許蘭仙++馬文平

目的：研究枸杞多糖的提取方法對(duì)枸杞多糖抗氧化活性的影響，分析不同提取方法獲得的枸杞多糖試樣表現(xiàn)出抗氧化活性。方法：使用超聲波-微波輔助提取方法提取，獲得5種試樣使用膜分離設(shè)備進(jìn)行超濾獲得2種試樣；采用FRAP法、ABTS法和清除超氧陰離子自由基（SRSA）、螯合Fe2+能力測(cè)定（MC）、4種體外抗氧化方法來(lái)評(píng)價(jià)試樣的抗氧化能力。結(jié)論：活性炭脫色導(dǎo)致多糖大量損失（P<0.05），除蛋白對(duì)試樣多糖含量影響不大（p>0.05）；不同的抗氧化方法會(huì)得到不同的抗氧化結(jié)果，對(duì)多糖和抗氧化能力相關(guān)性進(jìn)行分析表明，多糖和體外抗氧化能力之間相關(guān)性不強(qiáng)；綜合比較各個(gè)試樣的抗氧化能力，表明，使用使用超聲波-微波輔助提取，并進(jìn)行醇沉可獲得枸杞粗多糖a具有相對(duì)好的體外抗氧化活性。

枸杞，棘如枸之刺，莖似杞之條，故名枸杞。是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材和重要的經(jīng)濟(jì)作物，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品?，F(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)它有抗氧化、延緩衰老、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡防止老年癡呆癥、保護(hù)心腦血管等作用，而這些功能的核心是枸杞的抗氧化功能，因?yàn)椋趸瘧?yīng)激和抗氧化的平衡調(diào)節(jié)是人體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和正常生理功能的一個(gè)基本的調(diào)節(jié)體系，人體自我保護(hù)、抵御疾病的重要機(jī)制之一。枸杞多糖被公認(rèn)為枸杞主要活性成分，因此，近二三十年來(lái)，枸杞多糖都是研究枸杞的要點(diǎn)和熱點(diǎn)。王建華的研究表明，相同濃度下不同枸杞多糖清除羥基自由基和清除超氧陰離子自由基的能力均為枸杞總糖最好，而枸杞多糖級(jí)分則不如前者。楊薛康研究了枸杞醇提物和水提物的抗氧化作用，結(jié)果表明枸杞醇提物清除自由基的能力要強(qiáng)于水提物。張自萍研究了枸杞子提取液抗氧化活性，結(jié)果表明枸杞子中水溶性提取物的抗氧化活性高于脂溶性提取物。這些研究都涉及到了枸杞以及枸杞多糖的抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲波-微波輔助提取法獲得枸杞水提物（試樣Ⅰ）、醇提物（試樣Ⅱ）枸杞粗多糖a（試樣Ⅲ，水提醇沉）、脫色粗多糖（試樣Ⅲa）、枸杞總多糖（試樣Ⅲa，脫色、脫蛋白）枸杞粗多糖b（試樣Ⅳ，80%乙醇處理，水提）、；使用膜分離設(shè)備進(jìn)行超濾獲得截留樣、透過(guò)液；將這些試樣進(jìn)行真空冷凍干燥保存。測(cè)定這些試樣的多糖含量，并使用鐵離子還原能力（FRAP）、清除超氧陰離子自由基能力（SRSA）、清除ABTS自由基能力、螯合金屬鐵離子能力（MC）、β-胡蘿卜素漂白法（BCB）測(cè)定各個(gè)試樣的抗氧化能力。目的在與探究不同制備方法獲得的不同含量的枸杞多糖試樣之間，體外抗氧化能力的差別。為獲得高得率、抗氧化活性強(qiáng)的枸杞多糖試樣作初步研究，為枸杞多糖的加工提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

供試材料。試驗(yàn)原料：枸杞鮮果，2015、2016年7月上旬采摘于寧夏蘆花臺(tái)園林場(chǎng)，經(jīng)挑選、除雜、清洗后儲(chǔ)存于-60℃超低溫冰箱。

