張小龍，湯貝貝，何玉鳳，段永忠，王麗春，張志曉，周巨民，李琦涵

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118； 2. 中國(guó)科學(xué)院/云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明 650223

·論著·

BALB/c小鼠作為單純皰疹病毒1型感染模型的免疫學(xué)分析

張小龍1,*，湯貝貝1,*，何玉鳳1，段永忠1，王麗春1，張志曉1，周巨民2，李琦涵1

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118； 2. 中國(guó)科學(xué)院/云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明 650223

在單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)小鼠感染及其相關(guān)研究中，臨床病理和免疫學(xué)指標(biāo)對(duì)其分析具有重要技術(shù)意義。本研究觀察了HSV-1在不同條件下感染BALB/c小鼠后的多個(gè)免疫學(xué)指標(biāo)，包括外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)群體中樹(shù)突細(xì)胞比例及功能、血清中和抗體水平、PBMC中HSV-1抗原特異性T細(xì)胞水平，以及潛伏感染期小鼠神經(jīng)組織中CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果顯示，HSV-1毒株Mckrae、17+以角膜及滴鼻途徑感染3周齡及6周齡BALB/c小鼠后，小鼠PBMC中樹(shù)突細(xì)胞數(shù)量增加，并顯示出刺激病毒抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力。病毒感染后35 d，小鼠PBMC中未檢測(cè)到白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)+抗原特異性T細(xì)胞，但能檢測(cè)到低水平的γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)+抗原特異性T細(xì)胞；小鼠血清中未檢測(cè)到或僅能檢測(cè)到低水平的中和抗體。HSV-1以皮下及足墊注射途徑感染BALB/c小鼠90 d后，足墊感染途徑較皮下感染誘導(dǎo)出更高水平的血清中和抗體，PBMC中可檢測(cè)到IL-4+及IFN-γ+抗原特異性T細(xì)胞，但不同毒株及小鼠周齡之間出現(xiàn)T細(xì)胞反應(yīng)程度差異。組織病理學(xué)結(jié)果表明，各組小鼠三叉神經(jīng)組織中均有CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)。這些結(jié)果提示，不同HSV-1毒株以不同途徑感染不同周齡BALB/c小鼠后，均可刺激樹(shù)突細(xì)胞成熟及呈遞病毒抗原，但血清中和抗體及PBMC中病毒抗原特異性T細(xì)胞水平在不同毒株、感染途徑及小鼠周齡之間有差異。

BALB/c小鼠；單純皰疹病毒1型；免疫學(xué)分析

單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)是一種在人群中廣泛傳播的病原體，感染人體后可分為急性感染、潛伏感染和病毒重激活幾個(gè)階段。急性感染常表現(xiàn)為無(wú)臨床癥狀或皮膚、黏膜的皰疹病變，然后病毒可沿感染部位神經(jīng)末梢逆軸突方向入侵感覺(jué)神經(jīng)組織，并在神經(jīng)細(xì)胞中形成終生潛伏感染[1]。此時(shí)病毒基因組保留在受感染細(xì)胞中，但基本不表達(dá)相關(guān)功能蛋白[1]。在外界刺激因素誘導(dǎo)下，潛伏于神經(jīng)細(xì)胞的病毒基因組開(kāi)始復(fù)制并表達(dá)病毒蛋白，最終組裝出感染性病毒顆粒，完成重激活過(guò)程。隨后感染性病毒沿神經(jīng)細(xì)胞順軸突方向傳播，回到初始感染部位，導(dǎo)致無(wú)癥狀的排毒，或口唇皰疹、皰疹性角膜炎，在免疫缺陷個(gè)體中重激活亦可導(dǎo)致皰疹性腦炎并危及生命[1]。

