劉順字，郭淑貞，林雙娣，賴秀桃，余其峰

（清遠(yuǎn)市清新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，廣東 清遠(yuǎn) 511800）

酶抑制法在農(nóng)藥殘留快速檢測過程中的應(yīng)用分析

劉順字，郭淑貞，林雙娣，賴秀桃，余其峰

（清遠(yuǎn)市清新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，廣東 清遠(yuǎn) 511800）

闡述了酶抑制農(nóng)殘快速檢測法的原理，從樣品的代表性、膽堿酯酶的活性、儀器的功能性和操作的規(guī)范性4個(gè)方面分析了影響該方法準(zhǔn)確性的因素，針對檢測結(jié)果的假陽性和假陰性問題提出了整株或粗塊提取減少干擾、增敏劑提高檢測靈敏度、加熱破壞干擾物質(zhì)和過濾消除色素影響等解決對策。

酶抑制法；農(nóng)藥殘留快速檢測；應(yīng)用分析

農(nóng)藥是農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)種植過程中不可或缺的重要農(nóng)資產(chǎn)品，因其殘留對人畜和生態(tài)的負(fù)面影響從而引起了人們的日益重視和擔(dān)憂。雖然高效、低毒、低殘留已經(jīng)成為新農(nóng)藥的研發(fā)推廣新趨勢[1]，但由于農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中粗放的噴施技術(shù)、農(nóng)戶過多關(guān)注防治效果和節(jié)約成本以及未嚴(yán)格按規(guī)定的安全間隔期上市，種植生產(chǎn)環(huán)節(jié)濫用和亂用農(nóng)藥的現(xiàn)象時(shí)有出現(xiàn)[2]，目前有機(jī)磷與氨基甲酸酯兩大類農(nóng)藥殘留檢出超標(biāo)率遠(yuǎn)高于其他農(nóng)藥品種，存在較大的殘毒風(fēng)險(xiǎn)[3]。在農(nóng)藥殘留檢測方法中，酶抑制快速檢測法因操作簡單、快速、成本低、靈敏度高、重復(fù)性好、儀器品種眾多、比較實(shí)用而在基層的快篩快檢中占有主要地位[4-5]，成為當(dāng)前快速排查農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的主要手段之一，廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地、農(nóng)貿(mào)（批發(fā)）市場、農(nóng)業(yè)企業(yè)及超市。其檢測結(jié)果是產(chǎn)地準(zhǔn)出和市場準(zhǔn)入或退市的重要指標(biāo)和依據(jù)，也是近年來多地政府的民生工程建設(shè)項(xiàng)目之一[6-7]。

1 酶抑制農(nóng)殘快速檢測法的原理

目前，酶抑制農(nóng)殘快速檢測法廣泛使用的酶為乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。這兩種酶是有機(jī)磷和氨基甲酸酯兩大類農(nóng)藥的作用靶標(biāo)。而這兩大類農(nóng)藥的殺蟲原理是特異性地抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中酶的活性，損壞正常的神經(jīng)信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致害蟲中毒死亡[8-9]。根據(jù)這一原理，將膽堿酯酶與農(nóng)產(chǎn)品中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留成分進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)膽堿酯酶抑制程度判斷試樣中這兩大類農(nóng)藥殘留的含量[10]。

檢測中往試樣中先加入酶和顯色劑，振蕩混勻后靜置10～15 min；加入底物，立即用分光光度計(jì)在412 nm左右處測定顯色劑吸光度隨時(shí)間的變化值，通過比色法計(jì)算出抑制率[11]，從而實(shí)現(xiàn)蔬果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯兩大類農(nóng)藥殘留總量的快速檢測，達(dá)到定性定量判定的目的。

2 酶抑制農(nóng)殘快速檢測法的影響因素

2.1 樣品的代表性

抽取樣品對整體樣品的代表性關(guān)系著對樣品質(zhì)量的正確評估與判斷，為了使抽取的樣品具有代表性、科學(xué)性及真實(shí)性，抽檢技術(shù)人員應(yīng)盡可能地深入了解基地或流通環(huán)節(jié)的樣品情況，尤其是樣品種植過程中農(nóng)藥噴施的情況，從而做到科學(xué)取樣。農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地樣品應(yīng)該在成熟區(qū)或即將上市前進(jìn)行采樣，流通環(huán)節(jié)應(yīng)該在批發(fā)或交易高峰期進(jìn)行采樣，應(yīng)遵循先抽綜合市場樣品后抽批發(fā)市場樣品的原則。

