趙 雪潘婷婷米武娟畢永紅胡征宇

(1.中國科學院水生生物研究所中國科學院藻類生物學重點實驗室, 武漢 430072; 2.中國科學院大學, 北京 100049)

葛仙米生長的尺度效應

趙 雪1,2潘婷婷1,2米武娟1畢永紅1胡征宇1

(1.中國科學院水生生物研究所中國科學院藻類生物學重點實驗室, 武漢 430072; 2.中國科學院大學, 北京 100049)

為考察葛仙米(Nostoc sphaeroides)群體粒徑變化對營養(yǎng)成分和光合活性的影響, 測定了生長過程中不同粒徑群體的色素成分、光合特性和多糖含量。結果表明: 葉綠素a、藻膽蛋白含量隨群體粒徑增大而降低; 類胡蘿卜素含量在粒徑4.85 mm時最高, 藻藍蛋白/葉綠素a、藻紅蛋白/葉綠素a以及別藻藍蛋白/葉綠素a的比值隨粒徑增大先降低后升高; 最大潛在光合能力(Fv/Fm)隨群體粒徑增大逐漸降低, 大群體可通過光系統I介導的環(huán)式電子傳遞鏈耗散多余能量以保護光合作用系統; 多糖含量在粒徑3.03 mm時最高。研究結果顯示葛仙米生長具有明顯的尺度效應, 細胞組分與光合活性對群體粒徑變化具有顯著的響應, 開展規(guī)?；囵B(yǎng)和采收需要關注這一效應。

葛仙米; 群體粒徑; 葉綠素熒光活性; 代謝產物

葛仙米(Nostoc sphaeroides)又名擬球狀念珠藻, 是一種多細胞球形群體, 具有固氮作用, 與地木耳(Nostoc commune)、發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)同屬藍藻門(Cyanophyta)、藍藻綱(Cyanophyceae)、段殖藻目(Hormogonales), 念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻屬(Nostoc)。葛仙米主要分布在湖北鶴峰走馬鎮(zhèn)的稻田中, 呈墨綠色, 當地人又稱其為天仙米[1,2]; 其干物質總蛋白含量為28.38%—52%, 含18種氨基酸, 包括人體必需的8種氨基酸; 富含VC、VE和B族維生素, 總糖為24.19%[3,4], 是一種營養(yǎng)價值高的保健食品。在我國, 葛仙米具有悠久的食用與藥用歷史; 葛仙米作為席間美食, 其色翠碧可愛, 其味清新甘鮮, 不僅營養(yǎng)極為豐富, 而且還具有較高的食療價值, 葛仙米性味甘、淡、寒, 有清熱明目作用, 能治目赤紅腫、夜盲癥、燙傷。據《藥性考》: “(葛仙米)清神解熱, 痰火能療, 且久服延年?！薄度珖胁菟巺R編》記載: 葛仙米性寒。味淡, 可以清熱、收斂、益氣、明目和能治療夜盲癥、脫肛以及外用可治療燒傷、燙傷等疾病。

尺寸大小是影響生長速率和生命過程的重要參數之一, 藻類群體大小和代謝速率間的關系已受到廣泛關注[5—7]; 個體小的藻類具有較薄的擴散臨界層、較少的擁擠效應(Package Effect)以及較高的表面積體積比[8], 研究表明小粒徑個體較高的代謝速率主要得益于較小的自遮光效應以及同外界的快速物質交換能力; 大粒徑個體擴散臨界層厚, 離表面不同厚度的細胞光合特性不同, 最大光合作用速率和光合效率都隨群體生物量和厚度的增加而降低[9,10]。葛仙米屬于多細胞群體結構, 多細胞絲狀體包裹在一層共同的膠質鞘內, 生長至一定粒徑時, 群體內部出現明顯的分層現象[11], 形成層狀結構, 共同構成一個肉眼可見的堅固群體, 野生群體粒徑可達2 cm。小群體有較高的最大光合作用速率, 較快的生長速率和失水率; 大粒徑群體的最大光合作用速率以及對無機碳的親和力較低[12]。目前, 得到公認的是葛仙米因粒徑差異導致光合作用活性的差異, 最終影響葛仙米群體活性物質含量的差異。但光合色素含量與比例如何適應粒徑增長過程、不同粒徑如何影響光合作用和活性物質積累、規(guī)?；囵B(yǎng)的適宜采收時機等問題目前缺乏必要的數據。為此, 本文考察了培養(yǎng)過程中葛仙米粒徑變化過程, 比較了不同粒徑的光合色素含量與比例、確認粒徑大小影響色素含量與比例且色素變化直接影響光合特性和活性物質積累, 證實了葛仙米生長過程中存在尺度效應。同時, 本文的研究結果可為葛仙米規(guī)?；囵B(yǎng)的適宜采收節(jié)點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藻體培養(yǎng)

