李隔萍, 高 遠(yuǎn), 劉 磊, 李 夏, 任安芝, 高玉葆

南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津 300071

內(nèi)生真菌對(duì)氮添加羽茅根際土壤特性和微生物群落的影響

李隔萍, 高 遠(yuǎn), 劉 磊, 李 夏, 任安芝*, 高玉葆

南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津 300071

內(nèi)生真菌不僅能改變與其共生植物的生理和生長(zhǎng)指標(biāo),還可通過(guò)宿主植物間接對(duì)土壤的理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。以天然禾草——羽茅(Achnatherumsibiricum)為研究材料,探究在不同施氮水平下,內(nèi)生真菌的種類對(duì)不同基因型的宿主植物根際土壤理化性質(zhì)和微生物群落產(chǎn)生何種影響。結(jié)果表明,內(nèi)生真菌侵染顯著提高了羽茅根際土壤的pH值和微生物總量,但降低了土壤中真菌與細(xì)菌的比值。同時(shí),土壤的pH值還受到了內(nèi)生真菌種類的影響,其中感染Epichlo?sibirica的羽茅根際土壤pH顯著高于感染Epichlo?gansuense- 1的羽茅,而感染Epichlo?gansuense- 2的羽茅根際土壤pH與感染E.gansuensis- 1、E.sibirica菌的羽茅相比沒有顯著差異。另外,內(nèi)生真菌感染與否、內(nèi)生真菌種類、施氮量以及宿主植物基因型對(duì)土壤總碳、總氮、微生物及碳礦化能力均無(wú)顯著影響。

內(nèi)生真菌；土壤pH；土壤微生物；碳礦化

內(nèi)生真菌(endophytic fungi)指的是分布在活體植物組織內(nèi),不引起植物明顯病害癥狀的擁有不同生活策略的真菌[1-2]。內(nèi)生真菌的宿主范圍十分廣泛,涉及多種植物類群[3]。目前為止,研究者已經(jīng)在包含80個(gè)屬近300種禾草中觀察到內(nèi)生真菌的存在[4]。內(nèi)生真菌感染不僅影響宿主植物的生長(zhǎng)和抗逆性[5- 9],而且能夠影響宿主植物的化學(xué)組成。已有研究表明,內(nèi)生真菌感染不僅能使植物產(chǎn)生生物堿[10],還能影響植物體內(nèi)酚類和抗氧化活性物質(zhì)的含量[11],改變宿主氨基酸、水溶性碳水化合物、脂質(zhì)、有機(jī)酸和綠原酸等代謝物含量[12-13]。由內(nèi)生真菌導(dǎo)致宿主化學(xué)組成的變化不僅能影響凋落物的分解[14],并且這些物質(zhì)可能通過(guò)降雨、淋溶等環(huán)境因素進(jìn)入到土壤中[15],進(jìn)一步對(duì)土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。此外,內(nèi)生真菌還可能通過(guò)改變宿主禾草根系分泌物(主要包括糖類、酚類、脂類、羧酸類)的組成和含量[16],改變土壤中有機(jī)物的輸入,進(jìn)而影響土壤碳(C)、氮(N)含量及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[17]。土壤條件的改變對(duì)后期凋落物分解、種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)[18]具有十分重要的影響。

目前,關(guān)于內(nèi)生真菌影響植物生境土壤的研究主要集中在以高羊茅(Loliumarundinaceum)和黑麥草(Loliumperenne)為材料的人工草地上。Franzluebbers等經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)15年的研究,發(fā)現(xiàn)染菌(E+)高羊茅比不染菌(E-)高羊茅樣地土壤具有更高的有機(jī)C和總N含量[19]。以相同的材料和方法,研究者還發(fā)現(xiàn)在較長(zhǎng)時(shí)期(10a)和較短時(shí)期(3a),內(nèi)生真菌侵染均顯著增加了高羊茅生境中土壤有機(jī)C和總N的積累,同時(shí)還降低了土壤呼吸速率和土壤微生物生物量[20]。以黑麥草為研究對(duì)象的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)一個(gè)生長(zhǎng)季的時(shí)間,內(nèi)生真菌沒有改變土壤C和N的含量,但顯著改變了土壤微生物群落組成和功能,主要表現(xiàn)在增加了土壤真菌活性[21]。