BALB/c小鼠是一種研究HSV-1感染與免疫的常用動(dòng)物模型[2]。BALB/c小鼠感染HSV-1后可表現(xiàn)出角膜炎、后肢麻痹、死亡等一系列臨床癥狀。HSV-1可有效潛伏于小鼠感覺(jué)神經(jīng)元中。在以小鼠為模型的HSV-1研究中，不同的研究者利用不同的HSV-1毒株、不同的攻毒途徑和不同周齡的小鼠[2]，而這些變量如何影響小鼠針對(duì)HSV-1的免疫反應(yīng)尚無(wú)明確界定。因此，利用小鼠模型評(píng)價(jià)治療與預(yù)防HSV-1感染的藥物及疫苗時(shí)，如何用具有客觀意義的指標(biāo)分析該動(dòng)物模型中HSV-1感染的免疫反應(yīng)特征具有重要技術(shù)意義。本研究觀察了不同HSV-1毒株以不同方式感染不同周齡BALB/c小鼠后表現(xiàn)出的急性感染及慢性感染過(guò)程中的免疫反應(yīng)特征，以期反映其感染小鼠過(guò)程中具有系統(tǒng)意義的綜合數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與病毒

3周齡及6周齡無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。HSV-1毒株Mckrae、17+經(jīng)Vero細(xì)胞傳代，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所病毒免疫室保存。

1.2 病毒感染

將HSV-1毒株Mckrae、17+分別以不同途徑感染3周齡及6周齡小鼠，感染劑量均為1×104PFU/只。將病毒用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)稀釋至相應(yīng)濃度。角膜感染組用移液器吸取病毒液滴于小鼠角膜處，左、右眼角膜各滴2.5 μL，每只小鼠共5 μL；滴鼻感染組用移液器吸取病毒液滴于小鼠鼻腔內(nèi)，左、右鼻腔各滴2.5 μL，每只小鼠共5 μL；足墊感染組用1 mL注射器吸取病毒液注射入小鼠左后肢足墊，每只小鼠共20 μL；皮下感染組用1 mL注射器吸取病毒液注射入小鼠背部皮下，每只小鼠共20 μL；對(duì)照組則以相應(yīng)方法注射等量PBS。

1.3 試劑

小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美侖生物，GlogiPlug、Cytofix/Cytoperm、PE-Cy7-CD11c、PE-CD80、APC-CD86、PerCP-Cy5.5-MHCII、FITC-IL12p70、PE-CD8α購(gòu)自BD公司，CD11c MicroBeads mouse-lyophilized分選試劑盒購(gòu)自Miltenyi Biotec公司，Mouse IFN-γ ELISpotPLUS、Mouse IL-4 ELISpotPLUS試劑盒購(gòu)自Mabtech公司。多肽由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。

1.4 樹(shù)突細(xì)胞數(shù)量及表型檢測(cè)

攻毒后第3天，采集小鼠外周血，每組3只，密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，于含10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h；然后向培養(yǎng)液中加入1 μL/mL的GlogiPlug，并繼續(xù)于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h；利用相應(yīng)抗體對(duì)細(xì)胞表面分子進(jìn)行染色，Cytofix/Cytoperm對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定及破膜，相應(yīng)抗體對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，并進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.5 樹(shù)突細(xì)胞刺激T細(xì)胞功能檢測(cè)

攻毒后第3天，采集小鼠外周血，每組3只，分離PBMC，按CD11c MicroBeads mouse-lyophilized分選試劑盒說(shuō)明書分選出CD11c+樹(shù)突細(xì)胞，通過(guò)尾靜脈將1×104個(gè)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞分別注射入6周齡雌性BALB/c小鼠體內(nèi)，每組3只，靜脈注射7 d后分離受體小鼠PBMC，以HSV-1多肽gB498-505和RR822-829為刺激物(10 μg/mL)，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-linked immunospot assay，ELISpot)檢測(cè)PBMC中抗原特異性γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)+T細(xì)胞數(shù)量。

1.6 血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)

采集小鼠外周血，每組4只，分離血清，用MEM培養(yǎng)基進(jìn)行1∶4、1∶8 …… 1∶512系列稀釋，HSV-1用MEM培養(yǎng)基稀釋至2×103CCID50/mL。取50 μL稀釋后的血清和50 μL稀釋后的病毒加入96孔板，37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h。然后將Vero細(xì)胞消化，置于含2% FBS的MEM溶液中，加入96孔板，每孔100 μL，共(2～3)×105個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，7 d后觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)。

