熊 爽，劉成雁，王志嘉，李 紅，任雪冬，王 璐，田福林，趙海波

(遼寧省分析科學研究院 遼寧省標準化體系建設工程技術研究中心，遼寧 沈陽 110015)

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定祛痘類化妝品中保泰松與氨基比林的研究

熊 爽，劉成雁*，王志嘉，李 紅，任雪冬，王 璐，田福林，趙海波

(遼寧省分析科學研究院 遼寧省標準化體系建設工程技術研究中心，遼寧 沈陽 110015)

建立了快速測定祛痘類化妝品中保泰松和氨基比林的固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析方法。樣品以乙腈為提取溶劑超聲萃取，經Oasis HLB固相萃取柱凈化濃縮后，采用Eclipse XDB-C18(3.5 μm，4.6 mm×150 mm)色譜柱進行分離，甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨溶液為流動相梯度洗脫，流速為0.5 mL·min-1。采用電噴霧正離子源(ESI+)，多反應監(jiān)測(MRM)掃描方式檢測，基質匹配標準曲線法定量。結果表明，保泰松和氨基比林在2.0～200.0 μg·L-1范圍內線性關系良好，相關系數(shù)(r2)均大于0.99，方法檢出限分別為1.5、0.8 μg·kg-1，定量下限分別為4.9、2.7 μg·kg-1。低、中、高3個加標水平下的平均回收率為77.8%～93.4%，日內相對標準偏差(RSD)為2.4%～7.8%，日間RSD為3.6%～9.5%。該方法簡捷、快速、檢出限低，能夠為化妝品中保泰松和氨基比林殘留狀況的監(jiān)測工作和產品質量控制提供科學依據(jù)和技術支持。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜；化妝品；保泰松；氨基比林；固相萃取

近年來化妝品已成為人們生活中的必需品，其安全性問題引起了廣泛關注，對其質量的要求也越來越嚴格。保泰松(Phenylbutazone)屬吡唑酮類解熱鎮(zhèn)痛消炎藥，其解熱鎮(zhèn)痛作用較弱，但消炎作用較強。臨床研究表明，保泰松具有一定的祛痘、抗粉刺等功效。該類藥物可被添加在祛痘類化妝品中使用，長期接觸或攝入這類化妝品，將造成人體多種器官慢性損傷[1]，嚴重者可引起消化道系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等疾病[2]。為避免含有此類藥物的化妝品給消費者帶來健康危害，我國2015版《化妝品安全技術規(guī)范》中明確規(guī)定保泰松為化妝品組分中禁用物質[3]。由于氨基比林(Aminopyrine)與保泰松同屬非甾體消炎藥，抗菌作用相似，因此將這兩種藥物作為本文的研究對象。

目前關于化妝品中保泰松殘留量測定的國標檢測方法尚未制訂，相關文獻多數(shù)報道保泰松的藥理作用[4-7]，關于保泰松含量的測定方法主要有薄層色譜法(TLC)[8]、原子熒光分光光度法(AFS)[9]、電致化學發(fā)光法(ECL)[10]、高效液相色譜法(HPLC)[11-12]、氣相色譜法(GC)[13]及液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)[14-18]。其中TLC、AFS、ECL法的檢測靈敏度低；HPLC和GC法的選擇性和特異性差，易造成假陽性，不能滿足檢測要求；HPLC-MS/MS法高效快速、靈敏準確，適合于痕量物質的測定分析。但已報道的文獻多以中成藥、保健食品及動物源性食品為研究對象，關于同時測定化妝品中保泰松和氨基比林的方法尚未見報道。本文采用乙腈為提取溶劑超聲萃取，飽和氯化鈉溶液分離乳化，Oasis HLB固相萃取柱凈化后，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定樣品，并進行了完整的方法學確證,考察了固相萃取條件及樣品的基質效應，并采用基質加標法定量消除基質影響。該方法簡捷、快速、檢出限低、重現(xiàn)性好，能夠為化妝品中保泰松和氨基比林殘留的監(jiān)測和產品質量控制提供科學依據(jù)，保障化妝品的衛(wèi)生和安全。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200 UPLC/6410B MS/MS 液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀(美國Agilent公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；Q3200DB型超聲清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；固相萃取裝置(美國Agilent公司)；固相萃取柱：Oasis HLB(500 mg/6 mL)、Oasis MCX(150 mg/6 mL)、C18(500 mg/6 mL)；SBH130D/3型氮吹儀(英國Bibby Stuart公司)；CT14RD型離心機(上海天美科學儀器有限公司)；CPA225D型電子天平(德國Sartorius公司)。

