李曉寧單筱淳吳 磊梁雪松遲 蕾劉雙嶺梅繼林李 諾

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

·實(shí)驗報告·

急性脊髓損傷后最佳干預(yù)時間窗的實(shí)驗研究*

李曉寧1單筱淳2吳 磊2梁雪松2遲 蕾2劉雙嶺1梅繼林2李 諾2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

目的觀察急性脊髓損傷（ASCI）后大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的最早時間，明確早期干預(yù)的時間點(diǎn)。方法 將48只雌性Wistar大鼠，隨機(jī)平分為兩組：假手術(shù)組（Sham）及急性脊髓損傷組（ASCI），每組各分為4個亞組即1 h、3 h、6 h和8 h。于相應(yīng)時間點(diǎn)進(jìn)行造模后取材。HE染色法觀察大鼠脊髓組織病理學(xué)形態(tài)變化；TUNEL染色法檢測大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，篩選出神經(jīng)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)最早時間點(diǎn)，確定早期干預(yù)的最佳時間點(diǎn)。結(jié)果1）HE染色結(jié)果顯示，ASCI組大鼠術(shù)后1 h和3 h可見灰質(zhì)小灶性斑片狀出血；術(shù)后6 h細(xì)胞形態(tài)明顯變化，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；術(shù)后8 h細(xì)胞損傷加重，形態(tài)進(jìn)一步變小，僅見殘存的神經(jīng)細(xì)胞。2）TUNEL檢測顯示，ASCI組術(shù)后6 h細(xì)胞形態(tài)改變顯著，可見凋散在凋亡神經(jīng)細(xì)胞，與Sham組比較有顯著差異（P＜0.05）；8 h后神經(jīng)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與Sham組比較具有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論急性脊髓損傷后6 h內(nèi)為本病最佳干預(yù)時間窗。

脊髓損傷 細(xì)胞凋亡 最佳干預(yù)時間窗

急性脊髓損傷（ASCI）是臨床常見的嚴(yán)重疾病之一，年發(fā)病率約為20～40/100萬，因其缺乏有效的治療手段，ASCI患者死亡率和致殘率都很高［1］。其發(fā)病的病因及病機(jī)復(fù)雜，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是本病繼發(fā)性損傷重要的病理機(jī)制之一［2］。本研究通過觀察急性脊髓損傷大鼠1 h、3 h、6 h和8 h 4個時間點(diǎn)相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)而尋求對ASCI大鼠進(jìn)行干預(yù)的最佳時間窗。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 選取48只健康Wistar雌性大鼠（由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供），體質(zhì)量（200±10）g。每日固定人工照明（12：12光/暗周期），在實(shí)驗室常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.2 試藥與儀器 二甲苯 （國藥，X112051）；蘇木精（Solarbio，H8070）；曙紅Y，醇溶（國藥，S23025101）；原位細(xì)胞死亡檢測工具（羅氏，11684817910）；過氧化氫（國藥，10011218）；DAB顯色液 （Solarbio，DA1010）；Triton X-100（碧云天，ST795）；打擊器（美國Impactor Model-Ⅲspinal lord contusion system）。

1.3 分組與造模 1）動物分組：將48只大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為兩組4個時間點(diǎn)，分別為假手術(shù)組（Sham組，24只）和急性脊髓損傷組（ASCI組，24只），每組又分為1 h、3 h、6 h和8 h 4個亞組，每組6只。Sham組：僅暴露脊髓，不撞擊損傷，手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處置。ASCI組：模型制備成功后，置于單籠飼養(yǎng)，同時不進(jìn)行任何處置。2）模型制備：急性脊髓損傷模型制備［3-4］，采用打擊器打擊制作大鼠ASCI模型（T10，中度損傷）。用10%水合氯醛腹腔麻醉，常規(guī)消毒，于T10行約3 cm的縱行切口，暴露T9-11棘突，銳性分離肌肉至關(guān)節(jié)突，充分暴露棘突和椎板，在T10部位行椎板摘除術(shù)，但不破壞硬脊膜。暴露以T10為中心段脊髓，并以10 g×50mm勢能撞擊脊髓，造成該段的急性脊髓中度損傷，沖洗傷口并縫合。

1.4 觀察指標(biāo) HE染色觀察脊髓組織病理學(xué)形態(tài)變化，經(jīng)切片脫蠟至水、染色、脫水、透明、封片、鏡檢等步驟進(jìn)行HE染色并鏡下觀察。TUNEL檢測脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，經(jīng)透化、PBS漂洗、封閉、Labeling、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片鏡檢等步驟觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多個樣本均數(shù)之間的多重分析行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖1 各組大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色，200倍）

