戚珊珊, 周禮紅,3, 胡久平, 劉 敏, 趙 輝*, 熊 燕

(1. 西藏月王生物技術(shù)有限公司，西藏 拉薩 850000；2.青藏高原微生物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，西藏 拉薩 850000；3.貴州大學(xué)，生命科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

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西藏多地區(qū)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定及多樣性分析

戚珊珊1,2, 周禮紅1,2,3, 胡久平1,2, 劉 敏1,2, 趙 輝1,2*, 熊 燕1,2

(1. 西藏月王生物技術(shù)有限公司，西藏 拉薩 850000；2.青藏高原微生物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，西藏 拉薩 850000；3.貴州大學(xué)，生命科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

【目的】了解西藏多地區(qū)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性。【方法】采用梯度稀釋涂布分離法分離土壤細(xì)菌，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)去除冗余，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定其種屬，研究其親緣關(guān)系及多樣性?！窘Y(jié)果】經(jīng)形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA序列測(cè)定，38株細(xì)菌菌株歸屬于四個(gè)類群，厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，變形菌門(Proteobacteria)，12個(gè)科，13個(gè)屬，包含鏈霉菌屬(Streptomyces)11株，芽孢桿菌屬(Bacillus)10株，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)3株、類香味菌屬(Myroides)3株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)1株、新鞘氨醇菌屬(Novosphingobium)1株、紅球菌屬(Rhodococcus)2株、諾卡氏菌屬(Nocardia)1株、擬無(wú)枝菌酸菌屬(Amycolatopsis)2株、氨基桿菌屬(Aminobacter)1株、原小單孢菌屬(Promicromonospora)1株、威廉姆斯氏菌屬(Williamsia)1株，分支桿菌屬(Mycobacterium)1株?！窘Y(jié)論】西藏地區(qū)土壤中細(xì)菌多樣性豐富，優(yōu)勢(shì)菌為鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬。根據(jù)多樣性指數(shù)分析，同一地區(qū)，3000～4000 m海拔的土壤細(xì)菌多樣性低于4000～5000 m海拔地區(qū)，3000～4000 m海拔地區(qū)土壤細(xì)菌分布較均勻。林芝地區(qū)土壤細(xì)菌多樣性豐富，山南地區(qū)土壤細(xì)菌多樣性最少。

土壤細(xì)菌；16S rDNA；多樣性；分離鑒定

【研究意義】青藏高原海拔高，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣，氣候惡劣，具有極地特點(diǎn)。由于地理的特殊性，青藏高原土壤細(xì)菌具有特殊性，是全球微生物多樣性的重要部分。青藏高原土壤細(xì)菌長(zhǎng)期生活在極端環(huán)境中，適應(yīng)了極端氣候，在進(jìn)化過(guò)程中可能會(huì)形成獨(dú)特的代謝途徑，新的調(diào)控機(jī)制及與之相關(guān)的新型基因，產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)。因此，有較大可能成為新型藥物及發(fā)酵工程菌種的重要來(lái)源之一。【前人研究進(jìn)展】我國(guó)學(xué)者對(duì)西藏地區(qū)生態(tài)環(huán)境中的細(xì)菌多樣性的研究主要集中在北部冰川、鹽堿湖及高原湖泊沉積物等[1-3]。土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的研究較少[4-6]，羅建峰[7]等分析了西藏高原土壤可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同采樣點(diǎn)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和分布上的差異。唐雅利[8]分離西藏地區(qū)環(huán)境中的細(xì)菌，尚未發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌菌株占分離細(xì)菌總數(shù)的15.7 %。【本研究切入點(diǎn)】本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法對(duì)西藏各地區(qū)的土壤細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定，分析西藏各地區(qū)土壤細(xì)菌多樣性系數(shù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】了解西藏各地區(qū)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的的優(yōu)勢(shì)種群及多樣性，為更好的開發(fā)和利用西藏地區(qū)土壤細(xì)菌資源奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣的采集與處理 供試土樣采集地點(diǎn)為林芝、拉薩、那曲、日喀則、山南。采集時(shí)間2013年7月。采樣信息參見(jiàn)表1。采用五點(diǎn)取樣法，在50 cm×50 cm的正方形取樣地上，用無(wú)菌小鏟挖取5～10 cm深處土壤，每處的采樣量一致，將每處的土樣均勻混合后裝入滅菌的采樣袋中密封，放置于冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于4 ℃冰箱中保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 微生物生理生化微量管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自索萊寶公司，E×TaqDNA Polymerase等擴(kuò)增所用試劑購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。PCR儀為Bio-Rad公司生產(chǎn)的Thermal Cycler S1000，凝膠成像分析儀為Bio-Rad公司生產(chǎn)的Gel DocTMXR+。