保泰松、氨基比林(純度≥99.5%，德國Sigma公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；乙酸銨、氯化鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液配制與標準曲線

標準儲備液：準確稱取保泰松和氨基比林各5.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，配制成0.1 mg·mL-1的標準儲備液，于-18 ℃冰箱中保存。標準工作溶液：臨用時取適量的標準儲備液，用甲醇配制成質量濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·L-1的系列標準工作溶液?；|匹配標準混合溶液：取不含待測組分的陰性樣品，按“1.3”樣品前處理后作為標準溶液的稀釋液，配制成不同質量濃度的基質匹配標準混合溶液。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品提取 準確稱取樣品0.2 g(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞塑料離心管中，加入3 mL飽和氯化鈉溶液，充分渦旋混勻1 min，加入7 mL乙腈超聲提取15 min，以12 000 r/min高速低溫離心10 min，移取上層清液，重復提取1次，合并提取液。

1.3.2 樣品凈化 依次用5 mL甲醇和10 mL水活化Oasis HLB固相萃取柱，將“1.3.1”中所得提取液過柱，保持重力自流狀態(tài)，棄去流出液，用5 mL水淋洗固相萃取柱，待液體流盡后，用8 mL甲醇(分2次，每次4 mL)洗脫目標物，收集洗脫液，于40 ℃氮氣吹干。樣品用1 mL初始比例流動相溶解，過0.2 μm微孔濾膜，經UPLC-MS/MS測定。

1.4 測定方法

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C18色譜柱(3.5 μm,4.6 mm×150 mm)；流動相：A為10 mmol ·L-1乙酸銨溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序：0～4 min,40%～30% A；4～7 min,30%～20%A；7～8 min,20%～40% A；后運行7 min；流速為0.5 mL·min-1；柱溫 40 ℃；進樣量5 μL。

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源，正離子電離模式(ESI+)；干燥氣(N2)溫度：350 ℃，干燥氣流量：9.0 L·min-1，離子源溫度：350 ℃，霧化氣(N2)壓力：295.4 kPa，電噴霧電壓：4 000 V，掃描方式為多反應監(jiān)測(MRM)模式。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

由于保泰松和氨基比林具有堿性基團，容易加合H+形成帶正電荷的母離子[M+H]+，因此選用ESI+為離子化模式，確定分子離子峰，并對母離子進行碰撞誘導解離，選擇2個信噪比較高的特征子離子分別作為定量、定性離子對，然后對離子源溫度、干燥氣溫度及流量、霧化器壓力等參數(shù)進行優(yōu)化，使待測物的離子化效率達到最佳。其質譜參數(shù)見表1。

表1 保泰松和氨基比林的質譜條件參數(shù)

* quantitative ion

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 根據(jù)待測組分的結構特點，選擇C18反相色譜柱進行分離。實驗考察了Eclipse plus-C18分析柱、Eclipse XDB-C18分析柱和Zorbax SB-C18分析柱的分離效果。結果表明：Eclipse XDB-C18分析柱的柱效高且分離效果最好，尤其是在目標化合物低濃度情況下表現(xiàn)尤佳，可能因為Eclipse XDB-C18分析柱為硅醇基雙封端，分離胺堿類物質峰形尖銳，適用于偏堿性環(huán)境，因此本實驗選其作為分析柱。

圖1 保泰松(峰2)和氨基比林(峰1)的總離子流圖Fig.1 MRM chromatogram of phenylbutazone(2) and amidopyrine(1)