相比人工禾草,天然禾草與內(nèi)生真菌的共生關(guān)系更為復(fù)雜多變。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的定向選育,一種栽培禾草中通常只存在1種內(nèi)生真菌,而在天然禾草中,同種宿主禾草往往感染多種內(nèi)生真菌[22-24]。不同的內(nèi)生真菌對(duì)宿主生物堿、氨基酸、酚類等物質(zhì)的影響程度也不盡相同[11, 25]。此外,內(nèi)生真菌和宿主植物之間的相互作用不僅受內(nèi)生真菌種類的影響,還可能與宿主植物基因型[26]以及土壤N素的供給[27]有關(guān)。那么內(nèi)生真菌感染對(duì)天然禾草土壤生境是否有影響？如果有,這種影響是否會(huì)隨內(nèi)生真菌種類的不同而不同呢？本文以天然禾草羽茅(Achnatherumsibiricum)為實(shí)驗(yàn)材料,同時(shí)考慮內(nèi)生真菌種類、宿主羽茅基因型及共生體的N素供應(yīng)3個(gè)因子,通過(guò)比較研究不同處理?xiàng)l件下羽茅生境土壤理化性質(zhì)及土壤微生物群落的差異,探討內(nèi)生真菌感染對(duì)其天然禾草宿主生境的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究以禾本科植物——羽茅(Achnatherumsibiricum)為研究材料。羽茅為芨芨草屬(Achnatherum)多年生植物,主要分布于我國(guó)東北、華北和西北等地區(qū)。不同地理種群的羽茅的內(nèi)生真菌感染率接近100%[28]。實(shí)驗(yàn)所用羽茅種子采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院呼倫貝爾草原生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站(119.67°E, 49.10°N),采集間隔大于5 m。考慮到羽茅為異花授粉植物,本文將采自同一穗的種子作為一個(gè)母本植物基因型,然后對(duì)來(lái)自200個(gè)不同母本基因型的羽茅種子的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化,通過(guò)形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析相結(jié)合的方法,鑒定出2種Epichlo?屬的內(nèi)生真菌：Epichlo?sibirica(Es)和Epichlo?gansuense(Eg)。其中,E.gansuense存在兩種不同傳播方式：E.gansuensis- 1 (Eg1)在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢,通過(guò)種子垂直傳播,E.gansuensis- 2 (Eg2)在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快,傳播方式為混合傳播。

本實(shí)驗(yàn)選取9個(gè)不同植物母本基因型的羽茅作為實(shí)驗(yàn)材料：其中3個(gè)基因型的羽茅種子感染Eg1,3個(gè)基因型的羽茅種子感染Es,3個(gè)基因型的羽茅種子感染Eg2。將感染不同內(nèi)生真菌的9個(gè)植物母本基因型羽茅的種子分為兩份,一份置于4℃冰箱保存,另一份在60℃下高溫處理30 d,以獲得不染菌種子[29]。取飽滿的9個(gè)母本基因型的染菌(E+)和不染菌(E-)羽茅種子,分別播種于口徑為280 mm、深度為220 mm的白色塑料盆,置于南開大學(xué)網(wǎng)室遮雨棚下培養(yǎng)。待植株生長(zhǎng)1個(gè)月后,選擇大小一致且生長(zhǎng)良好的幼苗,每盆定株到6株用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)N素施加濃度,分為低N (NL)和高N (NH) 2個(gè)處理水平。所有處理分別設(shè)置3個(gè)重復(fù),共計(jì)108盆。實(shí)驗(yàn)用土為沙質(zhì)土壤,總N含量為0.12 g/kg、全磷含量為0.186 g/kg、有機(jī)質(zhì)含量為4.79 g/kg、pH為8.12。根據(jù)內(nèi)蒙古草原羽茅自然分布區(qū)土壤N素含量的低限和高限設(shè)置施N量,使用CaCl2和KCl分別替代Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中的Ca(NO3)2和KNO3,通過(guò)控制添加NH4NO3的量來(lái)控制N素濃度：高N,每周澆灌1—2次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液,每次800 mL/盆,N素添加濃度為140 mg N/L,共施加15次；低N,每周澆灌1—2次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液,每次800 mL/盆,N素添加濃度為14 mg N/L,共施加15次。