2.1 各組脊髓組織病理形態(tài)學(xué)變化 見圖1。HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠脊髓組織灰質(zhì)、白質(zhì)、脊髓前角和后角、中央管結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核形態(tài)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤及神經(jīng)細(xì)胞變性。ASCI組中1 h和3 h可見灰質(zhì)小灶性斑片狀出血，大部分細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，僅數(shù)個細(xì)胞萎縮，偶有神經(jīng)元水腫；6 h可見細(xì)胞形態(tài)變化顯著，胞體變小，胞核固縮碎裂，胞膜皺縮、濃染，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；8 h較6 h細(xì)胞損傷加重，僅見殘存的神經(jīng)細(xì)胞。以上結(jié)果表明，脊髓損傷后6 h神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡形態(tài)改變。

2.2 各組TUNEL法檢測脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡 見表1，圖2。TUNEL檢測中，標(biāo)記的陽性細(xì)胞的細(xì)胞核染色呈棕褐色，正常細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染成藍(lán)色。檢測結(jié)果顯示，Sham組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)淡染，胞核藍(lán)色，未見明顯凋亡細(xì)胞；ASCI組1 h時未見神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)明顯變化，胞核藍(lán)染；3 h神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)略有變化，失去正常多角形，略變圓，偶見染色質(zhì)邊集，呈斑片狀聚集核膜周圍，胞漿濃染，但細(xì)胞膜相對較完整；6 h神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)明顯改變，多極形消失，部分細(xì)胞核裂解，染色質(zhì)分割成塊狀，可見凋亡小體出現(xiàn)，見散在凋亡細(xì)胞，與假手術(shù)組相比，差異具有顯著意義（P＜0.05）；8 h細(xì)胞進(jìn)一步固縮，細(xì)胞間隙變大，殘存的神經(jīng)細(xì)胞減少，神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多，與Sham組比較差異顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，大鼠ASCI后6 h脊髓組織出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，結(jié)果與HE染色所見組織病理改變相符。

表1 各組大鼠TUNEL法檢測凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠TUNEL法檢測凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比較（±s）

與Sham組比較，*P＜0.05；與本組6 h時比較，△P＜0.05。下同。

組別 n 1 h 3 h 6 h 8 h Sham組 61.50±0.84 0.83±0.75 0.67±0.52 1.00±0.63 ASCI組 61.33±0.52 1.17±0.41 8.17±1.72*16.17±2.04*△

圖2 各組大鼠凋亡神經(jīng)細(xì)胞（TUNEL法，400倍）

3 討 論

急性脊髓損傷后引發(fā)脊髓微環(huán)境系列變化的機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究主要目標(biāo)為組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，研究內(nèi)容包括一系列的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡［5］、興奮性氨基酸的毒性作用、線粒體途徑產(chǎn)生的促凋亡蛋白等。萬勇［6］在研究中，將損傷后不同時間點(diǎn)腹腔注射重組人紅細(xì)胞生成素（rHuEPO），觀察大鼠后肢運(yùn)動功能及脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)對急性脊髓損傷后脊髓神經(jīng)元保護(hù)作用的用藥時間窗為6 h。急性脊髓損傷后，會因遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞壞死及凋亡造成繼發(fā)性損傷。研究表明［7］，當(dāng)急性脊髓損傷早期，會出現(xiàn)組織出血、水腫、壞死及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，隨后炎性細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生聚集，最后實(shí)質(zhì)細(xì)胞萎縮、形成慢性壞死囊腔及膠質(zhì)癱痕［8］。因此在準(zhǔn)確時間窗對大鼠ASCI后進(jìn)行干預(yù)是減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，降低急性脊髓損傷并發(fā)癥的發(fā)生率，促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)的關(guān)鍵。

神經(jīng)元丟失主要原因之一為細(xì)胞凋亡［9］，凋亡同樣也是具有時間依賴性。王健等［10］在研究中發(fā)現(xiàn)，急性脊髓損傷后6 h出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，凋亡的高峰時間從損傷后6 h開始。由此得出：早期應(yīng)用藥物川芎嗪干預(yù)治療，可有效抑制脊髓損傷后大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，早期電針干預(yù)能更好的減輕大鼠ASCI細(xì)胞凋亡，可保護(hù)脊髓組織和神經(jīng)元細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，保護(hù)部分運(yùn)動功能［11］。因此，明確大鼠ASCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的時間，最大限度挽救神經(jīng)元，有助于促進(jìn)損傷后的運(yùn)動功能的恢復(fù)［12-15］。本研究證實(shí)大鼠ASCI后明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)在損傷后6 h，其治療的“最佳時間窗”應(yīng)在損傷后6 h以內(nèi)。

［1］ 唐祎周，孫忠人，張翀.夾脊電針對脊髓損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子IRE1影響的實(shí)驗研究［J］.針灸臨床雜志，2013，29（8）：55-58.