2.2.2 流動相的選擇 考察了在甲醇-水、乙腈-水流動相中分別添加0.1%甲酸、10 mmol·L-1乙酸銨時對待測物色譜行為和離子化程度的影響。通過比較發(fā)現(xiàn)，在同樣的梯度洗脫程序下，使用甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸體系時，氨基比林的峰形不對稱且不平滑，保泰松的響應低，峰形寬，且保留時間長，出峰慢；使用乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨體系時，氨基比林的峰形尖銳，但保泰松與氨基比林的分離效果差，且其峰形展寬；而使用甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨體系時，可獲得最優(yōu)的分離效果和質譜響應信號，且各色譜峰峰形尖銳，這可能是由于甲醇比乙腈更易給出質子，且乙酸銨體系可改善含堿性基團化合物的色譜峰形。故最終確定以甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨水溶液為流動相體系進行梯度洗脫，此時保泰松和氨基比林可在7 min內獲得較好的分離效果(見圖1)。

2.3 樣品提取方法的優(yōu)化

為了減少操作步驟，并獲得盡可能高的提取效率，分別考察了3種不同種類基質(水劑、乳液、膏霜)中的保泰松和氨基比林以甲醇和乙腈作為提取溶劑以及在不同提取時間(5、10、15、20 min)下的提取效果(見表2)。實驗結果表明，乙腈作為提取溶劑、超聲提取15 min時的提取效率最高，表明此時待測組分提取完全。

表2 不同超聲提取時間對保泰松和氨基比林回收率的影響

圖2 不同固相萃取柱對保泰松和氨基比林回收率的影響Fig.2 Effect of different SPE columns on recoveries of phenylbutazone and amidopyrine

2.4 固相萃取條件的優(yōu)化

2.4.1 固相萃取柱的選擇 固相萃取技術(Solid phase extraction，SPE)是化妝品前處理領域應用較為廣泛的一種前處理方法。與傳統(tǒng)液液萃取相比，SPE克服了有機溶劑消耗大、操作復雜的缺點，且無相分離過程，減少了對環(huán)境的污染，具有操作簡便、選擇性好等優(yōu)點[19-20]。本實驗考察了Oasis HLB(500 mg/6 mL)、Oasis MCX(150 mg/6mL)和C18(500 mg/6 mL) 3種不同類型的固相萃取柱對空白樣品加標回收率的影響，結果如圖2所示。由圖可知，Oasis MCX柱雖然對堿性化合物的選擇性高，但由于化妝品中有油脂干擾，凈化后氨基比林的響應較低；而Oasis HLB柱的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，與化合物有多個結合位點，因此與C18柱相比，相對保留容量較高，過柱損失較少，因而保泰松和氨基比林凈化后的回收率均較高且凈化效果較理想，本實驗最終選擇Oasis HLB固相萃取柱進行萃取。

2.4.2 洗脫溶劑體積的選擇 在加標水平為20 μg·L-1時，考察了洗脫劑甲醇體積分別為2、5、8、10 mL時對提取回收率的影響，每個用量水平重復測定3次。結果表明，隨著洗脫溶劑體積的增加，保泰松和氨基比林的回收率明顯提高；但當洗脫溶劑體積大于8 mL時，各目標化合物的回收率趨于穩(wěn)定。因此，最終選擇8 mL甲醇作為洗脫溶劑。

2.5 基質效應的考察

基質效應包括絕對基質效應和相對基質效應。不考慮其它因素，絕對基質效應主要影響方法的準確度，相對基質效應主要影響方法的精密度。因此本文采取常用的提取后添加法[21]評價基質效應，即基質效應(ME)為基質匹配標準曲線的斜率與溶劑配制標準曲線的斜率之比，其比值越接近1，說明基質效應越小，反之亦然。由表3結果可見，保泰松和氨基比林均存在不同程度的基質抑制效應，實驗采用基質加標法定量，可較好地消除基質效應帶來的影響，保證結果的準確性。

