybA液18 μl，HybB液2 μl，混合后，80C加熱10 min，離心15 s),加塞密封，置于42C攝氏度水浴箱中保溫20 h，去掉管塞，向試管里加入甲酰胺×SSC，于37℃水浴箱中洗滌30 min，2×SSC，于37℃水浴箱中洗滌15 min 0.1×SSC，37℃水浴箱中洗滌5 s，BufferI洗5 s×1次；加入馬血清封閉頁面，室溫放置50 min，向試管內(nèi)加入抗Dig-AP50 μl，37℃水浴箱中放置60 min；Buffer溶液洗滌3次，每次15 min，Buffer溶液洗滌3次，每次洗滌1 min；加入NBT/BCIP顯色/核固紅復(fù)染。放置5 min后，取溶液于顯微鏡下觀察細(xì)胞漿內(nèi)顏色變化。

1.4 結(jié)果判定

ALPmRNA陽性表達(dá)判定：在細(xì)胞胞漿內(nèi)若有彌散分布的細(xì)紗樣的藍(lán)紫色點狀顆粒，判定為+；顆粒染色加深，顆粒變大，記錄為++；+和++樣品份數(shù)之和/總份數(shù)×100%，為ALP陽性表達(dá)率。

OCN mRNA陽性表達(dá)判定：細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小的藍(lán)紫色顆粒，表明有OCN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，記錄為+；顆粒變大，顏色加深，判定為++；陽性率計算同ALPmRNA表達(dá)陽性率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

對研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料行t檢驗，計數(shù)資料行卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度寡核苷酸mt01對人牙周膜細(xì)胞ALPmRNA表達(dá)比較

不同濃度寡核苷酸mt01培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞中ALPmRNA表達(dá)陽性率均明顯高于PBS對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),2 mg/L濃度寡核苷酸mt01培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞中ALPmRNA表達(dá)陽性率明顯高于濃度1 mg/L、3 mg/L、4 mg/L濃度寡核苷酸mt01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度寡核苷酸mt01對人牙周膜細(xì)胞ALPmRNA表達(dá)比較

注：*與對照組比較，P<0.05，#與2 mg/L比較，P<0.05。

2.2 不同濃度寡核苷酸mt01對人牙周膜細(xì)胞OCN mRNA表達(dá)比較

不同濃度寡核苷酸mt01培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞中OCNmRNA表達(dá)陽性率均明顯高于PBS對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2 mg/L濃度寡核苷酸mt01培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞中OCNmRNA表達(dá)陽性率明顯高于濃度1mg/L、3 mg/L、4 mg/L濃度寡核苷酸mt01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度寡核苷酸mt01對人牙周膜細(xì)胞OCN mRNA表達(dá)比較

注：*與對照組比較，P<0.05，#與2 mg/L比較，P<0.05。

3 討論

近年關(guān)于骨的新陳代謝研究發(fā)現(xiàn)，骨是一種新型的內(nèi)分泌器官，骨在合成過程中分泌兩種激素，即成纖維細(xì)胞因子23 和骨鈣素 (OCN)[7,8]。這兩種激素對體內(nèi)磷和能代謝具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，在骨的生長代謝中發(fā)揮重要作用。其中成骨細(xì)胞產(chǎn)生的OCN釋放到血液中后，分布到全身多種器官和組織，發(fā)揮對胰島素β細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等的調(diào)節(jié)作用，而胰島素β細(xì)胞和脂肪細(xì)胞反饋至骨，則促進(jìn)骨鈣素的活化，增強(qiáng)了骨的新成代謝，促進(jìn)骨的重建[9,10]。骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是產(chǎn)生OCN的主要部位，以羧化無活性形式儲存于骨胞外基質(zhì)中，破骨細(xì)胞在骨表面產(chǎn)生的酸度適宜時，OCN 脫羧化成為uc OCN 活性形式，促進(jìn)β胰島細(xì)胞分泌胰島素。因此，骨鈣素能反映相關(guān)器官、組織及細(xì)胞的骨重建的過程[11,12]。

堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分泌的胞外酶，其在骨組織形成、代謝、再生過程中發(fā)揮重要作用，是臨床判斷成骨細(xì)胞分化情況的重要標(biāo)志物。目前ALP 被臨床普遍認(rèn)可為細(xì)胞成骨向分化的靈敏標(biāo)志物，是評價細(xì)胞成骨向分化可靠指標(biāo)。

臨床實驗室研究顯示，特定序列的寡核苷酸對成骨-破骨平衡系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用[13,14]。目前篩選出的對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人源性成骨樣細(xì)胞系MG63細(xì)胞生物學(xué)特性有影響作用的特定序列寡核苷酸mt01。人牙周膜是具有多向分化潛能的細(xì)胞，在牙齒的重建過程中發(fā)揮重要作用[15]。