1.7 IFN-γ+、白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL4)+抗原特異性T細(xì)胞檢測(cè)

采集小鼠外周血并分離PBMC，每組3只，用Mouse IFN-γ ELISpotPLUS和Mouse IL-4 ELISpotPLUS試劑盒，以HSV-1多肽gB498-505和RR822-829為抗原刺激物(10 μg/mL)，ELISpot法檢測(cè)小鼠PBMC中抗原特異性IFN-γ+、IL4+T細(xì)胞數(shù)量，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.8 三叉神經(jīng)組織中CD8+T細(xì)胞檢測(cè)

HSV-1感染小鼠后第90天，分離小鼠三叉神經(jīng)組織，取8 μm冷凍切片，用PE-CD8α抗體及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色，熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 5軟件，數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹(shù)突細(xì)胞表型及功能檢測(cè)

樹(shù)突細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的專職抗原呈遞細(xì)胞，通常在感染部位吞噬入侵抗原后其表型及功能逐漸成熟，表現(xiàn)為上調(diào)細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子及共刺激分子CD80和CD86表達(dá)，上調(diào)IL-12分泌，并移出感染部位，通過(guò)外周循環(huán)進(jìn)入外周淋巴組織[3]。功能成熟的樹(shù)突細(xì)胞依據(jù)趨化因子信號(hào)導(dǎo)向轉(zhuǎn)移至外周淋巴組織后，能有效向初始T細(xì)胞呈遞抗原并活化T細(xì)胞[3]。為觀察HSV-1感染BALB/c小鼠后樹(shù)突細(xì)胞對(duì)病毒抗原的呈遞功能，檢測(cè)不同攻毒條件組病毒感染BALB/c小鼠3 d后PBMC中CD11c+樹(shù)突細(xì)胞的比例及其表面MHCⅡ、CD80、CD86分子的表達(dá)量和IL-12的分泌量。結(jié)果顯示，除6周齡滴鼻感染組外，其余各組PBMC中樹(shù)突細(xì)胞比例較對(duì)照組均有所增加，但各組間未見(jiàn)顯著差異(圖1A、1B);各攻毒組樹(shù)突細(xì)胞表面CD80、CD86分子較對(duì)照組均有所上調(diào)，6周齡滴鼻感染組樹(shù)突細(xì)胞中IL-12分泌細(xì)胞數(shù)量有所增加，其余各組未見(jiàn)改變(圖1C)。各攻毒組間樹(shù)突細(xì)胞表面MHCⅡ分子表達(dá)量整體趨于一致，與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯改變。將各組小鼠感染病毒后第3天PBMC中的CD11c+樹(shù)突細(xì)胞分離出來(lái)，通過(guò)尾靜脈注射入未感染病毒的BALB/c小鼠，以考察負(fù)載了HSV-1抗原的樹(shù)突細(xì)胞在體內(nèi)刺激初始T細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各感染組分離的樹(shù)突細(xì)胞在體內(nèi)均顯示出刺激HSV-1抗原特異性初始T細(xì)胞增殖的能力，除3周齡角膜感染組外，其他組樹(shù)突細(xì)胞刺激T細(xì)胞的能力略有不同，但未見(jiàn)顯著性差異(圖2)。

2.2 血清中和抗體動(dòng)態(tài)變化檢測(cè)

經(jīng)角膜和滴鼻途徑感染小鼠后，持續(xù)檢測(cè)其血清中抗HSV-1中和抗體水平。結(jié)果顯示，僅在17+毒株角膜途徑感染6周齡小鼠后第21天開(kāi)始檢測(cè)到低水平的血清中和抗體，其余攻毒組血清中和抗體檢測(cè)均為陰性(圖3)。

A: Flow cytometry plot of CD11c+cell rate in PBMCs. B: CD11c+cells in PBMCs. C: Phenotype of CD11c+cells in PBMCs.