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

取空白基質配制質量濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·L-1的混合標準溶液，以峰面積(y)對質量濃度(x,μg·L-1)繪制標準曲線。結果顯示：保泰松和氨基比林在2.0～200.0 μg·L-1范圍內呈良好的線性關系，相關系數(shù)(r2)均大于0.99，分別以3倍信噪比(S/N≥3)及10倍信噪比(S/N≥10)進行計算，得到方法的檢出限(LOD)分別為1.5、0.8 μg·kg-1，定量下限(LOQ)分別為4.9、2.7 μg·kg-1(見表3)。

表3 保泰松和氨基比林的線性方程、相關系數(shù)、檢出限、定量下限及基質效應

2.7 加標回收率、準確度與精密度

在不含待測組分的3種不同種類基質(水劑、乳液、膏霜)的陰性樣品中，分別添加5.0、20.0、100.0 μg·L-1的標準混合溶液，進行加標回收率和精密度試驗。每個濃度平行測定6次，連續(xù)測定3 d，各待測組分的回收率及日內、日間相對標準偏差(RSD)如表4所示。保泰松和氨基比林的平均回收率為77.8%～93.4%，日內RSD為2.4%～7.8%，日間RSD為3.6%～9.5%。方法的準確度與精密度可滿足定量分析的要求。

表4 不同種類基質中保泰松和氨基比林的回收率及相對標準偏差

2.8 實際樣品的檢測

應用本方法對市售的具有抗痘除螨作用的洗面奶、化妝水、乳液、面霜、面膜等不同類型的化妝品樣品共20種進行分析測定，均未檢出保泰松和氨基比林。

3 結 論

本文建立了超聲提取-固相萃取柱凈化/超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定不同種類抗痘化妝品中保泰松和氨基比林的殘留量。該方法定性能力強，可排除雜質對目標化合物的影響，具有重現(xiàn)性好、簡便快速、靈敏度高等優(yōu)點，能滿足不同類型抗痘化妝品中保泰松和氨基比林的定性和定量分析要求。

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Simultaneous Determination of Phenylbutazone and Aminopyrine in Anti-acne Cosmetics by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

XIONG Shuang，LIU Cheng-yan*，WANG Zhi-jia，LI Hong，REN Xue-dong，WANG Lu,TIAN Fu-lin，ZHAO Hai-bo

(The Standard Engineer Research Center of Liaoning Province,Liaoning Academy of Analytical Science，Shenyang 110015,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method with solid phase extraction(SPE) was applied in the simultaneous determination of phenylbutazone and aminopyrine in anti-acne cosmetics.The sample was ultrasonically extracted with acetonitrile,and then purified on an Oasis HLB solid phase extraction column.The separation was performed with an Eclipse XDB-C18(3.5 μm，4.6 mm×150 mm) column,using a mixture of methanol and 10 mmol·L-1ammonium acetate as mobile phase by gradient elution at a flow rate of 0.5 mL·min-1.The analytes were detected with electrospray ionization source in positive ion mode(ESI+) and multiple reaction monitoring(MRM),and quantified by matrix standard curve.The calibration curves of phenylbutazone and aminopyrine were linear in the range of 2.0-200.0 μg·L-1with correlation coefficients(r2) larger than 0.99.The limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of the method were 1.5,0.8 μg·kg-1and 4.9,2.7 μg·kg-1,respectively.The recoveries of phenylbutazone and aminopyrine were in the range of 77.8%-93.4%at three spiked levels,with intra-day and inter-day relative standard deviations(RSD) of 2.4%-7.8% and 3.6%-9.5%,respectively.With fast detection,high sensitivity and low detection limit,the method is able to provide a scientific basis and a technical support for monitoring residues of phenylbutazone and aminopyrine in cosmetics and product quality control.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);cosmetics;phenylbutazone;aminopyrine;solid phase extraction(SPE)

2017-03-03；

2017-03-28

國家重大科學儀器設備開發(fā)專項資助(2012YQ1200440602)；遼寧省科學事業(yè)公益研究基金項目資助(2014002001)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.006

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)08-0980-06

*通訊作者：劉成雁，博士，教授，研究方向：危險化學品的快速分析方法和應急處理，Tel:024-24822348，E-mail:chengyanliuln@163.com