抽取樣品時(shí)盡可能按照蔬菜農(nóng)藥殘留檢測抽樣規(guī)范（NY/T 762—2004）和新鮮水果和蔬菜取樣方法（GB/ T 8855—2008）要求進(jìn)行采樣，采樣技術(shù)員應(yīng)克服各種客觀條件和主觀心理因素的影響，盡量做到隨機(jī)取樣。樣品信息登記要全面有效；存放器具要潔凈，避免造成交叉污染；運(yùn)輸環(huán)節(jié)的溫濕度適宜并可控，同時(shí)對抽取的樣品需要求農(nóng)產(chǎn)品負(fù)責(zé)人簽字確認(rèn)[12]。樣品的取樣部位以食用部分為宜，盡可能覆蓋樣品不同方向和部位，通常以過四分法進(jìn)行樣品的取舍，在抽樣結(jié)果未確定前不能隨意丟棄樣品。

2.2 膽堿酯酶的活性

膽堿酯酶活性的2個(gè)主要方面為高效催化效能和活性位點(diǎn)，這2個(gè)因素直接影響對農(nóng)藥殘留的靈敏度，并關(guān)系到檢測實(shí)際效果和推廣使用程度[13]。酶的活性與農(nóng)藥種類、反應(yīng)溫度、酶的種類、濃度、純度、pH值及反應(yīng)時(shí)間等存在一定的關(guān)系。酶的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，同一酶源不同批次之間的靈敏度也存在較大差異性[14]，不同廠家生產(chǎn)的酶對兩大類農(nóng)藥的靈敏度和檢出限也有差異[15]。研究表明，各因素對酶促反應(yīng)的影響程度由大到小排列依次為酶與底物比＞pH值＞顯色劑量＞反應(yīng)溫度[16]。

目前，主要有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，一是農(nóng)業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測方法（NY/T448—2001）采用了丁酰膽堿酯酶作為檢測試劑，其中農(nóng)藥殘留檢測專用丁酰膽堿酯酶（NY/T 1157—2006）中規(guī)定蔬菜陽性樣品提取液的酶抑制率要≥70%；二是國家推薦標(biāo)準(zhǔn)蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測（GB/T5009.199—2003）則采取了乙酰膽堿酯酶作為檢測試劑，規(guī)定蔬菜陽性樣品提取液的酶抑制率要≥50%[17]。因?yàn)閮蓚€(gè)標(biāo)準(zhǔn)采取的酶不一樣，靈敏度也不一樣，所以判定標(biāo)準(zhǔn)也不一樣，檢測時(shí)需要根據(jù)酶的不同選用合適的方法，并設(shè)定相應(yīng)的參數(shù)。

2.3 儀器的功能性

酶抑制快速檢測法的儀器主要包括光源系統(tǒng)、分光系統(tǒng)、顯示系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)及與儀器配套的試劑盒和用具等[18]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已有20家左右生產(chǎn)商研制出40種以上功能相同或相近的儀器設(shè)備。由于當(dāng)前儀器設(shè)備的精準(zhǔn)性及配套試劑的質(zhì)量還沒有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，加上其檢測結(jié)果的非法定性，大部分用戶忽略了對儀器設(shè)備精確度的要求[19]；另外，因?yàn)樯碳业尿?qū)利與惡性競爭，行業(yè)自律性不足，所以儀器的精準(zhǔn)性、重復(fù)性與穩(wěn)定性等性能得不到保障；加上儀器的售后維護(hù)校正滯后；以上因素最終導(dǎo)致檢測結(jié)果的可信度不高[20]。因此，需要操作者重視儀器養(yǎng)護(hù)，放置一段時(shí)間后開機(jī)需要按要求進(jìn)行預(yù)熱；然后對儀器的通道進(jìn)行校正，按調(diào)零鍵一次或多次將檢測通道的透光率調(diào)為100%，每次需對儀器使用情況進(jìn)行登記。對不同廠家不同批次的的試劑，需要進(jìn)行驗(yàn)證，選取與儀器適應(yīng)性較好的試劑。在條件允許時(shí)，可以進(jìn)行添加和回收實(shí)驗(yàn)。

2.4 操作的規(guī)范性

在檢測操作中，每個(gè)細(xì)節(jié)都會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生影響。按照規(guī)程規(guī)范每一步操作，才能提高檢測結(jié)果的科學(xué)性。這樣要求，一方面可以促進(jìn)檢驗(yàn)人員不斷學(xué)習(xí)和改進(jìn)操作方法，提高檢測能力；另一方面，可以促進(jìn)管理人員不斷修繕檢測過程的評價(jià)辦法，從而提升檢測過程的規(guī)范性[21]。檢測人員需要按照操作流程，遵循實(shí)驗(yàn)室操作的基本原則，如玻璃儀器等器具的清洗潔凈與分類分區(qū)存放、移液槍頭和試劑槽等器具標(biāo)識清晰專物專用、試劑恰當(dāng)保存且只出不進(jìn)、樣品的稱量與前處理的規(guī)范、溫度與時(shí)間的掌控、儀器的校準(zhǔn)與試劑的配置校正等。操作人員在檢測過程中要不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，并養(yǎng)成良好的習(xí)慣，掌握每一個(gè)操作步驟可能存在的影響因素，盡可能地保障檢測的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