選取外表光滑均勻, 色澤飽滿的葛仙米, 用滅菌BG-110培養(yǎng)液反復沖洗, 在無菌工作臺利用勻漿器研磨制種, 分別接種在培養(yǎng)皿中, 置日光燈下培養(yǎng), 光強設定為40 μmol photons/(m2·s), 7d后接種至10 L的BG-110液體培養(yǎng)基中, 通氣培養(yǎng), 光強設為60 μmol photons/(m2·s), 每隔14天更換1次培養(yǎng)基。

1.2 群體粒徑增幅

每天選取30個群體用游標卡尺測定群體粒徑大小并計算粒徑大小平均值(L)作為當天的群體粒徑, 第t天的粒徑(Lt)相對于第1天的粒徑(L1)增幅(γ1)采用公式γ1=(Lt–L1)/L1×100%進行計算; 則每天的粒徑增幅(γ2)采用公式γ2=α/t進行計算。

在葛仙米培養(yǎng)過程中, 分別選取不同粒徑的群體進行了相關指標的測定, 這些群體包括粒徑小于1 mm的G1群體, 粒徑在1—2 mm的G2群體, 粒徑在2—4 mm的G3群體, 粒徑在4—6 mm的G4群體, 粒徑在6—8 mm的G5群體。

1.3 葉綠素a、類胡蘿卜素和藻膽蛋白的含量測定

稱取100 mg干重的葛仙米, 加入20 mL 100%甲醇, 避光60℃水浴30min, 4024.8×g下離心10min, 取上清液, 反復抽提2—3次后, 在紫外可見分光光度計下測定665 nm處的吸光度, 葉綠素a (Chl.a)的含量按照公式C (Chl.a)(mg/mL)=A665/A74進行計算;

類胡蘿卜素含量的測定按照Schere等[13]的方法, 按照上述方法提取葉綠素a的方法提取得上清后, 加入14 mL石油醚和2 mL乙醚萃取, 在4℃下避光冷藏過夜后, 分離醚層, 測定453 nm處光度值, 并按照公式: C (Car)(mg/mL)=A453/250, 計算類胡蘿卜素含量。

稱取100 mg干重的葛仙米, 將樣品置于–20℃冰箱中冷凍過夜, 次日用超聲波融化破碎15min, 反復凍融并研磨至藻體變綠, 凍出液不再有顏色。用5 mL pH 7.2的磷酸緩沖液提取, 11180×g下離心2min, 取上清液用紫外分光光度計分別測定562、615和652 nm處吸光度, 根據公式計算藻膽蛋白含量[14]。

1.4 葉綠素熒光和P700測定

采用Dual-PAM-100葉綠素熒光儀(Walz, Germany)進行活體葉綠素熒光的測定。獲得參數最大潛在光化學效率(Fv/Fm)[由公式Fv/Fm=(Fm–F0)/ Fm計算]、光合作用引起的熒光淬滅(qL)、PS II非調節(jié)性能量耗散的量子產量[Y(NO)]。

P700活體測定采用Dual-PAM-100葉綠素熒光儀進行, 在暗適應15min后使用遠紅光照射10s, 然后用飽和脈沖[10000 μmol photons/(m2·s)]測定Pm。獲得以下數據: 光系統Ⅰ的電子傳遞速率[ETR(Ⅰ)]、光系統I非調節(jié)性能量耗散的量子產量[Y(NA)]、光系統Ⅰ調節(jié)性能量耗散的量子產量[Y(ND)]。