實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為85 d,每2周隨機(jī)調(diào)換花盆的位置,以消除位置效應(yīng),并及時(shí)清理羽茅植株上的枯葉,以排除枯落物的影響。實(shí)驗(yàn)收獲時(shí)從每盆取植物根圍土壤1 L。將各盆中所取土樣混合均勻后過(guò)1 mm篩子,分為兩部分,一部分放入-20℃冰凍保存,用于測(cè)土壤C礦化率和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化,另一部分風(fēng)干,供測(cè)定土壤pH值及C、N含量。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤C、N含量用元素分析儀(Vario EL/micro cube, Elementar, Hanau, Germany)進(jìn)行測(cè)定。土壤pH值用Sartorius pH計(jì)測(cè)定(土壤∶水=1∶5)。

1.3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

采用磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid, PLFA)溫和甲酯化法[30]測(cè)定土壤PLFA。樣品處理如下：從-20℃冰箱取出土樣置于常溫下,稱取6g解凍后的土壤置于5ml離心管中,向離心管中加入15 mL 0.2 mol/L醇化的KOH溶液,振蕩均勻后,置于37℃下反應(yīng)1 h,期間每隔10 min渦旋1次。然后加入3 mL濃度為1 mol/L的冰醋酸和10 mL正己烷。離心10 min,將上層的有機(jī)相轉(zhuǎn)移到試管中,氮?dú)庀麓蹈?再向試管中加入480 μL 體積比為1∶1的正己烷：甲基叔丁基醚溶液。將試管中溶液倒入裝有20 μL C19內(nèi)標(biāo)物的GC衍生瓶中,放入氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析儀(Agilent 7890GC 5975MSD)中分析。

磷脂脂肪酸含量計(jì)算公式為：

PLFA(nm/g土樣)=(PPLFA×S×V)/(POSTD×D×R×W×M)

式中,PPLFA為樣品峰面積; POSTD為內(nèi)標(biāo)物峰值面積;S為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度,1mg/mL;D為稀釋倍數(shù),25;R為分取倍數(shù),1/500;V為樣品的測(cè)定體積,1μL;W為土壤烘干質(zhì)量(g)。

1.4 土壤C礦化的測(cè)定

土壤C礦化能力采用室內(nèi)培養(yǎng)、堿液吸收法[31]進(jìn)行測(cè)定。稱取30 g(風(fēng)干質(zhì)量)的新鮮土樣,加水調(diào)節(jié)土壤至相同含水量30%。將土壤置于250 mL廣口瓶,再向瓶中放入一個(gè)盛有10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液的小燒杯,并用保鮮膜密封好。另外設(shè)置3個(gè)不放土壤、裝有NaOH溶液的空白瓶。一同放入(25±1)℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)的第2、4、6、9、13、17、22、30天取出燒杯,將堿液完全倒入50 mL三角瓶中,加入過(guò)量的1 mol/L BaCl2溶液及酚酞指示劑,用0.1 mol/L HCl滴定剩余的NaOH溶液,記錄所用HCl的體積。

C礦化速率的計(jì)算公式為:

當(dāng)前，高職院校護(hù)理專業(yè)的信息化教學(xué)資源與醫(yī)院實(shí)際護(hù)理信息系統(tǒng)存在脫節(jié)的情況，即護(hù)理專業(yè)學(xué)生在院校學(xué)習(xí)過(guò)程中很難接觸到實(shí)際工作中需要用到的信息系統(tǒng)，這也就使得護(hù)理專業(yè)學(xué)生在進(jìn)入醫(yī)院進(jìn)行護(hù)理實(shí)習(xí)時(shí)，需要進(jìn)行二次培訓(xùn)，無(wú)形中增加了培訓(xùn)成本。為了避免這一問題的出現(xiàn)，增強(qiáng)護(hù)理專業(yè)學(xué)生的護(hù)理專業(yè)能力，在教育信息化背景下，要求護(hù)理專業(yè)教學(xué)加強(qiáng)與醫(yī)院的合作，積極開設(shè)第二課堂，改變以往護(hù)理專業(yè)校內(nèi)教學(xué)與醫(yī)院護(hù)理崗位實(shí)習(xí)相脫離的教學(xué)現(xiàn)狀。