主要試劑。ABTS、TPTZ、NBT、NADH、PMS、Troloxβ胡蘿卜素、EDTA-2鈉等。

主要儀器設(shè)備。超聲波微波中藥提取儀、高速冷凍離心機(jī)、全波段掃描酶標(biāo)儀、紫外可見分光光度計(jì)等

實(shí)驗(yàn)方法。（1）試樣的制備

計(jì)算各個(gè)試樣得率及其多糖含量的測(cè)定

①鐵離子還原抗氧化能力（FRAP法）

FRAP法參考Benzie 和Strain方法，略加改動(dòng)。

②清除超氧陰離子自由基（SRSA法）

參照Robak的方法，略加改動(dòng)。

③ABTS+·清除能力（ABTS法）

參照Siddhuraju的方法，略加改動(dòng)

④螯合Fe2+能力測(cè)定（MC法）

參照Decker的方法，略加改動(dòng)

上述的五種方法中除了螯合Fe2+能力測(cè)定以EDTA-二鈉為對(duì)照之外，其他方法均以Trolox為對(duì)照。

（2）數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)由 WPS2016表格進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，經(jīng) SPSS（20.0）進(jìn)行方差分析，用Sigma Plot（12.5）作圖。

結(jié)果與分析

各試樣的重量得率和枸杞多糖含量的測(cè)定。（1）試樣的重量得率計(jì)算按照（1）進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如圖1所示

圖1表示的是不同試樣的得率，各個(gè)試樣的得率依次為15.56±0.29%、10.85 ±0.03% 、7.23 ±0.23% 、1.98±0.06%、1.07±0.04%、2.55 ±0.46% ；試樣得率大小順序?yàn)椋核嵛铮ㄔ嚇英瘢?gt;80%乙醇提取物（試樣Ⅱ）>粗多糖a（水提醇沉，試樣Ⅲ）>粗多糖b（醇提水溶，試樣Ⅳ）>脫色粗多糖（試樣Ⅲa）>總多糖（脫蛋白、脫色后多糖，試樣Ⅲb）；各個(gè)試樣的得率差異顯著（P<0.05）。

（2）苯酚硫酸法測(cè)定試樣中的枸杞多糖含量

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.0079X+0.068 R2=0.9981

圖2表示的是不同試樣的枸杞多糖含量，各個(gè)試樣多糖含量分別為：3.39±0.19，1.56±0.04、50.24 ±1.09 、11.46±0.22、12.11±0.18、19.70±0.31、9.76±0.27、20.31±0.28（g/100g）；試樣枸杞多糖含量大小順序?yàn)椋捍侄嗵莂（水提醇沉，試樣Ⅲ）>截留液干燥品（超濾法，試樣Ⅵ）>粗多糖b（醇提水溶，試樣Ⅳ）>總多糖（脫蛋白、脫色后多糖，試樣Ⅲb）>脫色粗多糖（試樣Ⅲa）>透過(guò)液干燥品（超濾法，試樣Ⅴ）>枸杞水提物（試樣Ⅰ）>80%乙醇提取物（試樣Ⅱ），用超聲波-微波輔助法提取的各個(gè)試樣多糖含量差異顯著（P<0.05）

①不同提取方法對(duì)枸杞多糖得率及含量的影響

本實(shí)驗(yàn)采用的提取方法從廣義上來(lái)說(shuō)可以分為化學(xué)方法（溶劑提取法）和物理方法（膜分離）兩類；從狹義上來(lái)講，本實(shí)驗(yàn)采用的化學(xué)方法又可分為水提法、醇提法、水提醇沉、醇提水溶這四種方法。這里討論狹義上的分類方法，即5種方法。

