張曉凱，王 哲，戴昕倫，鄒勤光，賈春祎，張立新，王啟文*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院 胸外二科，吉林 長春130012;2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

*通訊作者

可手術(shù)切除的Ⅲa期NSCLC術(shù)中檢測血漿游離DNA的意義

張曉凱1，王 哲1，戴昕倫2，鄒勤光1，賈春祎1，張立新1，王啟文1*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院 胸外二科，吉林 長春130012;2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。2010年我國新發(fā)肺癌病例數(shù)高居惡性腫瘤榜首[1,2]。 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的類型，約占所有肺癌總數(shù)的80%，大多數(shù)NSCLC患者確診時已處于中、晚期，我們對于其中可完全切除的部分Ⅲa期非小細(xì)胞肺癌，術(shù)前及術(shù)后3年內(nèi)定期檢測血漿游離DNA，通過分析非小細(xì)胞肺癌患者治療前后血漿游離 DNA水平的變化，可間接反映肺癌患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷，對于微小殘留病灶導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的監(jiān)測，并在肺癌臨床療效的評價中具有一定的應(yīng)用價值，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 收集 2013年6月-2013年12月我科收治的非小細(xì)胞肺癌患者 89 例，男性，58例，女性，31例，年齡 43 -76 歲，中位年齡 52.4 歲; 所有患者術(shù)前均有細(xì)胞病理學(xué)證據(jù)確診為非小細(xì)胞肺癌，89例患者均行手術(shù)治療，61例行胸腔鏡下肺癌根治術(shù)，28例開胸行肺癌根治術(shù)，術(shù)后病理，腺癌49例，鱗癌 34例 其他6例，術(shù)后病理分期均為Ⅲa期，術(shù)后均行含鉑兩藥方案輔助化療4周期，89例病人在術(shù)前，術(shù)后3周，術(shù)后3個月，12個月，24個月，36個月行血漿游離DNA檢測。同時對門診行健康體檢者65例作為對照組,男性,43例,女性,22例,年齡 39-65歲，中位年齡 46.7歲。

1.2 血漿標(biāo)本采集

分別抽取檢測對象前臂靜脈血4 ml，(肺癌患者在術(shù)前及術(shù)后定 期進(jìn)行抽血)放入EDTA 抗凝管中，室溫放置 2 h 后用低溫高速離心機(jī) 20 ℃ ，離心半徑15 cm，3 000 r /min，離心10 min，取上層血漿放入凍存管，置于-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血漿 DNA 提取及濃度檢測

血漿游離 DNA 用 QIAamp DNA Blood Mini Kit 試劑盒( 德國，Qiagen 公司) 提取。提取的血漿游離 DNA 置于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩２捎脤崟r熒光定量PCR法進(jìn)行血漿循環(huán)腫瘤 DNA的檢測。實時熒光定量 PCR 使用SYBR( TaKaRa 公司) 試劑盒，用已知濃度的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品得到的 ct 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ct 值與 DNA 含量的對數(shù)存在線性關(guān)系，用實時熒光定量 PCR儀自帶的分析軟件根據(jù)樣品中的ct值得到樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS12.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù),血漿游離 DNA 水平以χ2±s表示，組間比較應(yīng)用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

此89例患者均行手術(shù)治療，無論其病理分型如何,術(shù)前其血漿游離DNA(cfDNA)均高于門診健康體檢者,其含量約為健康人的 10 倍以上,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)見表1。病人術(shù)后3周的血漿游離DNA明顯低于術(shù)前,與術(shù)前比較差異具有顯著性(P<0.01)見表2,術(shù)后3月,12月變化不大。而不同病理分型分組比較,肺腺癌與肺鱗癌的患者血漿游離DNA水平比較無顯著性(P>0.05)見表2。術(shù)后24月檢查時,有12人明顯升高,術(shù)后36月檢查時有19人明顯升高,結(jié)合其他檢查,發(fā)現(xiàn)均有局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移.其中支氣管殘端復(fù)發(fā)3例,縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例,遠(yuǎn)處臟器(肝臟,腦,多發(fā)骨)轉(zhuǎn)移12例，與未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者比較具有顯著性(P<0.01)，見表3。