C=(V0-V) ×CHCl/2×44×12/44×1/m(1-30%)t

式中,C表示培養(yǎng)期間土壤的C礦化速率(mg g-1d-1),V0表示空白對(duì)照所消耗的HCl體積(mL),V為樣品滴定時(shí)所消耗的HCl體積(mL),CHCl為HCl濃度(mol/L),m為每個(gè)廣口瓶中培養(yǎng)土壤的濕重(g),t為培養(yǎng)天數(shù)(d)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 16.0和SYSTAT 13對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差(ANCOVA)分析,以探究?jī)?nèi)生真菌感染與否、N素添加及植物母本基因型對(duì)羽茅根際土壤指標(biāo)的影響,其中植物母本基因型嵌套在不同的內(nèi)生真菌中。采用SPSS 21.0對(duì)染菌羽茅根際的土壤數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析,以探究?jī)?nèi)生真菌種類和N素添加對(duì)土壤的影響。ANOVA分析前,數(shù)據(jù)均滿足方差齊性要求,然后應(yīng)用Tukey HSD檢驗(yàn)法對(duì)各土壤指標(biāo)進(jìn)行多重比較,3種內(nèi)生真菌處理之間的土壤pH比較除外(LSD)。數(shù)據(jù)處理和作圖采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 土壤的C、N含量和土壤C礦化

內(nèi)生真菌感染與否、N素及植物基因型對(duì)土壤總C含量、總N含量、C/N比值以及累計(jì)C礦化量均未產(chǎn)生顯著影響。感染Eg1、Eg2和Es的羽茅之間的根際土壤中C、N的含量、C/N比值以及累計(jì)C礦化量也無(wú)明顯差異。

2.2 土壤pH

染菌和不染菌羽茅根際土壤的pH存在顯著差異,表現(xiàn)為E+ > E-(圖1)。此外,土壤pH值也受到不同內(nèi)生真菌菌株的影響,即感染Es的羽茅根際土壤pH要顯著高于感染Eg1的羽茅,而感染Eg2的羽茅根際土壤pH與感染Eg1、Es菌的羽茅相比沒有顯著差異(圖1)。

圖1 內(nèi)生真菌染菌狀態(tài)對(duì)羽茅根圍土壤pH的影響Fig.1 Soil pH with different fungal endophyte infections *代表在P<0.05水平上差異顯著,不同字母代表每個(gè)處理下的差異顯著(P<0.05)

從土壤中分離得到的C14-C20之間的磷脂脂肪酸含量相加得到總的微生物生物量,用15:0、16:0、17:0、16:1ω9c、cy17:0、cy19:0、18:0來(lái)表征細(xì)菌,i15:0、i16:0、a16:0、i17:0表征革蘭氏陽(yáng)性菌(G+),16:1ω9c、cy17:0來(lái)表征革蘭氏陰性菌(G-),18:1ω9c、18:1ω9t、18:2ω9, 12c表征真菌,10Me16:0、10Me17:0、10Me18:0表征放線菌[32-35]。不同處理的所有土壤(共108個(gè))的PLFA數(shù)據(jù)(表征細(xì)菌、G+、G-、真菌和放線菌的PLFA含量)進(jìn)行NMDS分析,結(jié)果顯示無(wú)論是高N處理(圖2A)還是低N處理(圖2B)下,從染菌不染菌(“+”代表染菌,“-”代表不染菌)、不同內(nèi)生真菌以及基因型等方面來(lái)看,都沒有發(fā)現(xiàn)各處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的差異。方差分析的結(jié)果顯示,內(nèi)生真菌感染顯著提高了羽茅根際土壤的微生物總量、顯著降低了土壤中真菌和細(xì)菌的比值,但未對(duì)真菌、細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、放線菌產(chǎn)生顯著的影響(表1,圖3)。內(nèi)生真菌種類和宿主植物基因型沒有顯著影響土壤微生物(表1,表2),4種不同的染菌狀態(tài)(感染3種內(nèi)生真菌和不染菌)對(duì)土壤中表征各類微生物的PLFA含量也沒有顯著影響。