1.5 多糖含量測定

按照文獻[15]優(yōu)化的提取方法提取葛仙米多糖, 稱取2 g干重葛仙米, 用堿酶復合進行預處理: 0.4 mol/L NaOH處理2h后中和至中性, 以1 mg/ 100 mg的比例加入木瓜蛋白酶液。采用料液比1鯰90, 溫度90℃, 提取2h, 反復提取兩次的方式提取粗多糖, 得到葛仙米浸提液進行進一步的純化。

稱取0.25 g木瓜蛋白酶加少量水溶解后加入浸提液中, 攪拌均勻后40℃下水浴8h, 再將sevag試劑(三氯甲烷與正丁醇4鯰1)與酶解后的浸提液1鯰1混合置于分液漏斗中, 反復震蕩搖勻后靜置12h分層, 放出下層sevag試劑和泡沫層, 除去泡沫層后再次加入sevag試劑重復此操作3次。在旋轉蒸發(fā)儀中將處理后的液體蒸發(fā)至原體積的1/4后, 用95%的乙醇進行醇沉, 使乙醇的終濃度達到60%, 4℃中靜置過夜, 然后離心回收沉淀, 采用真空冷凍干燥機收集沉淀多糖。

采用苯酚硫酸法測定多糖含量, 本實驗中葡萄糖的標準曲線為: y=0.0077x–0.0083 (R2=0.999)

1.6 數據分析

本文數據整理使用SPSS 22軟件進行, 采用oneway ANOVA和LSD多重比較方法對不同組間的統計意義進行檢驗。

2 結果

2.1 群體粒徑的變化

接種粒徑小于1 mm、Chl.a含量0.05 mg/L的藻種后, 群體粒徑隨時間延長不斷增大, 但粒徑平均增長速率則隨培養(yǎng)時間延長而逐漸降低(表 1):培養(yǎng)25d后每天的平均粒徑增長速率顯著低于15d、10d和5d時的平均增長速率, 群體粒徑變化呈現兩個顯著不同的階段。

按照不同粒徑將葛仙米群體分為5組, 不同組別的含水量和表面積體積比如表 2所示, 隨粒徑增大, 含水量升高, 表面積體積比顯著下降。

2.2 色素含量與比例

色素含量由圖 1可見, 隨葛仙米群體粒徑增加, 葉綠素a含量呈降低趨勢, 粒徑小于2 mm的群體中葉綠素a含量最高, 隨群體粒徑增大, 葉綠素a含量顯著下降。

圖 2顯示隨群體粒徑增加, 類胡蘿卜素含量呈現先升高后降低的趨勢; G1、G2組別間的類胡蘿卜素含量差異性不顯著(P>0.05), 當粒徑大于2 mm后(G3、G4組別)類胡蘿卜素含量顯著上升, 峰值出現在G4, 即粒徑在4—6 mm的葛仙米群體類胡蘿卜素含量最高; 當粒徑大于6 mm(G5)類胡蘿卜素含量相較于G4顯著下降(P<0.05)。

粒徑小于1 mm的群體(G1)的藻藍蛋白(PC)、別藻藍蛋白(APC)和藻紅蛋白(PE)的含量最高, 隨粒徑增大, 各類藻膽蛋白含量均呈下降趨勢, 不同組別間差異性顯著如圖所示, 3種藻膽蛋白均表現為G1、G2、G3之間差異顯著(P<0.05), 但G3、G4和G5之間差異不顯著(P>0.05)。此外, 不同群體粒徑下的藻膽蛋白的比例不同, 當群體粒徑小于1 mm時(即G1)PC>PE, 當粒徑大于1 mm后, PE的含量所占比例有所上升, 表現為PE>PC (圖 3)。

表 1 葛仙米群體的粒徑增幅Tab.1 The colony diameters of Nostoc sphaeroides during its growth

表 2 不同粒徑群體的含水量、表面積體積比Tab.2 Water content and ratio of surface area/volume in Nostoc sphaeroides with different diameters

圖 1 不同粒徑群體的葉綠素素a含量差異Fig.1 The content of chlorophyll a in Nostoc sphaeroides with different diameters

圖 2 不同粒徑群體的類胡蘿卜素含量差異Fig.2 The content of carotenoid in Nostoc sphaeroides with different diameters