1.2 土壤細(xì)菌的分離培養(yǎng)

土壤細(xì)菌分離采用梯度稀釋涂布平板分離法，稱取1 g土樣，加入9 mL無(wú)菌水搖勻，制成10-1濃度土壤懸液，吸取1 mL的10-1濃度土壤懸液加入9 mL無(wú)菌水，此為10-2濃度土壤懸液，依此方法制成10-2～10-6濃度土壤懸液，靜置5 min。取0.2 mL濃度為10-4～10-6的上層清液均勻的涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，每個(gè)濃度3個(gè)平行。置于35 ℃恒溫培養(yǎng)2～5 d。挑取形態(tài)特征各異的菌落，四區(qū)劃線直至出現(xiàn)單菌落，4 ℃下短期保藏于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

疑似細(xì)菌菌落的菌株劃線于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察描述并記錄單菌落的形態(tài)特征，包括菌落大小、形狀、顏色、質(zhì)地、有無(wú)隆起、邊緣形狀、透明度、產(chǎn)色素情況等。采用革蘭氏染色法染色，在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的顯微結(jié)構(gòu)特征，記錄細(xì)胞大小，形狀、排列方式等。參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等鑒定手冊(cè)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化試驗(yàn)[9-11]。

表1 土壤樣品采樣信息

疑似放線菌菌落的菌株劃線于高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，期間對(duì)單個(gè)菌落的形態(tài)進(jìn)行觀察描述，記錄其形態(tài)特征。包括菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、隆起、邊緣形狀、氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的顏色、有無(wú)產(chǎn)色素等。在光學(xué)顯微鏡下觀察放線菌的顯微結(jié)構(gòu)特征，記錄氣生菌絲的有無(wú)，基內(nèi)菌有無(wú)斷裂，分生孢子形狀、大小、排列等。

1.4 16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增與測(cè)序

吸取1mL供試菌株菌懸液加入到1.5 mL離心管中，離心收集菌體。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。細(xì)菌16S rDNA基因序列的擴(kuò)增采用通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[12]。

PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR MasterMix 25 μl；27f (10 μM) 1.0 μl；1492r(10 μM) 1.0 μl；DNA模板(50 ng/mL) 10.0 μl；ddH2O加至50 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上80 V電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察，拍照。擴(kuò)增產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存。

1.5 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株的16S rDNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行有效種的序列相似性搜索，獲取相似度較高的相關(guān)模式菌株的16S rDNA基因序列。用ClustalX 2.0對(duì)菌株的16S rDNA基因序列及其近似序列進(jìn)行多序列比對(duì)后，MEGA6.0軟件進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算進(jìn)化距離，鄰接法(Neighbor-joining)獲得分支系統(tǒng)樹，設(shè)定自展值(Bootstrap value)1000評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

1.6 細(xì)菌多樣性指數(shù)

運(yùn)用辛普森(Simpson)多樣性指數(shù)(D)、香農(nóng)-納威(Shannon-Wiener)指數(shù)(H)、香農(nóng)-納威(Shannon-Wiener)均勻度指數(shù)(E)計(jì)算多樣性[12]。計(jì)算公式如下。

辛普森(Simpson)多樣性指數(shù):

香農(nóng)-納威(Shannon-Wiener)指數(shù):

香農(nóng)-納威(Shannon-Wiener)均勻度指數(shù):

式中，S為菌種數(shù)。Pi為第i種的多度比例。即群落中物種i的個(gè)體占總個(gè)體的比例[10]。Ni是第i種的菌株數(shù)，N是所有菌株數(shù)總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果

從形態(tài)上看，細(xì)菌菌落有白色、黃色、粉色，質(zhì)地包括蠟狀、液滴狀、皮革狀。細(xì)胞多數(shù)為桿狀，少數(shù)為球狀、分支狀。放線菌菌落多數(shù)為白色，表面干燥，呈粉狀，細(xì)胞多分支，無(wú)隔，產(chǎn)生可溶性色素，具典型的鏈霉屬特征。生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示西藏土壤細(xì)菌多數(shù)呈革蘭氏染色陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，明膠液化陽(yáng)性，能在10 %NaCl生長(zhǎng)，多數(shù)能利用葡萄糖，果糖，蔗糖。