表1 內(nèi)生真菌感染、氮素添加、內(nèi)生真菌種類以及植物母本基因型對(duì)土壤微生物磷脂脂肪酸(PLFA)含量影響的方差分析結(jié)果

Table 1 Multiple analysis of variance for the effects of endophyte infection, nitrogen addition and maternal plant genotype on content of microbial phospholipid fatty acids (PLFAs) of rhizosphere soil ofAchnatherumsibiricum

處理TreatmentdfPLFA總量TotalPLFAs細(xì)菌Bacteria真菌FungiG+G-放線菌Actinomycetes真菌/細(xì)菌Fungi:BacteriaG+/G-FPFPFPFPFPFPFPFPN13.5630.0632.8630.0952.3260.1310.0110.9170.0060.9371.2290.2713.4770.0660.6750.414E15.2730.0243.3790.0701.5390.2180.0470.8290.3150.5763.8960.0524.2900.0420.0000.994PG(EG)61.6030.1571.4870.1930.7340.6243.4240.0611.6460.1451.6300.1501.4400.2100.5180.183E×N10.0460.8310.0040.9492.7550.1010.0040.9510.2290.6330.0150.9020.0340.8541.2800.276N×PG(EG)60.9670.4530.9790.4451.2470.2921.0160.4211.0550.3971.0010.4301.3520.2440.7200.634E×PG(EG)60.2710.9490.2600.9541.2490.2900.7450.6150.2810.9450.2800.9450.4270.8591.1760.328E×N×PG(EG)60.5620.7590.5810.7450.6780.6681.0710.3870.6200.7140.5810.7440.7590.60403020.266誤差Error80

N: 氮素添加nitrogen availability,E: 內(nèi)生真菌感染,PG(EG) endophyte infection. PG (EG),: 植物母本基因型(嵌套于不同內(nèi)生真菌)maternal plant genotype (nested within endophyte type),G+: 革蘭氏陽(yáng)性菌Gram-positive bacteria,G-: 革蘭氏陰性菌Gram-negative bacteria;當(dāng)Sig<0.05時(shí),字體用黑色標(biāo)記,表示差異顯著

表2 不同內(nèi)生真菌和氮素添加對(duì)羽茅根際土壤微生物磷脂脂肪酸(PLFA)含量影響的影響的方差分析

Table 2 Analysis of variance for the effects of endophyte types and nitrogen availability on content of microbial phospholipid fatty acids (PLFAs) under differentAchnatherumsibiricumrhizosphere soil

處理TreatmentdfPLFA總量TotalPLFAs細(xì)菌Bacteria真菌FungiG+G-放線菌Actinomycetes真菌/細(xì)菌Fungi:BacteriaG+/G-FPFPFPFPFPFPFPFPEG20.1430.8670.1600.8530.1480.8630.0280.9720.1380.8710.1420.8680.1020.9030.0630.939N11.4720.2311.7200.1963.8330.0561.2790.2640.17606770.8050.3741.6130.1280.0220.661N×EG20.5430.5840.5210.5970.1760.8390.4500.6400.5350.5890.5420.5850.4880.6170.8940.416誤差Error48

EG： 不同內(nèi)生真菌endophyte type;N： 氮素添加nitrogen availability;G+： 革蘭氏陽(yáng)性菌Gram-positive bacteria;G-： 革蘭氏陰性菌Gram-negative bacteria;當(dāng)Sig<0.05時(shí),差異顯著

圖2 個(gè)不同處理土壤樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)的NMDS分析(數(shù)字1—9代表不同的基因型)Fig.2 Nonmetric Multidimensional Scaling analysis of microbial community of soils in different treatments (The number 1—9 represent different genotypes)

圖3 內(nèi)生真菌感染對(duì)土壤微生物總量、真菌/細(xì)菌比值的影響Fig.3 Content of total PLFAs and fungi: bacteria ratio in rhizosphere soil under endophyte-infected (E+) and endophyte-free (E-) Achnatherum sibiricum