圖1 HSV-1感染后第3天PBMC中CD11c+細(xì)胞數(shù)量及表型檢測(cè)

Fig.1 CD11c+cell rate and phenotype in PBMCs 3 d after HSV-1 infection

圖2 樹(shù)突細(xì)胞刺激病毒抗原特異性T細(xì)胞增殖的功能檢測(cè)

Fig.2 Virus specific T cells stimulated by dendritic cells

圖3 血清中和抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)變化

Fig.3 Dynamic changes in neutralizing antibody titer

2.3 HSV-1抗原特異性T細(xì)胞水平檢測(cè)

分別于角膜和滴鼻途徑感染小鼠后14 d及35 d 檢測(cè)PBMC中HSV-1抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，攻毒后第14天各組均未檢測(cè)到IFN-γ+及IL-4+細(xì)胞，攻毒后第35天各組均能檢測(cè)到少量IFN-γ+細(xì)胞，但未檢測(cè)到IL-4+細(xì)胞(圖4)。

圖4 HSV-1感染后第35天PBMC中HSV-1抗原特異性T細(xì)胞水平

Fig.4 HSV-1 specific T cell rate in PBMCs 35 d after infection

2.4 慢性感染小鼠抗HSV-1特異性免疫反應(yīng)檢測(cè)

利用足墊注射和皮下注射攻毒途徑，探索HSV-1感染BALB/c小鼠后第90天小鼠體內(nèi)抗HSV-1特異性體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示，血清中和抗體出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，不同攻毒途徑之間表現(xiàn)出差異，足墊注射攻毒組較皮下注射攻毒組中和抗體水平更高，而不同毒株及不同周齡小鼠之間未觀察到顯著差異(圖5)。各感染組PBMC中均能檢測(cè)到針對(duì)HSV-1抗原的IFN-γ+和IL-4+T細(xì)胞，但不同感染組IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)量有顯著差異。對(duì)于3周齡小鼠，17+毒株感染組IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)較Mckrae毒株感染組更高(圖6)。在不同周齡17+毒株攻毒組中，3周齡小鼠IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)較6周齡小鼠更高(圖6)，但不同感染組針對(duì)HSV-1抗原的IL-4+T細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)顯著差異(圖6)。

圖5 HSV-1感染后第90天血清中和抗體水平

Fig.5 Neutralizing antibody titer 90 d after HSV-1 infection

HSV-1主要潛伏于小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞中。有研究認(rèn)為，聚集于這些神經(jīng)細(xì)胞周圍的CD8+T細(xì)胞對(duì)HSV-1潛伏狀態(tài)的維持具有重要作用[4]。利用免疫組化熒光染色技術(shù)，檢測(cè)皮下和足墊注射感染組HSV-1攻毒后第90天小鼠三叉神經(jīng)組織中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。結(jié)果顯示，各感染組小鼠三叉神經(jīng)組織中均能檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組未觀察到CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7)。

3 討論

樹(shù)突細(xì)胞對(duì)機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)至關(guān)重要，其吞噬病毒抗原后逐步下調(diào)抗原攝取能力，上調(diào)刺激T細(xì)胞能力，經(jīng)歷了功能成熟過(guò)程后，成為體內(nèi)可激活初始T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞，是連接天然免疫與特異性免疫的橋梁[5]。本研究觀察到，不同HSV-1毒株以不同攻毒方式感染不同周齡BALB/c小鼠后，除6周齡滴鼻感染組外其余各組PBMC中的樹(shù)突細(xì)胞數(shù)量均有所增加，各組小鼠在感染病毒后樹(shù)突細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)量均有所上調(diào)，6周齡滴鼻感染組IL-12分泌細(xì)胞數(shù)量有所上調(diào)，其余組未見(jiàn)明顯上調(diào)。PBMC中樹(shù)突細(xì)胞比例增加預(yù)示有更多樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)入外周血液循壞，并有可能被趨化到外周淋巴系統(tǒng)中，而樹(shù)突細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)量的上調(diào)及IL-12分泌細(xì)胞的增加則顯示樹(shù)突細(xì)胞正經(jīng)歷功能成熟的過(guò)程。雖然PBMC中樹(shù)突細(xì)胞數(shù)量及表面共刺激分子表達(dá)量在各感染組之間有所不同，但整體上未見(jiàn)顯著差異；與此相對(duì)應(yīng)，各組樹(shù)突細(xì)胞在體內(nèi)刺激HSV-1抗原特異性初始T細(xì)胞增殖的能力也大致相同。結(jié)果表明，不同HSV-1毒株以不同途徑感染不同周齡BALB/c小鼠后，小鼠體內(nèi)樹(shù)突細(xì)胞功能成熟及淋巴結(jié)趨化動(dòng)力學(xué)略有差異，但均能有效地從病毒感染部位攝取病毒抗原，并在完成功能成熟后刺激HSV-1抗原特異性初始T細(xì)胞增殖，以啟動(dòng)下游的特異性抗病毒免疫反應(yīng)。