對(duì)于水提法（試樣Ⅰ）， 枸杞中含有大量的水溶性成分，因此試樣Ⅰ得率很高，枸杞水溶性成分除多糖了外還有水溶性黃酮、單糖、寡糖等，所以枸杞多糖含量相對(duì)低；對(duì)于醇提法（試樣Ⅱ），80%的乙醇能夠溶解出大量黃酮類物質(zhì)，以及部分色素，還有極性較低的小部分多糖；對(duì)于水提醇沉法（試樣Ⅲ），醇沉使得水提液中的單糖、寡糖、部分色素等與多糖分離，此時(shí)，枸杞多糖含量得到極大提高，同時(shí)，粗多糖a（試樣Ⅲ）的得率也會(huì)相應(yīng)降低；對(duì)于醇提水溶法（試樣Ⅳ），提取手段和水提醇沉類似，醇沉能夠?qū)⒍嗵菑乃嵋褐蟹蛛x出來(lái)，但是試樣Ⅲ的多糖含量明顯高于試樣Ⅳ（P<0.05），這是因?yàn)闇囟容^低（4℃）、時(shí)間較長(zhǎng)（12 h）醇沉過(guò)程相比于（50℃）、時(shí)間較短（不足1.5h）醇提過(guò)程更有利于多糖的析出；對(duì)于超濾法（試樣Ⅴ和試樣Ⅵ），本實(shí)驗(yàn)使用的超濾膜，其截留分子量大于10000 Da，枸杞多糖的分子量大于2000 Da，因此截留液中主要含有大分子的枸杞多糖，而透過(guò)液中含量分子量較小的枸杞多糖，以及單糖、寡糖、黃酮等物質(zhì)。

②脫色、脫蛋白對(duì)試樣多糖含量的影響

活性炭處理水提液除色素的同時(shí)，也會(huì)吸附多糖，活性炭脫色損失了大量的多糖；當(dāng)將脫色水提液進(jìn)行醇沉，試樣Ⅲa中的多糖含量得到提高，但是明顯低于試樣Ⅲ（P<0.05），這是因?yàn)槊撋嶂械亩嗵牵≒>0.05）含量明顯減少，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于試樣Ⅰ中的多糖含量（P<0.05），使用活性炭對(duì)脫色使得枸杞多糖大大流失；對(duì)于試樣Ⅲb，是在試樣Ⅲa基礎(chǔ)上，采用Sevage脫蛋白，多糖含量略微升高，說(shuō)明游離蛋白含量較少。而在使用超濾法制備試樣過(guò)程中，也使用活性炭脫色，但是試樣Ⅵ的多糖含量大于試樣Ⅲb；試樣Ⅲb的制備使用水提取，而后通過(guò)醇沉分離出粗多糖，試樣Ⅵ使用的是枸杞清汁，除了水溶性成分，還有一些脂溶性成分，通過(guò)酶解、脫色、澄清之后，采用超濾分離出枸杞多糖；兩者多糖含量的差異，再次證明了提取方法對(duì)多糖含量的影響。

各個(gè)試樣的抗氧化能力分析。

①各個(gè)試樣鐵離子還原能力（FRAP法）

FRAP法能夠測(cè)定試樣中所存在的任何還原性成分的還原能力。FRAP0.2表示當(dāng)FRAP值為0.2時(shí)，所需的抗氧化物質(zhì)的多少。試樣的FRAP0.2越小鐵離子還原能力越強(qiáng)。

除了試樣Ⅲa、試樣Ⅲb，其他試樣的鐵離子還原能力隨著多糖含量的增加而增強(qiáng)，其中試樣Ⅲ表現(xiàn)出最好的鐵離子還原能力，但是試樣Ⅲa、試樣Ⅲb多糖含量并不是最低，說(shuō)明鐵離子還原能力與多糖含量有一定關(guān)系，結(jié)合相關(guān)性分析可知試樣多糖含量與鐵離子還原能力中度相關(guān)。試樣Ⅲa、試樣Ⅲb之所以沒(méi)有表現(xiàn)出鐵離子還原能力，可能是是脫色過(guò)程除掉的色素以及其他成分也會(huì)影響試樣的鐵離子還原能力。

截試樣Ⅵ是用膜分離設(shè)備進(jìn)行超濾分離取截留液獲得的，超濾之前，對(duì)枸杞清汁進(jìn)行活性炭脫色、并通過(guò)澄清除掉部分蛋白質(zhì)；試樣Ⅲb是枸杞水提液經(jīng)過(guò)活性炭脫色、乙醇沉淀、Sevage法除蛋白獲得的，沒(méi)有表現(xiàn)出鐵離子還原能力，試樣Ⅵ同樣經(jīng)歷了脫色、除蛋白、分離出多糖的過(guò)程，原因可能是提取方法不同，試樣Ⅲb使用的是化學(xué)方法（制備過(guò)程涉及多種化學(xué)試劑），而截留液干燥品（試樣Ⅵ，膜分離）使用的是物理方法（膜分離屬于物理過(guò)程，且制備過(guò)程較少涉及化學(xué)試劑）