3 討論

3.1 氮素和宿主植物基因型對(duì)羽茅-內(nèi)生真菌共生體根際土壤的影響

作為植物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素,N素對(duì)內(nèi)生真菌—植物共生關(guān)系的影響不容忽視。一系列的研究表明,內(nèi)生真菌對(duì)植物的有利影響多是在N素供給充足的條件下得到的,當(dāng)N素缺乏時(shí),這種有利影響會(huì)減弱甚至變?yōu)椴焕鸞27, 36],其原因可能是因?yàn)镹素供應(yīng)不足時(shí),植物獲取的可利用N被優(yōu)先支配用于自身生存生長(zhǎng)所消耗,從而限制了內(nèi)生真菌有益作用的發(fā)揮。N素添加不僅會(huì)影響植物的生長(zhǎng),還可以影響土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)[37- 38]。研究表明,隨N素添加,內(nèi)蒙古典型草原土壤中細(xì)菌、放線菌和微生物總PLFA含量呈上升趨勢(shì),但對(duì)真菌含量無(wú)顯著影響,并且真菌/細(xì)菌比隨N含量增加而降低[39]。而本文發(fā)現(xiàn),高水平的N并沒有對(duì)土壤的各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)產(chǎn)生顯著的影響,可能是因?yàn)楸狙芯克O(shè)置的高N和低N是依據(jù)羽茅自然生境中的N素含量設(shè)計(jì)的,N素更多的作用于宿主本身用于植物生物量的增加,而土壤N含量并無(wú)顯著增加。本文推測(cè),如果分別進(jìn)行過(guò)飽和施N和不施N添加,可能會(huì)使內(nèi)生真菌對(duì)土壤的作用更為明顯。

內(nèi)生真菌和宿主的相互作用除與環(huán)境條件有關(guān)外,還可能和植物的基因型相關(guān)[40]。以不同母本基因型的黑麥草為研究材料,發(fā)現(xiàn)植物基因型和內(nèi)生真菌感染的交互作用能夠影響宿主的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生物量及生殖生長(zhǎng)等多項(xiàng)指標(biāo)[40-42],以4個(gè)不同母本基因型的亞利桑那羊茅為研究材料,發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌感染僅增加了其中的2個(gè)母本基因型宿主的生長(zhǎng)速率[26]。本實(shí)驗(yàn)室關(guān)于宿主基因型對(duì)羽茅-內(nèi)生真菌共生體生長(zhǎng)和生理特征影響的研究結(jié)果表明,宿主基因型對(duì)羽茅的生理生長(zhǎng)指標(biāo)均無(wú)影響(待發(fā)表數(shù)據(jù)),本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)宿主植物基因型對(duì)共生體所在生境土壤理化性質(zhì)和土壤微生物均無(wú)顯著影響。

3.2 內(nèi)生真菌感染對(duì)土壤C、N的影響

關(guān)于內(nèi)生真菌通過(guò)影響植物而對(duì)土壤產(chǎn)生影響的相關(guān)研究較少,結(jié)論也不盡一致。Iqbal等[43]對(duì)美國(guó)東南部9個(gè)染菌率不同的高羊茅種植區(qū)的土壤進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在同一高羊茅樣地感染內(nèi)生真菌比非感染內(nèi)生真菌的高羊茅種植點(diǎn)的有機(jī)C和總N含量分別高出6%和5%。Franzluebbers等[19]發(fā)現(xiàn)感染內(nèi)生真菌的高羊茅可提高土壤對(duì)C、N的固定能力,進(jìn)一步促進(jìn)周圍環(huán)境中的高羊茅的生長(zhǎng)。與之相對(duì)照,Handayani等[44]的研究卻發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌感染沒有使高羊茅所在土壤的總C和N含量發(fā)生顯著變化,而土壤C組分(根據(jù)土壤中團(tuán)聚體的大小分組)相比總C變化更為明顯。關(guān)于內(nèi)生真菌對(duì)土壤C、N含量的影響機(jī)制,目前認(rèn)為是：內(nèi)生真菌通過(guò)改變植物的化學(xué)組成,使得感染內(nèi)生真菌與非感染內(nèi)生真菌的植物枯葉質(zhì)量產(chǎn)生差異,因而以不同的分解速度進(jìn)行分解,間接對(duì)土壤C、N產(chǎn)生一定影響[14]。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌感染對(duì)土壤總C和總N的含量沒有產(chǎn)生顯著的影響,這與本研究在植物材料培養(yǎng)期間及時(shí)將枯黃葉片移除,并未涉及到凋落物的分解有關(guān)。本文的結(jié)果也證實(shí)了內(nèi)生真菌通過(guò)植物代謝物和根系分泌物所發(fā)揮的影響不大,因此可能主要通過(guò)凋落物分解過(guò)程影響土壤總C和N的含量。另外,基于前人的研究,推測(cè)另一個(gè)可能的原因是：植物在感染內(nèi)生真菌后,排除凋落物的影響,需要一個(gè)更長(zhǎng)的生長(zhǎng)時(shí)期來(lái)改變土壤的養(yǎng)分條件[21,45],短期的研究可能檢測(cè)不到土壤C、N的差異[43]。