3 酶抑制農(nóng)殘快速檢測法的結(jié)果分析

3.1 酶抑制快速檢測法結(jié)果判定的依據(jù)

（1）式中A為吸光度，T為透射比，K為吸光系數(shù)，c為吸光物質(zhì)的濃度，b為吸收層厚度[22]；（2）式中△A0與△At分別為對照溶液和樣品溶液反應(yīng)1～3 min吸光度的變化值。理論上，當(dāng)K與b恒定，標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度會(huì)隨濃度的增加而增高。實(shí)際操作過程中，當(dāng)酶促反應(yīng)的一級反應(yīng)結(jié)束即出現(xiàn)拐點(diǎn)。在拐點(diǎn)后，濃度的增加，吸光度并不成線性，而是曲折上升至平滑。如在拐點(diǎn)后進(jìn)行檢測容易出現(xiàn)假陰性和假陽性，因此，空白對照和樣品檢測應(yīng)在拐點(diǎn)出現(xiàn)之前的時(shí)間內(nèi)完成[23]。

當(dāng)酶完全水解乙酰膽堿酯時(shí)，測定溶液顯黃色，△A0與△At值相同，根據(jù)公式（2）其抑制率為0%；當(dāng)酶完全與農(nóng)藥結(jié)合，測定溶液顯無色透明，△At為0，根據(jù)公式（2）其抑制率為100%，但實(shí)際正常檢測值均在0%～100%之間。

3.2 酶抑制快速檢測法不當(dāng)結(jié)果的分析

3.2.1 假陽性 （1）樣品自身干擾。樣品本身成分對酶促反應(yīng)酶的抑制影響最為常見，蔬菜和水果中的組織液、次生物質(zhì)、葉綠素、花青素等可能會(huì)與底物或顯色劑反應(yīng)，蛋白質(zhì)、氨基酸、電解質(zhì)等物質(zhì)也會(huì)干擾酶促反應(yīng)。已有研究表明，蔥、姜、蒜、木瓜、辣椒、蘿卜、芹菜、香菜、茭白、番茄、菠蘿、蘑菇等物質(zhì)中含有影響酶活性或使顯示產(chǎn)物褪色的物質(zhì)，韭菜中的硫代亞硫酸酯化合物也被證明會(huì)影響有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測試[24]。（2）酶的活性低。酶的活性低也容易造成假陽性。檢測時(shí)空白對照△A0因時(shí)間不同而要求不同，但一般要求△A0大于0.3以上。在檢測過程中需要控制溶液溫度和檢測時(shí)間，溶液溫度盡可能控制在37～41℃，反應(yīng)時(shí)間在10～15 min之間。環(huán)境氣溫較低時(shí)需用水浴鍋等加熱設(shè)備加熱，使試劑達(dá)到適宜溫度，試劑用完后需及時(shí)放回保存。（3）檢測時(shí)間的延長。如果空白對照在一級反應(yīng)時(shí)間內(nèi)測定，樣品測試時(shí)間超過拐點(diǎn)可能導(dǎo)致△At變小并趨向于零，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。同一個(gè)樣品，如果沒有在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)完成檢測，時(shí)間拖延越長，檢出陽性率會(huì)越高。同批次樣品，按順序放在不同的比色皿中，其檢測值會(huì)呈現(xiàn)越來越高的趨勢。一般同一上機(jī)批次樣品以10批以內(nèi)為宜，并應(yīng)嚴(yán)格控制時(shí)間。（4）檢測器具污染。由于取樣工具、玻璃儀器、移液器、比色皿等用具長期反復(fù)使用，容易在其表明累積農(nóng)藥殘留，可污染檢測樣品，從而造成樣品超標(biāo)的現(xiàn)象。因此，檢測后應(yīng)及時(shí)泡洗檢測用具，清潔過程中需要徹底清除檢測器具中的農(nóng)藥殘留，減少檢測過程中的誤差或誤判[25]。3.2.2 假陰性 目前大部分生產(chǎn)廠家采用磷酸緩沖液提取樣品中的農(nóng)藥殘留。由于農(nóng)藥殘留在磷酸緩沖液中的溶解度不高，加上提取時(shí)間短等因素影響，樣品中的有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥并不能完全提取出來，因此檢測值會(huì)比實(shí)際值偏低。有機(jī)磷類農(nóng)藥中有些農(nóng)藥如毒死蜱[26]對膽堿酯酶抑制程度不高，因此實(shí)際中會(huì)出現(xiàn)假陰性。另外，酶抑制法對有機(jī)磷與氨基甲酸酯兩大類農(nóng)藥以外的其他類農(nóng)藥殘留檢測沒有效果，不能作為判定依據(jù)。