圖6 HSV-1感染后第90天PBMC中HSV-1抗原特異性T細(xì)胞水平

Fig.6 HSV-1 specific T cell rate in PBMCs 90 d after infection

A: Infected mice. B: Control mice.

圖7 BALB/c小鼠感染HSV-1后三叉神經(jīng)組織中CD8+T浸潤(rùn)情況

Fig.7 CD8+T cell infiltration of trigeminal ganglia 90 d after HSV-1 infection

由輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4對(duì)刺激B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體至關(guān)重要，而HSV-1以角膜和滴鼻途徑感染BALB/c小鼠后14 d及35 d均未能在PBMC中檢測(cè)到HSV-1抗原特異性IL-4+T細(xì)胞，與角膜和滴鼻途徑攻毒后小鼠血清中的低水平中和抗體結(jié)果相一致。結(jié)果提示，HSV-1以角膜和滴鼻途徑感染BALB/c小鼠后35 d內(nèi)并不能有效刺激中和抗體產(chǎn)生，因此利用這兩種攻毒途徑的BALB/c小鼠感染模型來(lái)評(píng)價(jià)疫苗和藥物對(duì)中和抗體生成的影響將面臨困難。

HSV-1感染人體后可在感覺(jué)神經(jīng)元中潛伏，一旦潛伏狀態(tài)建立則無(wú)法被宿主免疫系統(tǒng)清除，從而形成終生潛伏感染[1]。HSV-1感染小鼠后，病毒基因組可潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)等感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞中，而感染性病毒顆粒則在14 d內(nèi)被免疫系統(tǒng)從體內(nèi)清除，從而使HSV-1感染從急性感染期轉(zhuǎn)向潛伏感染期[6-7]。對(duì)于HSV-1在小鼠體內(nèi)的潛伏感染，以前研究多選取感染后1個(gè)月左右的時(shí)段，更長(zhǎng)時(shí)間跨度的研究則較少。本研究選取病毒慢性感染小鼠后90 d作為更長(zhǎng)時(shí)間跨度的觀察時(shí)段，觀察不同毒株、不同攻毒途徑及不同周齡對(duì)小鼠抗HSV-1特異性免疫反應(yīng)的影響。血清中和抗體水平檢測(cè)結(jié)果顯示，病毒感染后90 d，各感染組均能檢測(cè)到不同水平的抗HSV-1血清中和抗體，其中足墊注射感染組中和抗體水平高于皮下注射感染組，不同小鼠周齡和不同毒株之間則未見(jiàn)顯著差異。足墊注射感染較皮下注射感染引發(fā)更高水平的血清中和抗體，因此該攻毒途徑的BALB/c小鼠感染模型更適合用于潛伏感染期小鼠體液免疫反應(yīng)的研究。

PBMC中HSV-1抗原特異性T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，病毒慢性感染后第90天，各感染組PBMC中均能檢測(cè)到不同水平的HSV-1抗原特異性IFN-γ+T和IL-4+T細(xì)胞，各感染組IL-4+T細(xì)胞數(shù)量趨于一致，但部分感染組IFN-γ+T細(xì)胞在不同毒株及不同周齡小鼠之間有差異。

HSV-1入侵神經(jīng)組織后，病毒抗原特異性CD8+T細(xì)胞會(huì)浸潤(rùn)至受感染的神經(jīng)組織中，并對(duì)HSV-1潛伏感染的神經(jīng)元形成持續(xù)免疫監(jiān)視，抑制病毒在這些神經(jīng)元中再激活[1,6]。檢測(cè)各感染組病毒感染后第90天小鼠三叉神經(jīng)組織中的CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)情況，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，所有感染組三叉神經(jīng)組織均出現(xiàn)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)。