2.2 16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增及分析

通過(guò)16S rDNA序列在NCBI上比對(duì)，38株供試菌株分布于細(xì)菌的13個(gè)屬(表2)。鏈霉菌屬(Streptomyces)出現(xiàn)頻率最高，有11株，其次為芽孢桿菌屬(Bacillus)，有10株，16S rDNA序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性多數(shù)在99 %以上。此外還有節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、類香味菌屬(Myroides)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、新鞘氨醇菌屬(Novosphingobium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、擬無(wú)枝菌酸菌屬(Amycolatopsis)、氨基桿菌屬(Aminobacter)、原小單孢菌屬(Promicromonospora)、威廉姆斯氏菌屬(Williamsia)和分支桿菌屬(Mycobacterium)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖1可知，系統(tǒng)發(fā)育樹分為四個(gè)大分支。第一個(gè)分支是放線菌門(Actinobacteria)為高G+C含量，革蘭氏陽(yáng)性菌，包括鏈霉菌屬、節(jié)桿菌屬、紅球菌屬、原小單孢菌屬、分支桿菌屬、諾卡氏菌屬、威廉姆斯氏菌屬和擬無(wú)枝菌酸菌屬，共8個(gè)屬。第二個(gè)分支為厚壁菌門(Firmicutes)，屬于高G+C含量[13-15]，革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬，共2個(gè)屬。第三個(gè)分支擬桿菌門(Bacteroidetes)僅有類香味菌屬[16-18]，第四個(gè)分支是變形菌門(Proteobacteria)，包括新鞘氨醇菌屬和氨基桿菌屬，共2個(gè)屬。從進(jìn)化樹上看，有25株可以歸入種一級(jí)的分類單元，占65.8 %。

表2 測(cè)序供試菌株

2.4 細(xì)菌多樣性指數(shù)

根據(jù)公式計(jì)算細(xì)菌多樣性指數(shù)，評(píng)價(jià)西藏土壤可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性。辛普森多樣性指數(shù)(Simpson)D為0.7901，香農(nóng)-納威(Shannon-Wiener)指數(shù)H為2.2327，香農(nóng)-納威均勻度指數(shù)E為0.4047。由此可知，西藏土壤細(xì)菌具有較豐富的多樣性。

圖1 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的西藏部分地區(qū)土壤細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence Bootstrap value expressed as a percentage of 1000 replication were given at the branching point

地區(qū)多樣性指數(shù)辛普森多樣性指數(shù)(Simpson)D香農(nóng)-納威(Shannon?Wiener)指數(shù)H香農(nóng)-納威均勻度指數(shù)E林芝0．99921．22850．2098那曲0．99441．89360．3432拉薩0．99140．58700．1064山南0．90640．28690．0519日喀則0．99690．44530．0807

在3000～4000 m海拔上，土壤細(xì)菌辛普森多樣性指數(shù)D為0.6331，香農(nóng)-納威指數(shù)為2.4319，香農(nóng)-納威均勻度指E為0.8662；在4000～5000 m海拔上，土壤細(xì)菌辛普森多樣性指數(shù)D為0.8406，香農(nóng)-納威指數(shù)為3.0778，香農(nóng)-納威均勻度指數(shù)為0.5063。

辛普森多樣性指數(shù)(Simpson)D的排序(表3)為：林芝>日喀則>那曲>拉薩>山南。香農(nóng)-納威(Shannon-Wiener)指數(shù)H的排序?yàn)椋耗乔?林芝>拉薩>日喀則>山南。香農(nóng)-納威均勻度指數(shù)E的排序?yàn)椋耗乔?林芝>拉薩>日喀則>山南。

3 討 論

本研究分離獲得菌株的形態(tài)多樣。在菌種分離期間，多數(shù)細(xì)菌的菌落在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)很小，直徑小于2 mm，可能是由于西藏地區(qū)土壤中營(yíng)養(yǎng)比較貧瘠，細(xì)菌在短期內(nèi)沒(méi)有適應(yīng)，難以長(zhǎng)出。通過(guò)多次純化與傳代，部分細(xì)菌的生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，但有一些菌株在多次轉(zhuǎn)接傳代后不再生長(zhǎng)，說(shuō)明這部分細(xì)菌可能對(duì)營(yíng)養(yǎng)或培養(yǎng)條件存在特殊要求，很可能存在特殊的代謝方式。