圖 3 不同粒徑群體藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白含量的差異Fig.3 The content of phycocyanin, allophycocyanin and phycoerythrin in Nostoc sphaeroides with different diameters

色素比值各類光合色素比例隨葛仙米群體粒徑增大有一定變化, 藻藍蛋白/葉綠素a, 藻紅蛋白/葉綠素a以及別藻藍蛋白/葉綠素a均隨粒徑增大而先降低后升高, 類胡蘿卜素/葉綠素a比例隨粒徑的增大而升高(圖 4)。

2.3 光合特性

光系統Ⅱ活性隨群體粒徑增大, 最大潛在光化學效率(Fv/Fm)呈階梯式降低, 不同處理組間差異如圖所示, 可見粒徑小于3 mm的群體(即G1、G2)Fv/Fm值最高, 粒徑超過3 mm后Fv/Fm顯著下降(G3、G4)(P<0.05), 當粒徑超過6 mm后出現進一步的顯著下降, 在粒徑大于8 mm的群體中, Fv/Fm值僅為0.3左右。光合作用引起的熒光淬滅(qL)亦隨群體粒徑的增大而降低, G2、G3和G4之間差異不顯著(P>0.05), 粒徑大于6 mm后qL顯著降低(P<0.05);非調節(jié)性能量耗散的量子產量[Y(NO)]在葛仙米群體粒徑大于1 mm后就出現顯著增加, 群體粒徑高于6 mm后進一步顯著增大(P<0.05)(圖 5)。

光系統Ⅰ活性光系統I電子傳遞速率[ETR (Ⅰ)]先隨群體粒徑增大而顯著升高(P<0.05), G3、G4之間的差異不顯著(P>0.05), ETR(Ⅰ)在直徑大于6 mm(G5)時達到峰值; PSI非光化學量子產量大小的Y(NA)隨群體粒徑增大而降低, 同樣G3、G4之間的差異不顯著(P>0.05); Y(CEF)代表環(huán)式電子傳遞鏈的大小, 隨粒徑增大先呈階段性升高的趨勢:相較于G1、G2、G3和G4的Y(CEF)顯著升高(P< 0.05), 但G2、3、4之間差異不顯著(P>0.05), 當群體粒徑大于6 mm(G5), Y(CEF)進一步升高(圖 6)。

圖 4 群體粒徑對不同粒徑的色素比值的影響Fig.4 The content and portion of photosynthetic pigments in Nostoc sphaeroides with different diameters

快速光響應曲線粒徑小的群體在高光強下保持較高的電子傳遞速率(rETR), 隨群體粒徑增大, 電子傳遞速率隨光強增大呈下降趨勢, 尤其是當群體粒徑超過4 mm時, 隨光強增大rETR下降趨勢更為明顯(圖 7)。粒徑小的群體具有最大的光合速率和光能利用效率, 光抑制系數最小, 隨粒徑增大, 葛仙米群體的最大光合速率和光能利用效率下降, 光抑制系數增大, 粒徑最大的群體(G5)的最大光合速率僅為G1的29.42% (表 3)。

圖 5 不同粒徑葛仙米群體最大潛在光化學效率(Fv/Fm)、光合作用引起的熒光淬滅(qL)、非調節(jié)性能量耗散的量子產量[Y(NO)]的差異Fig.5 The values of Fv/Fm, qL and Y(NO) in Nostoc sphaeroides with different diameters

2.4 多糖積累

隨群體粒徑增加群體多糖含量先升高后降低(圖 8), 峰值出現在G3中, 即粒徑為2—4 mm的群體中, 粒徑小于1 mm時(G1)多糖含量最低, 此后隨粒徑增大而顯著升高, G3、G4之間差異不顯著(P>0.05),但當粒徑大于6 mm時(G5), 群體中多糖含量顯著下降(P<0.05)。

3 討論

3.1 色素含量的尺度效應

一般認為個體小的藻類有較快的增長速率, 在本研究中也發(fā)現, 個體小的葛仙米群體粒徑增長速率快, 增幅大, 隨培養(yǎng)時間延長, 葛仙米群體增長速率逐漸降低, 粒徑增幅逐漸變小(表 1), 不同粒徑葛仙米群體葉綠素a色素含量隨粒徑增大而下降(表2), 一方面可能是由于粒徑增大含水量升高, 單位鮮重中色素所占比例降低, 另一方面是由于自遮光效應使群體內部的光能減少, 細胞內葉綠素a含量發(fā)生適應性降低; 與鄧中洋等[16]得到的結果一致。