以往研究表明，HSV-1在小鼠體內(nèi)的潛伏狀態(tài)及再激活特性主要由三方面決定：①HSV-1本身因素，包括潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體(latency-associated transcript，LAT)、病毒來(lái)源微小RNA(microRNA，miRNA)及部分即刻早期基因的作用[6,8-9]；②受感染的神經(jīng)元因素，包括細(xì)胞對(duì)病毒抗原的加工及呈遞效率、細(xì)胞Ⅰ型干擾素產(chǎn)生水平等[10-11]；③宿主特異性免疫系統(tǒng)因素，如進(jìn)入有病毒潛伏感染的神經(jīng)組織中的CD8+T細(xì)胞等[1]。這三方面的因素既獨(dú)立作用又相互影響，相互作用的平衡最終決定病毒的潛伏與再激活狀態(tài)。本研究觀察到不同HSV-1毒株以不同慢性感染途徑在不同周齡小鼠之間表現(xiàn)出的特異性抗病毒免疫反應(yīng)有差異，是否影響HSV-1在BALB/c小鼠神經(jīng)組織中的潛伏與再激活，值得進(jìn)一步研究。

本研究顯示，病毒毒株、感染途徑及小鼠周齡對(duì)小鼠抗病毒特異性免疫反應(yīng)有影響，這些結(jié)果對(duì)利用BALB/c小鼠模型來(lái)研究HSV-1感染及致病機(jī)制有相應(yīng)的技術(shù)意義。這意味著使用此類動(dòng)物模型進(jìn)行HSV-1感染及疫苗研究時(shí)，需注意不同病毒毒株、感染途徑及動(dòng)物年齡等因素對(duì)相關(guān)免疫學(xué)研究結(jié)果的影響。

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. LI Qihan, E-mail: liqihan@imbcams.com.cn

Immunological evaluation of BALB/c mice as an animal model for herpes simplex virus 1 infection

ZHANG Xiaolong1,*, TANG Beibei1,*, HE Yufeng1, DUAN Yongzhong1, WANG Lichun1, ZHANG Zhixiao1, ZHOU Jumin2, LI Qihan1

1.YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearchandDevelopmentonSevereInfectiousDisease,InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Kunming650118,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalModelsandHumanDiseaseMechanismsofChineseAcademyofSciences&YunnanProvince,KunmingInstituteofZoology,Kunming650223,China

To investigate the immunological responses of BALB/c mice to herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection, the following factors were followed: strains, infect routes and mouse ages, the dendritic cells (DCs) and HSV-1 specific T cell rate and function in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), serum neutralizing antibody titer, and CD8+T cell infiltration in nervous tissues in HSV-1-infected BALB/c mice. The results showed that 3-week- and 6-week-old BALB/c mice challenged with HSV-1 Mckrae and 17+ strains through corneal and nasal routes led to an increased rate of DCs in PBMCs, and conferred DC capacity to stimulate HSV-1 specific T cellsinvivo. At 35 d post infection, low level interferon γ (IFN-γ)+T cells and no interleukin 4 (IL4)+T cells could be detected in PBMCs, and low level neutralizing antibody was present or absent in serum. Ninety days after BALB/c mice challenged with HSV-1 through subcutaneous and foot pad injection, CD8+T cells could be detected in mouse trigeminal ganglia in different groups. However, HSV-1 specific IFN-γ+T cell and IL4+T cell rates showed divergence between different virus strains and mouse ages. Foot pad injection of BALB/c mice with HSV-1 could elicit higher neutralizing antibody titer compared with subcutaneous injection. This research demonstrated that, infection of different age BALB/c mice with different HSV-1 strains through different routes can stimulate comparable DC maturation and antigen presentation.

BALB/c mouse; Herpes simplex virus type 1; Immunological analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金(31670173)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2016-I2M-1-019)，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院“協(xié)和青年基金”(3332016115)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2016ZX350072)

李琦涵

2017-03-02)

*同為第一作者