38株供試菌株分布于細(xì)菌4個(gè)門，12個(gè)科，13個(gè)屬。其中，鏈霉菌屬(Streptomyces)11株，芽孢桿菌屬(Bacillus)10株，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)3株、類香味菌屬(Myroides)3株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)1株、新鞘氨醇菌屬(Novosphingobium)1株、紅球菌屬(Rhodococcus)2株、諾卡氏菌屬(Nocardia)1株、擬無(wú)枝菌酸菌屬(Amycolatopsis)2株、氨基桿菌屬(Aminobacter)1株、原小單孢菌屬(Promicromonospora)1株、威廉姆斯氏菌屬(Williamsia)1株，分支桿菌屬(Mycobacterium)1株。可見(jiàn)，鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬是西藏地區(qū)土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌，與郭慧娟的結(jié)果一致[19]。此外，本研究分離獲得了較多的稀有放線菌，如諾卡氏菌、擬無(wú)枝菌酸菌、原小單孢菌等，稀有放線菌是新型抗生素的重要來(lái)源之一，具有重要的科研價(jià)值。

同一個(gè)地區(qū)，3000～4000 m海拔梯度上的土壤細(xì)菌多樣性低于4000～5000 m海拔梯度上地區(qū)的土壤細(xì)菌多樣性，3000～4000 m海拔地區(qū)的物種均勻度較高。與孫懷博的研究結(jié)果一致[20]。林芝地區(qū)氣候環(huán)境條件相對(duì)溫和，因此土壤細(xì)菌多樣性豐富，山南地區(qū)土壤細(xì)菌多樣性最少。

4 結(jié) 論

西藏地區(qū)土壤細(xì)菌多樣性較豐富，且代謝方式存在特殊性，西藏地區(qū)菌種資源具有很大的開發(fā)潛力。特殊的生態(tài)環(huán)境和氣候決定了西藏地區(qū)蘊(yùn)含著大量特殊的微生物資源，目前對(duì)西藏地區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌的研究較少。了解西藏地區(qū)土壤細(xì)菌種類，可以為合理開發(fā)和利用打好基礎(chǔ)。西藏地區(qū)作為微生物資源的寶庫(kù)，蘊(yùn)含了巨大的價(jià)值，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，西藏的生態(tài)環(huán)境處在不斷變化中，大量微生物物種正在快速消失，研究西藏地區(qū)微生物資源對(duì)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Isolation, Identification and Diversity of Soil Bacteriain Multiple Regions from Tibetan Plateau

QI Shan-shan1,2,ZHOU Li-hong1,2,3,HU Jiu-ping1,2,LIU Min1,2,ZHAO Hui1,2*,XIONG Yan1,2

(1. Tibet Yuewang Biotechnology Co., Ltd.,Tibetan Lhasa 850000, China;2. National United Engineering Research Center for Tibetan Plateau Microbiology, Tibetan Lhasa 850000, China;3.Institute of Fungi Resource, College of Life Science, Guizhou University, Guizhou Guiyang 550025, China)

【Objective】 The study aims to understand the culturable bacterial diversity isolated from the soil in multiple regions of Tibet plateau.【Method】Soil samples from Tibet plateau, were used to isolate by dilution plate coating method. Strains were identified by morphology and 16S rDNA sequence analyses. 【Result】Results show that 38 strains belong to 4 phylogenetic groups (Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes), 12 families and 13 genus ,includingStreptomyces11 strains,Bacillus10 strains ,Arthrobacter3 strains,Myroides3 strains ,Staphylococcus1 strain ,Novosphingobium1 strain ,Rhodococcus2 strains ,Nocardia1 strain,Amycolatopsis2 strains,Aminobacter1 strain,Promicromonospora1 strian,Williamsia1 strian,Mycobacterium1 strain. 【Conclusion】Soil bacteria is abundant in Tibet plateau,StreptomycesandBacilluswere most common groups. Soil bacteria diversity is more abundant in higher altitudes.Linzhi soil bacterial diversity was abundant and the uniformity of soil bacteria was low in Shannan area.

Soil bacteria；16s rDNA；Diversity

1001-4829(2017)7-1629-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.028

2016-10-12

國(guó)家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金(12c2621540 6517)

戚珊珊(1984-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镂⑸镔Y源開發(fā)與利用，E-mail：xiaowanzi61@hotmail.com，*為通訊作者。

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