3.3 內(nèi)生真菌感染對(duì)土壤pH的影響

內(nèi)生真菌可以改變宿主根系分泌物如糖類、酚類、脂類及羧酸類等的組成和含量[46],如Heck等發(fā)現(xiàn)染菌高羊茅根系分泌物中的碳水化合物和有機(jī)C含量顯著高于不染菌高羊茅[17]；Malinowski等發(fā)現(xiàn)染菌高羊茅的分泌物中酚類物質(zhì)含量要高于不染菌植株[47]。本研究發(fā)現(xiàn),感染內(nèi)生真菌使羽茅根際周圍土壤的pH高于不染菌羽茅。其原因可能是內(nèi)生真菌感染導(dǎo)致羽茅的代謝活動(dòng)乃至其根系分泌物成分發(fā)生改變,也可能是因?yàn)槿揪参矬w內(nèi)的代謝物質(zhì)通過(guò)澆水、淋溶等因素進(jìn)入土壤中的酸性物質(zhì)相對(duì)較少,因而使土壤具有較高的pH。此外,本研究對(duì)比感染3種內(nèi)生真菌菌株的羽茅根際土壤的pH,發(fā)現(xiàn)Es顯著高于Eg1菌,但兩者與Eg2菌均無(wú)顯著差異,說(shuō)明不同內(nèi)生真菌菌株對(duì)植物次生代謝物和根系分泌物的影響可能不同,從而對(duì)土壤的pH影響程度也不相同。一般情況下,微酸性和微堿性之間的土壤環(huán)境更適宜微生物的生存[48],土壤pH發(fā)生改變不僅會(huì)影響土壤微生物的生長(zhǎng)和功能[49],影響土壤中細(xì)菌和真菌的比例[50],還可能會(huì)對(duì)土壤動(dòng)物及其他植物的生長(zhǎng)造成一定的影響,進(jìn)而影響整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。關(guān)于內(nèi)生真菌影響土壤pH的相關(guān)研究還未見報(bào)道,具體的影響機(jī)制也尚不明確,本研究未對(duì)羽茅次級(jí)代謝物、根系分泌物成分進(jìn)行收集和分析對(duì)比,有待進(jìn)一步研究。

3.4 內(nèi)生真菌感染對(duì)土壤微生物的影響

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,參與有機(jī)物的分解,腐殖質(zhì)的形成,養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等生化過(guò)程,推動(dòng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng),對(duì)于評(píng)價(jià)土壤肥力和土壤養(yǎng)分可利用性具有重要意義[51]。有研究發(fā)現(xiàn)感染內(nèi)生真菌的禾草可以引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化[52],這一影響逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。Iqbal等[43]和Handayani等[44]研究發(fā)現(xiàn),感染內(nèi)生真菌能刺激高羊茅根圍土壤微生物生物量的增加。同時(shí),Hecke等[17]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的存在顯著增加了高羊茅根際土壤微生物生物量,但對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)并無(wú)影響。黃璽等[53]以醉馬草為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)醉馬草-內(nèi)生真菌共生體對(duì)土壤微生物有顯著影響：醉馬草根際土壤中微生物的數(shù)量顯著高于其伴生種根際的土壤。然而,也有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)生真菌對(duì)土壤微生物群落存在其他不同的影響,如抑制土壤微生物活性[19]、降低土壤中多種細(xì)菌的含量[54]、降低革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和叢枝菌根菌數(shù)量等[52,55]。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)羽茅內(nèi)生真菌顯著增加了其根際土壤的微生物生物量,降低了真菌與細(xì)菌的比例。很可能是由于內(nèi)生真菌通過(guò)某種方式該變了羽茅根系分泌物如小分子量碳水化合物、氨基酸和有機(jī)酸等物質(zhì)[56]的含量[57],根際分泌物組分的變化可能會(huì)改變土壤微生物結(jié)構(gòu),增加生物量。此外,本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌還可使土壤的pH增加,高的pH可能會(huì)促進(jìn)土壤中相關(guān)微生物的增長(zhǎng)[58],降低真菌的含量,使細(xì)菌的含量增加[50]。目前,關(guān)于內(nèi)生真菌對(duì)土壤微生物群落影響的相關(guān)研究還很少,且缺乏明確的機(jī)制來(lái)解釋內(nèi)生真菌對(duì)土壤微生物產(chǎn)生的影響,這就需要進(jìn)行更深入的研究來(lái)探討。