類胡蘿卜素是植物光合作用的輔助色素, 在保護細胞免受強光、活性氧和敏化色素的有害影響中起著重要的作用[17], 在葛仙米群體中, 類胡蘿卜素含量隨粒徑增大先升高后降低(圖 2); 類胡蘿卜素含量升高表明葛仙米群體應激性地響應因群體增長引起的外界環(huán)境不適; 粒徑大于8 mm后類胡蘿卜素含量顯著下降說明更大粒徑群體可能存在除類胡蘿卜素之外的其他保護機制或者新的適應機制, 值得進一步探討。

藻膽體是藍藻中重要的捕光色素, 具有較高的能量傳遞效率[18]; 葛仙米群體中藻藍蛋白/葉綠素a,藻紅蛋白/葉綠素a以及別藻藍蛋白/葉綠素a的比例在粒徑大于4 mm后增大(圖 4), 說明在群體粒徑較小, 葛仙米群體內部尚未出現自遮光效應時, 藻膽蛋白與葉綠素a的比例保持在較低水平; 隨粒徑增大群體內部出現自遮光效應, 大群體中光合色素的比例發(fā)生了顯著變化: 參與捕獲光能藻膽體的比例增高, 藻膽蛋白與葉綠素a的比例相應升高, 增強了葛仙米大群體內部藻細胞捕獲光的能力。此外, 藻膽蛋白組成也隨群體大小發(fā)生了變化, 這是由于藍藻中存在補色適應性, 可通過調整不同藻膽蛋白間的比例來適應不同顏色的光質, 小群體中PC所占比例最高, 在大群體中則是PE所占比例最高, 因為PE吸收光譜在490—570 nm, PC的吸收光譜在620 nm處, 根據量子光學理論, 光波長越長能量越低[19], 因此PE所能捕獲的光子能量最高, PC較低, 說明大群體為了適應逐漸減弱的光強而逐漸提高了PE的含量以捕獲波長更短穿透性更強的光子。

圖 6 不同粒徑葛仙米群體光系統Ⅰ電子傳遞速率[ETR(Ⅰ)]、PSI非光化學量子產量大小的Y(NA)、環(huán)式電子傳遞鏈大小[Y(CEF)]的差異Fig.6 The values of ETR (Ⅰ), Y (NA), Y (CEF) in Nostoc sphaeroides with different diameters

圖 7 不同粒徑葛仙米群體快速光響應曲線的差異Fig.7 The light response curve of Nostoc sphaeroides at different diameters

表 3 不同粒徑葛仙米群體的最大光合速率Pm、光能利用效率α和光抑制系數βTab.3 The parameters of Pm, α, β in Nostoc sphaeroides with different diameters

圖 8 不同粒徑群體相對多糖含量的差異Fig.8 The relative content of polysaccharide in Nostoc sphaeroides with different diameters

3.2 光合特性的尺度效應

在本研究中, 葛仙米群體光合能力隨粒徑增大而逐漸降低(圖 5), 主要體現在群體大最大潛在光合能力(Fv/Fm)、光合作用引起的熒光淬滅值(qL)均隨粒徑增大而顯著下降, 這和他人的結果類似。Dodds等[9,10]認為在同一個藻群體中, 距離表面不同位置的細胞光合特性不同, 因此當以群體作為研究對象時, 最大光合作用速率Pm和α都隨群體生物量和厚度的增加而降低, 造成這種現象的原因一方面是由于自遮光效應導致到達群體內部的光強降低,另一方面是由于大群體有更厚的擴散臨界層, 導致物質交換速率受限而出現生理活性降低[20], 一般認為引起Fv/Fm降低可能有兩方面的原因: 光損傷和熱能耗散[21], 在本研究中, 隨粒徑增大, 非調節(jié)性能量耗散的量子產量[Y(NO)]顯著升高, 光合速率和光抑制系數下降(表 3、圖 7)。同時, 粒徑較大的葛仙米群體雖然光合活性更低, 但仍能緩慢生長, 得益于電子傳遞速率的增高[22], 我們發(fā)現葛仙米群體的光系統Ⅰ傳遞速率、環(huán)式電子鏈大小均隨群體粒徑增大而升高(圖 6), 說明大粒徑群體可通過光系統Ⅰ介導的環(huán)式電子傳遞鏈耗散多余的能量[23],保護光系統免受損傷。可見, 葛仙米群體的光合特性表現出對不同粒徑的適應性特征。