表1 肺癌組(術(shù)前)與對照組血漿游離DNA(cfDNA)水平 (ng/ml)

表2 不同病理類型肺癌及術(shù)前,術(shù)后3周，3月,12月血漿游離DNA(cfDNA)水平 (ng /ml)

表3 術(shù)后24月,36月血漿ctDNA水平(ng/ml)

3 討論

血游離DNA又稱循環(huán)DNA，是指血液循環(huán)中具有DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的核苷酸片段，在血液中,大部分以游離形式存在，稱為游離DNA(cell-free DNA cfDNA)其余部分通過與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物或附著在細(xì)胞表面[3]，Anker等[4]研究表明，正常人血游離DNA大多來源于血細(xì)胞，其含量極低，在100 μg/L 之下，平均約為 30 μg/L 。而腫瘤患者的外周血游離 DNA 主要來源于腫瘤細(xì)胞壞死凋亡后擴(kuò)散，或增生活躍腫瘤細(xì)胞的釋放。腫瘤細(xì)胞在壞死、凋亡后釋放出可以在人體血液系統(tǒng)中不斷循環(huán)的腫瘤基因組游離 DNA 片段，其濃度可高達(dá)1000 μg/L，平均值為180 μg/L[5]。本組肺癌患者的血漿游離 DNA 明顯高于健康體檢人群，其含量約為健康人的 10 倍以上，說明行血漿游離 DNA 檢查是對肺癌高危人群的早期篩查和早期診斷的一個重要手段，Chan等[6]研究也證明肺癌患者與健康人的血漿游離 DNA 含量之間存在顯著性差異，檢測血漿游離 DNA 水平可用于肺癌的早期篩查。本研究提示血漿游離DNA含量與病理類型無明顯相關(guān)性，與國外學(xué)者Szpechcinski 等[7]的研究結(jié)果相一致，但國內(nèi)張弦等[8]研究，結(jié)果是肺腺癌患者血漿游離 DNA 水平要高于肺鱗癌患者。是否因為不同組織學(xué)類型的非小細(xì)胞肺癌存在代謝組學(xué)及基因組學(xué)上的差異，還可能存在增殖動力學(xué)上的差異，有待進(jìn)一步驗證。另外本組89例病人完全切除病人術(shù)后3周的血漿游離 DNA 明顯低于術(shù)前,術(shù)后3月,12月變化不大,原因是手術(shù)徹底切除了原發(fā)病灶，表明血漿游離 DNA 能實時體現(xiàn)肺癌患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的變化情況，并在一定時期內(nèi)檢測血漿游離 DNA 水平，無上升趨勢，表明經(jīng)手術(shù)及術(shù)后輔助化療后病情得以有效控制，當(dāng)24月檢查時,有12(12/89 13.5%)人升高,術(shù)后36月檢查時有19人(19/89 21.3%)升高,結(jié)合其他檢查,發(fā)現(xiàn)均有局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移.與Madhavan[9]等研究結(jié)果相一致，造成此結(jié)果的原因是，晚期肺癌患者腫瘤負(fù)荷量增加，腫瘤細(xì)胞數(shù)量大，脫落，壞死機(jī)會增多，此時檢測血漿游離 DNA 可提示血漿cfDNA含量過高，預(yù)示了病情的嚴(yán)重程度，這對于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移提供了一項重要依據(jù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有異常增高時，說明腫瘤負(fù)荷高，應(yīng)及早行全身檢查，找到復(fù)發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移病灶，及時給予包括全身化療，放療，靶向治療，及免疫治療等綜合治療，另外通過檢測肺癌患者血漿游離 DNA 還可以在靶向治療藥物選擇及靶向治療耐藥實時檢測提供依據(jù)[10]。

綜上，血漿游離 DNA 檢測，具有高度特異性及靈敏性，取材方便，易于被病人接受，對于肺癌早期診斷，腫瘤治療療效的評估及判斷腫瘤是否有復(fù)發(fā)及進(jìn)展等方面具有一定的應(yīng)用價值。

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1007-4287(2017)08-1343-03

2016-08-14)