致謝：呼倫貝爾草原生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站提供支持,特此致謝。

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Effects of fungal endophytes on properties and microbial community structure of the rhizosphere soil ofAchnatherumsibiricumin nitrogen addition conditions

LI Geping, GAO Yuan, LIU Lei, LI Xia, REN Anzhi*, GAO Yubao

College of Life Science, Nankai University, Tianjin 300071, China

Simultaneous infections of host plants with endophytic fungi are common in both natural and agricultural ecosystems. Endophyte-infected (E+) grasses may differ in chemical composition and root exudates from endophyte-free (E-) individuals, and these differences may indirectly affect soil properties and microbial communities in the host grass habitat. In this study, we used as plant materialAchnatherumsibiricum, a native grass, naturally infected with two species of endophytes, includingEpichlo?sibiricaandE.gansuensis.E.gansuensishas two morphotypes,E.gansuensis- 1 andE.gansuensis- 2,of whichE.gansuensis- 1 exhibits strict vertical transmission, whileE.gansuensis- 2 can be transmitted vertically as well as horizontally. The objective of this study was to explore the effect of endophyte infection, endophyte species, nitrogen availability, and maternal plant genotype on the physicochemical properties and microbial communities of soil in theA.sibiricumhabitat. At the end of a pot experiment, we analyzed the soil total carbon (C) and nitrogen (N), determined soil pH, and estimated the soil C mineralization. Soil microbial biomass and community composition were assayed by using the phospholipid fatty acid (PLFA) technique. In the present study, we found that the soil pH value differed significantly between the E+ and E- treatments (E+ > E-). In addition, the soil pH was influenced by endophyte species: pH in theE.sibirica-infected condition was higher than that in theE.gansuense- 1 infected condition, but the difference was not significant with theE.gansuense- 2 condition. Endophyte infection significantly improved the total amount of rhizosphere microorganisms but reduced soil bacterial:fungal ratio. Endophyte status and species, nitrogen addition, and maternal plant genotype had no significant effects on soil total carbon (C) and nitrogen (N), rhizosphere microorganisms and C mineralization ability. This study suggested that endophyte infection could alter soil pH and microbial community structure, and endophytic fungi may change soil total C and N with more available nitrogen or in the long-term. These conclusions provided some experimental basis for further understanding the complex symbiotic relationship between fungal endophytes and native grasses and its role in ecosystem C and N cycling.

fungal endophyte; soil pH; soil microbial; C mineralization

國(guó)家自然科學(xué)基金(31270463,31570433)；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20130031110023)

2016- 01- 22; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2017- 02- 23

10.5846/stxb201601220154

*通訊作者Corresponding author.E-mail: renanzhi@nankai.edu.cn

李隔萍, 高遠(yuǎn), 劉磊, 李夏, 任安芝, 高玉葆.內(nèi)生真菌對(duì)氮添加羽茅根際土壤特性和微生物群落的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(13):4299- 4308.

Li G P, Gao Y, Liu L, Li X, Ren A Z, Gao Y B.Effects of fungal endophytes on properties and microbial community structure of the rhizosphere soil ofAchnatherumsibiricumin nitrogen addition conditions.Acta Ecologica Sinica,2017,37(13):4299- 4308.