基于上述研究，本研究通過寡核苷酸mt01作用于人牙周膜細(xì)胞后，對其骨鈣素和堿性磷酸酶mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析，以明確寡核苷酸mt01是否能促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞成骨分化作用。結(jié)果顯示，經(jīng)寡核苷酸mt01作用后的人牙周膜細(xì)胞中ALPmRNA表達(dá)陽性率、OCNmRNA表達(dá)陽性率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明寡核苷酸mt01具有促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞中成骨細(xì)胞相關(guān)因子mRNA表達(dá)的作用，其中以濃度水平為2 mg/L的寡核苷酸mt01促進(jìn)ALP和OCNmRNA的陽性率效果最好。這為臨床牙重建相關(guān)的治療過程促進(jìn)牙骨重建藥物制劑研究提供了新的方向，有望提高牙重建相關(guān)治療的質(zhì)量和水平。

綜上所述，寡核苷酸mt01可促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞中成骨細(xì)胞相關(guān)因子ALP和OCNmRNA表達(dá)，因此寡核苷酸類制劑具有促進(jìn)人牙周細(xì)胞成骨向的作用，可作為人牙相關(guān)疾病治療的輔助藥物，促進(jìn)人牙周成骨分化，降低人牙周膜細(xì)胞成骨分化的時間，提高治療質(zhì)量，提高正畸等牙病治療的適應(yīng)癥，具有較高的臨床價值。

[1]于海蛟,申玉芹,劉引等.特定序列寡核苷酸MT01對牙齦卟啉單胞菌感染的成骨細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015,33(6):617.

[2]James EN,Delany AM,Nair LS.Post-transcriptional regulation in osteoblasts using localized delivery of miR-29a inhibitor from nanofibers to enhance extracellular matrix deposition.Acta Biomater.2014 Aug;10(8):3571-80.

[3]劉 引,申玉芹,高 涵,等.MT01對牙齦卟啉單胞菌感染成骨細(xì)胞 MG63中Ⅰ型膠原mRNA 表達(dá)的促進(jìn)作用及其意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2016,42(4):681.

[4]Su N,Chen M,Chen S,Li C,Xie Y,Zhu Y,Zhang Y,Zhao L,He Q,Du X,Chen D,Chen L.Overexpression of H1 calponin in osteoblast lineage cells leads to a decrease in bone mass by disrupting osteoblast function and promoting osteoclast formation.J Bone Miner Res.2013 Mar;28(3):660-71.

[5]周 岳,于海蛟,高 涵等.寡核苷酸MT01及其在牙周炎方向的研究進(jìn)展[J].中國實用口腔科雜志,2015,8(7):439-441,446.

[6]Uchihashi K,Aoki S,Matsunobu A,Toda S.Osteoblast migration into type I collagen gel and differentiation to osteocyte-like cells within a self-produced mineralized matrix:a novel system for analyzing differentiation from osteoblast to osteocyte.Bone.2013 Jan;52(1):102-10

[7]馮志遠(yuǎn),石 晶,范 紅,等.寡核苷酸促人牙周膜細(xì)胞增殖及成骨分化的實驗研究[J].中國藥物與臨床,2015,15(11):1536.

[8]馮志遠(yuǎn),范 紅,石 晶,等.寡核苷酸促人牙周膜細(xì)胞成骨向分化機(jī)制的實驗研究[J].中國藥物與臨床,2016,16(9):1266.

[9]Takeyama K,Chatani M,Takano Y,Kudo A.In-vivo imaging of the fracture healing in medaka revealed two types of osteoclasts before and after the callus formation by osteoblasts.Dev Biol.2014 Oct 15;394(2):292-304.

[10]侯 旭,張麗茹.寡核苷酸MT01對成骨細(xì)胞TLR-9及TNF-□mRNA表達(dá)的影響[C].//第十二次全國口腔正畸學(xué)術(shù)會議論文集.2013:1-1.

[11]李東文.特定序列寡核苷酸對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響[D].佳木斯大學(xué),2014.

[12]Kim SE,Suh DH,Yun YP,Lee JY,Park K,Chung JY,Lee DW.Local delivery of alendronate eluting chitosan scaffold can effectively increase osteoblast functions and inhibit osteoclast differentiation.J Mater Sci Mater Med.2012 Nov,23(11):2739-49.

[13]陳 明,董啟榕,黃 群,等.0.5 Gy X線照射對MC3T3-E1成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2016,96(33):2659.

[14]衛(wèi)鵬斌.VEGF在BMP-2促進(jìn)骨質(zhì)疏松性成骨細(xì)胞成骨過程中作用機(jī)制的研究[D].山西醫(yī)科大學(xué),2015.

[15]衛(wèi)鵬斌,張 民,李 軍,等.VEGF在BMP-2促進(jìn)骨質(zhì)疏松性成骨細(xì)胞過程中作用機(jī)制的研究[J].中國臨床實用醫(yī)學(xué),2015,17(3):13.

1007-4287(2017)08-1430-03

2016-07-23)