3.3 活性物質積累的尺度效應

藻類大規(guī)模培養(yǎng)過程中, 針對不同目標產物常常采取不同的培養(yǎng)方式[24], 以獲得最大效益。葛仙米的大規(guī)模培養(yǎng)已初具規(guī)模[11], 藻類培養(yǎng)需要消耗營養(yǎng)和能量, 為獲得最大效益, 需要確定最佳采收時間節(jié)點, 以節(jié)省培養(yǎng)成本。

在本研究中發(fā)現, 隨群體粒徑增大, 多糖含量先升高后降低, 在群體粒徑3.03 mm時出現峰值(圖8), 在工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)葛仙米時, 長時間的培養(yǎng)會消耗藻類群體內部的胞外多糖, 并給培養(yǎng)增加不必要的時間和物料成本; 若以多糖作為目標產物,則在粒徑3.03 mm時采收會有最大收益。藻膽蛋白也是一種潛在的生物活性物質[25], 本研究發(fā)現藻膽蛋白的含量隨葛仙米群體粒徑的增大而降低(圖 3),所以若亦藻膽蛋白為目標產物, 則在粒徑0.77 mm時即可采收, 此時藻膽蛋白含量最高, 同時, 類胡蘿卜素作為一種重要的天然色素, 可作為工業(yè)中安全的添加劑, 某些類胡蘿卜素(β-胡蘿卜素)還是重要的保健品[26]。在本研究發(fā)現類胡蘿卜素的含量隨藻體粒徑的增大而先升高后降低, 峰值出現在粒徑為4.85 mm左右的群體中(圖 2), 此時采收葛仙米群體作為提取類胡蘿卜素具有最大收益。

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THE SIZE EFFECTS OF NOSTOC SPHAEROIDES DURING ITS GROWTH

ZHAO Xue1,2, PAN Ting-Ting1,2, MI Wu-Juan1, BI Yong-Hong1and HU Zheng-Yu1
(1.The Key Laboratory of Algal Biology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

This study investigated nutrients component, photosynthetic activities, pigments components, polysaccharide contents and photosynthetic activities during the colony size variation of Nostoc sphaeroides.The result showed that the content of chlorophyll a and phycobiliprotein decreased with increased colony particle size.The maximum content of carotenoid was occurred in colonies with particle size 4.85 mm; the phycobiliprotein contents was the highest in colonies with particle size 0.77 mm; the maximum content of polysaccharide was occurred in colonies with particle size 3.03 mm; the proportion of phycocyanin/chlorophyll a, phycoerythrin/chlorophyll a and allophycocyanin first increased and then decreased with the enhanced colony particle size; the maximum potential photosynthetic capacity (Fv/Fm) reduced with the increase of colony particle size.Colonies with smaller size were more tolerant to high light intensity than larger ones, and the high rate of cyclic electron transport of the colonies with large particle size can dissipate excess energy to counter the damage caused by the high light.The growth of Nostoc sphaeroides shows size effect and the cell component and photosynthetic activities mediate colony size variation, which are important to concern the mass of start culture and the harvest time of Nostoc sphaeroides.

Nostoc sphaeroides; Colony particle size; Photosynthetic activities; Metabolite

Q948.1

A

1000-3207(2017)04-0923-07

10.7541/2017.115

2016-03-07;

2017-01-14

國家自然科學基金(31123001); 中國科學院璀璨行動計劃資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31123001); Chinese Academy of Sciences CuiCan Action Plan]

趙雪(1991—), 女, 湖北十堰人; 碩士研究生; 主要從事藻類生理學研究。E-mail: zhaoxue258@gmail.com

畢永紅, E-mail: biyh@ihb.ac.cn