［2］ 李曉寧，王寧.電針對大鼠脊髓損傷后細(xì)胞凋亡PARP-1全長影響的研究［J］.針灸臨床雜志，2011，27（5）：57-59.

［3］ Alvarez-Mejia L1，Morales J.Functional recovery in spinal cord injured ratsusing polypyrrole/iodine implantsand treadmill training［J］.JMater SciMaterMed，2015，26（7）：209.

［4］ Basso DM1，Beattie MS，Bresnahan JC.Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection［J］.Exp Neurol，1996，139（2）：244-256.

［5］ 張紀(jì)浩，張俐.中藥對脊髓缺血再灌注損傷微環(huán)境的作用及機(jī)制研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（1）：208-211.

［6］ 萬勇，徐磊.重組人紅細(xì)胞生成素治療大鼠急性脊髓損傷的用藥時間窗探討［J］.中國脊柱脊髓雜志，2010，20（9）：760-761.

［7］ 孫福榮.脊髓康對大鼠脊髓損傷后軸突再生微環(huán)境的作用機(jī)制研究［D］.南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

［8］ 方超，徐祝軍，楊民，等.不同時間點(diǎn)應(yīng)用甲氨蝶呤對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2016，4（9）：466-472.

［9］ 張林，孫忠人.近10年電針治療脊髓損傷機(jī)制的實(shí)驗研究進(jìn)展［J］.針灸臨床雜志，2012，1（5）：39-41.

［10］王健，賈玉柱.川芎嗪對急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡和Caspase-3mRNA表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（12）：2662-2665.

［11］孫立明，李巖.火針對脊髓損傷模型大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響［J］.針灸臨床雜志，2010，12（3）：36-37.

［12］劉亞東，陳學(xué)名.大鼠脊髓損傷后大腦運(yùn)動皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的觀察［J］.中國脊柱脊髓雜志，2013，6（4）：23-24.

［13］李一帆，陳東，薛輝，等.甲強(qiáng)龍、電針聯(lián)合羊膜上皮細(xì)胞移植對脊髓損傷大鼠軸漿運(yùn)輸功能及GFAP表達(dá)的影響［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，36（4）：620-624.

［14］DM Basso，MSBeattie，JCBresnahan.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.JNeurotrauma，1995，12（1）：1-21.

［15］賈祎佳.轉(zhuǎn)SHH基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗研究［D］.山西醫(yī)科大學(xué)，2014.

Experimental Study of the Proper Time W indow of Intervention after Acute Spinal Cord Injury

LIXiaoning，SHAN Xiaochun，WU Lei，et al. The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China.

Objective：To observe the earliest time of neuronal apoptosis in rats after acute spinal cord injury（ASCI），and to determine the time of early intervention.M ethods：48 female Wister rats were random ly divided into the sham operation group（Sham）and acute spinal cord injury group（ASCI），and each group was divided into four subgroups：1 h，3 h，6 h and 8 h.The ratswere sacrificed at the corresponding time point after themodelwas made.HE staining was used to observe the pathological changes of the spinal cord in rats，and TUNEL staining was used to detect the apoptosis of rats to select the earliest time point of apoptosis and to determine the best time of early intervention.Results：1）HE staining showed that1 h and 3 h after operation，there was Graymatter focal patchy hemorrhage in ASCIgroup，and 6 h after operation，the cellmorphology changed obviously，and the nerve cells showed apoptosis，and 8h after operation，cellmorphological damage grew serious，further smaller，only surviving nerve cells.2）TUNEL assay showed 6 h after operation，themorphological changes of the cells were obvious，and the apoptosis was found in the apoptotic neurons.There was a significant difference compared with the Sham group（P<0.05）.8 h after operation，the number of apoptotic cells increased significantly.Compared with group Sham，the difference was significant（P<0.05）.Conclusion：The best intervention time window iswithin six hours after acute spinal cord injury.

Spinal cord injury；Apoptosis；Proper timewindow of intervention

R651.2

A

1004-745X（2017）07-1213-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.026

2017-03-25）

國家自然科學(xué)基金（面上）項目（81373715）