試樣Ⅰ、試樣Ⅱ多糖含量較低，鐵離子還原能力較低，后者比前者鐵離子還原能力明顯高（P<0.05），這說(shuō)明在還原鐵離子能力這抗氧化角度，80%的乙醇提取物抗氧化活性強(qiáng)于水提物，李洋用10種不同極性溶劑提取枸杞中的活性成分，結(jié)果表明高濃度乙醇（約80.9%）提取物的抗氧化能力比水提物鐵離子還原能力強(qiáng)。

②清除超氧陰離子自由基（SRSA）

超氧陰離子自由基是人體內(nèi)活性自由基，當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多超氧陰離子自由基，超過(guò)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)其消除能力時(shí)，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。當(dāng)存在有效清除超氧陰離子自由基的清除劑時(shí)，可以使機(jī)體內(nèi)的氧化和抗氧化重新恢復(fù)平衡。IC50表示抗氧化實(shí)現(xiàn)50%抑制時(shí)的濃度。在這里定義為IC50表示表示當(dāng)自由基的清除率為50%時(shí)，抗氧化物質(zhì)的濃度，試樣的IC50越小清除超氧陰離子自由基能力越強(qiáng)。

從整體來(lái)看，除了多糖含量較少的試樣Ⅰ、試樣Ⅱ，使用化學(xué)方法即超聲波-微波輔助法制備的試樣比膜分離設(shè)備制備出來(lái)的試樣清除超氧陰離子自由基能力都強(qiáng)；醇沉保留了某些清除超氧陰離子自由基的成分，這可能是由于試樣Ⅴ、和試樣Ⅵ膜分離制備過(guò)程中，經(jīng)歷了沸水浴滅酶和80℃的澄清，溫度較高導(dǎo)致多糖活性遭受破壞；試樣Ⅲa和試樣Ⅵ從純化、除雜角度上來(lái)講有相似之處，但是兩者清除超氧陰離子自由基能力差異顯著（P<0.05）。

試樣Ⅲb、Ⅲa、Ⅲ、Ⅰ它們清除超氧陰離子自由基的順序?yàn)棰骲>Ⅲa>Ⅲ>Ⅰ，去除蛋白質(zhì)、脫色、醇沉都可能有助于提高超氧陰離子清除能力，Lin等用沸水提取，乙醇沉淀，蛋白酶水解除蛋白獲得多糖（CE）粗提物多糖（CP），去蛋白多糖（DP）；并研究其抗氧化性活性，同一濃度下清除超氧陰離子自由基能力大小為DP>CP>CE。和本實(shí)驗(yàn)大小順序一致。

綜上所述，清除超氧陰離子自由基能力與試樣的制備方法、溫度有關(guān)系，多糖含量過(guò)高、過(guò)低都會(huì)影響清除超氧陰離子自由基能力。

③清除ABTS自由基

ABTS 法是使用最廣泛的間接檢測(cè)方法之一，可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測(cè)定。

試樣Ⅱ中的多糖含量是所有試樣中多糖含量最少的，80%醇提物里的成分主要是黃酮類化合物，而試樣Ⅴ，經(jīng)過(guò)超濾收集的透過(guò)液，里面主要含有相對(duì)小分子量的多糖、寡糖及單糖以及黃酮類化合物。而兩者清除ABTS自由基能力相對(duì)其他樣品較強(qiáng)（P<0.05），說(shuō)明黃酮類化合物在清除ABTS自由基能力中產(chǎn)生較大的作用，而試樣Ⅰ中也有一部分水溶性黃酮，但是清除ABTS自由基能力卻明顯弱（P<0.05），說(shuō)明脂溶性黃酮比水溶性黃酮清除ABTS自由基能力更強(qiáng)。