3.3 降低假陽性和假陰性的對策

3.3.1 整株或粗塊提取減少干擾 對一些容易產(chǎn)生假陽性的樣品進(jìn)行檢測時(shí)，通常采取不破壞或少破壞其組織來減少樣品中干擾成分的浸出。浸提樣品可以是大塊、大片甚至是整株，同時(shí)也可減少提取時(shí)間來控制干擾物質(zhì)的浸出率，但該方法可能造成樣品中的農(nóng)藥殘留提取不完全，使得農(nóng)藥殘留檢測值偏低。另由于干擾物質(zhì)的影響，可能使得檢測值偏高，所以建議此類物質(zhì)盡可能慎重采用該方法。

3.3.2 增敏劑提高檢測靈敏度 針對酶活躍性不高的農(nóng)藥，可以通過增敏劑來提高靈敏度來實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確測定樣品中的農(nóng)藥殘留含量的目的。十二烷基硫酸鈉等被證實(shí)具有良好的增敏效果，且能促進(jìn)顯色劑的穩(wěn)定性。該方法在現(xiàn)實(shí)中因?yàn)椴僮鲝?fù)雜、增敏比例較難控制而較少采用。

3.3.3 加熱破壞干擾物質(zhì) 植物體內(nèi)一些熱穩(wěn)定差的干擾物質(zhì)（如氯代煙堿類似物質(zhì)），可以通過加熱手段進(jìn)行破壞，而兩大類農(nóng)藥殘留由于沸點(diǎn)高而不會(huì)受到影響。因加熱會(huì)影響酶的活性，使用此方法時(shí)也需綜合考慮其他因素。

3.3.4 過濾消除色素影響 通過比色皿進(jìn)行分光測定，樣品中的色素等物質(zhì)會(huì)影響紫外光的穿透性，檢測過程中一般需要用濾紙過濾后再檢測，也可用小柱過濾，從而提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，此方法較為常用。

4 討 論

目前，推廣的酶抑制農(nóng)殘快速檢測標(biāo)準(zhǔn)及方法雖然還存在較多制約因素，例如只能檢測兩大類農(nóng)藥、需要控制的因素比較多、檢測精準(zhǔn)性不高（假陽性和陰性均有可能出現(xiàn)）、缺乏權(quán)威性等，但只要重視誤差的來源并盡量減少誤差，規(guī)范每一個(gè)操作步驟，就能較短時(shí)間內(nèi)提高檢測的準(zhǔn)確性。現(xiàn)已形成了先用酶抑制農(nóng)殘快速檢測方法初篩，再用色譜等經(jīng)典方法確認(rèn)的一種體系，實(shí)現(xiàn)快速檢測與精準(zhǔn)檢測的相互補(bǔ)充。當(dāng)然，酶抑制農(nóng)殘快速檢測還有一些關(guān)鍵問題需要突破，檢測的靈敏度、重復(fù)性、回收率也有待提高，現(xiàn)階段很難滿足農(nóng)產(chǎn)品種植、生產(chǎn)、加工、流通、餐飲各個(gè)環(huán)節(jié)農(nóng)藥殘留檢測的需求。因此，加快酶抑制農(nóng)殘快速檢測方法的研究、標(biāo)準(zhǔn)的制定、檢測設(shè)備的開發(fā)和認(rèn)證刻不容緩。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Application Analysis of Enzyme Inhibition Method in the Rapid Detection of Pesticide Residues

LIU Shun-zi，GUO Shu-zhen，LIN Shuang-di，LAI Xiu-tao，YU Qi-feng
（Agricultural Product Quality Safety Supervision and Testing Center of Qingxin District, Qingyuan 511800, PRC）

This paper expounded the principle of enzyme inhibition method in the rapid detection of pesticide residues. It analyzed the four factors affecting the accuracy from the representative of the sample, the activity of cholinesterase, instrument's functionality and operation of normative. In order to reduce the false positives and false negatives of test results, the whole or coarse extraction to reduce interference, sensitization agent to improve the detection sensitivity, heat damage interference filter material and elimination of the in fl uence of pigment are proposed.

enzyme inhibition method; rapid detection of pesticide residue; application analysis

S481+.8

：A

：1006-060X（2017）07-0085-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.007.024

2017-04-26

劉順字（1981-），男，湖南婁底市人，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測工作。