試樣Ⅲ和試樣Ⅳ均為枸杞粗多糖，除了試樣Ⅱ和試樣Ⅴ，它們的抗氧化活性相對(duì)較高（P<0.05），而試樣Ⅲa、試樣Ⅲb經(jīng)過(guò)除掉色素和除色素、除蛋白獲得的試樣，說(shuō)明了除色素過(guò)程除掉了某些清除ABTS自由基的成分。

④螯合Fe2+能力的測(cè)定（MC法 ）

Fe2+、Cu2+可介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，F(xiàn)e2+還是羥自由基等自由基產(chǎn)生的媒介物，因此限制金屬離子的活動(dòng)，即螯合金屬鐵離子能力能夠間接阻止氧化反應(yīng)，螯合金屬離子能力反應(yīng)了抗氧化劑在抑制、阻礙促氧化能力。

從表4中可以看出來(lái)，各個(gè)試樣和濃度存在線性關(guān)系（R2>0.9）；但是它們的螯合能力較弱，高濃度下，螯合率仍不足50%。

試樣Ⅲa、試樣Ⅲb、試樣Ⅳ的螯合Fe2+能力差異不顯著（P<0.05），它們的制備過(guò)程都包括活性炭脫色，試樣Ⅳ，在水提之前，先用80%的乙醇處理，也除掉一部分色素，說(shuō)明色素的去除有利于螯合Fe2+。

多糖含量和抗氧化能力的相關(guān)性分析。

如表5所示，在FRAP法中，多糖含量與鐵離子還原能力相關(guān)性系數(shù)0.5≦∣r∣≦0.8，說(shuō)明試樣多糖含量與其鐵離子還原能力中度相關(guān)；在SRSA法，0.3≦∣r∣<0.5， 說(shuō)明試樣多糖含量與其清除超氧陰離子能力低度相關(guān)；在ABTS法、MC法、BCB法中，∣r∣<0.3，說(shuō)明試樣多糖含量螯合金屬能力、抑制β-胡蘿卜素褪色能力均沒(méi)有關(guān)系。

各個(gè)試樣的抗氧化能力大小在各個(gè)抗氧化方法中的排列順序。

從表6中可以看出，綜合各個(gè)反應(yīng)的結(jié)果可以看出，試樣Ⅲ即粗多糖a和試樣Ⅲb總多糖的抗氧化效果相對(duì)好。

結(jié)論

（1）用超聲波-微波輔助提取法制備的6種試樣及用超濾法制備獲得兩種試樣的得率和多糖含量有差別。不同提取方法對(duì)枸杞多糖含量和得率均產(chǎn)生影響，其中粗多糖a（試樣Ⅲ，水提醇沉）得率相對(duì)高，且其多糖含量最高；活性炭脫色導(dǎo)致多糖大量損失（P<0.05），除蛋白對(duì)試樣多糖含量影響不大。

（2）用四種體外抗氧化方法對(duì)試樣抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示不同體外抗氧化方法測(cè)定出來(lái)的各個(gè)試樣體外抗氧化能力強(qiáng)弱順序不同。綜合結(jié)果表明，枸粗多糖a（試樣Ⅲ，水提醇沉），總多糖（試樣Ⅲb，脫色，脫蛋白）表現(xiàn)出相對(duì)好的抗氧化能力效果，結(jié)合兩個(gè)試樣的得率，在加工利用枸杞多糖時(shí)，應(yīng)使用超聲波—微波輔助提取，并進(jìn)行醇沉，可獲得得率相對(duì)高、抗氧化活性較好的試樣。

（3）試樣中枸杞多糖和體外抗氧化能力相關(guān)性分析結(jié)果表明，枸杞多糖和體外抗氧化活性有一定的關(guān)系，但是并沒(méi)有高度相關(guān)；經(jīng)過(guò)各個(gè)試樣的抗氧化能力大小在各個(gè)抗氧化方法中的排列順序可知，枸粗多糖a（試樣Ⅲ，水提醇沉），總多糖（試樣Ⅲb，脫色，脫蛋白）表現(xiàn)出相對(duì)好的抗氧化能力效果。