林文革，毛新，林琛

（地緣（廈門(mén)）生物科技有限公司，福建廈門(mén)361006）

半楓荷快速繁殖技術(shù)及改進(jìn)研究

林文革，毛新，林琛

（地緣（廈門(mén)）生物科技有限公司，福建廈門(mén)361006）

本研究提供了一種新的半楓荷快速繁殖體系，以?xún)?yōu)良種源的半楓荷的莖段為外植體，誘導(dǎo)叢生芽增殖、生根、組培苗馴化移栽而建立起半楓荷完整的快速繁殖體系。目的是提供一種簡(jiǎn)單、誘導(dǎo)率高、成活率高的半楓荷的完整組培快繁方法。并且進(jìn)一步通過(guò)組培組分的優(yōu)化，使增殖率達(dá)到理想程度的3～4倍，生根率穩(wěn)定在95%以上，移栽成活率達(dá)到95%以上。利用此方法可以簡(jiǎn)單、高效地培育出大量的半楓荷組培苗，從而有效地保護(hù)和繁殖該物種，滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)半楓荷的需求，同時(shí)解除半楓荷的瀕危狀態(tài)，為今后更進(jìn)一步保護(hù)和利用該物種奠定良好的基礎(chǔ)。

半楓荷；組織培養(yǎng)；快速繁殖；瀕危植物

半楓荷(Semiliquidambar cathayensis)為金縷梅科半楓荷屬植物，為1962年發(fā)表的新屬半楓荷屬模式種，我國(guó)特有種[1]。該物種在學(xué)術(shù)研究、中醫(yī)藥用以及園林應(yīng)用等很多方面都具有極高的價(jià)值。但是人為的不合理開(kāi)發(fā)利用，導(dǎo)致其資源被破壞嚴(yán)重。半楓荷在1987年國(guó)家環(huán)境保護(hù)局等頒布的《中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物名錄（第一冊(cè)）》中，被列為國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)級(jí)保護(hù)植物；在1992年傅立國(guó)主編的《中國(guó)植物紅皮書(shū)—稀有瀕危植物》中被列為稀有種；在國(guó)務(wù)院1999年8月4日頒布的《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第一批）》中被提升為國(guó)家II級(jí)保護(hù)植物。在2003年，汪松、解焱主編的《中國(guó)物種紅色名錄》中有關(guān)專(zhuān)家根據(jù)數(shù)據(jù)資料推測(cè)，半楓荷在過(guò)去3個(gè)世代內(nèi)致危因素沒(méi)有停止，種群至少減少了30%，因此將半楓荷列入易危等級(jí)，在未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)其種群面臨絕滅的概率較高。

半楓荷是一種珍貴的藥用植物，根、枝、樹(shù)皮都可入藥，能活血通絡(luò)、祛風(fēng)除濕，可以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、半身不遂、跌打淤積、腫痛、產(chǎn)后風(fēng)癱，外傷常用于止血，是產(chǎn)區(qū)群眾常用的中藥，具有很高的藥用價(jià)值[2-4]。目前，半楓荷作為重要的中藥已得到了廣泛的重視和開(kāi)發(fā)。如半楓荷散、中藥巴布劑、半楓荷類(lèi)注射液、苗嶺骨力膠囊等[5,6]。

由于半楓荷對(duì)生態(tài)環(huán)境的要求比較苛刻，其自然繁殖率較低，加上人們長(zhǎng)期的過(guò)量采挖，野生資源已經(jīng)極度枯竭。面對(duì)這樣嚴(yán)峻的形勢(shì)，對(duì)半楓荷的人工繁殖問(wèn)題的研究是極為重要的。植物組織無(wú)菌培養(yǎng)方法是尋求解決半楓荷資源枯竭、保護(hù)其優(yōu)良品種的有效途徑。近年來(lái)，人們對(duì)半楓荷的藥用成分及價(jià)值的研究日益增多[7-9]，目前對(duì)半楓荷進(jìn)行完整過(guò)程的組培育苗研究還未見(jiàn)報(bào)道，組培無(wú)菌培養(yǎng)快速繁殖方面多以莖段和葉片為外植體誘導(dǎo)。

植物的組織培養(yǎng)指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細(xì)胞、原生質(zhì)體等，通過(guò)無(wú)菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。不同植物在離體培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)基本培養(yǎng)基類(lèi)型、激素配比、培養(yǎng)條件等要求不同。目前利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)在開(kāi)展植物種質(zhì)資源保護(hù)和生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)苗木等方面技術(shù)已日趨完善。現(xiàn)有技術(shù)大部分是以半楓荷葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷，通過(guò)愈傷組織增殖，在誘導(dǎo)愈傷組織分化成芽，且未誘導(dǎo)出不定根。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料取自福建三明沙縣、福建漳州南靖、江西贛州新余、江西贛州全南縣4個(gè)不同種源的半楓荷。

1.2 培養(yǎng)條件

芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分：改良MS培養(yǎng)基、6-BA 1.5～2.5 mg/L、NAA 0.2～0.4 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠6.7 g/L，pH值5.8～6.0；芽增殖培養(yǎng)基成分：改良MS培養(yǎng)基、6-BA 0.4～0.8 mg/L、NAA 0.05～0.15 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠6.7 g/L，pH值5.8～6.0；生根培養(yǎng)基成分：改良MS培養(yǎng)基、IBA 0.4～0.8 mg/L、NAA 0.1～0.3 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠6.7 g/L，pH值5.8～6.0；MS培養(yǎng)基、改良MS培養(yǎng)基、1/2改良MS培養(yǎng)基組成如表1、2、3所示。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 半楓荷優(yōu)良種源確定

分別檢測(cè)取自福建三明沙縣、福建漳州南靖、江西贛州新余、江西贛州全南縣4個(gè)不同種源的半楓荷的齊墩果酸含量，獲得優(yōu)良種源——江西贛州全南縣半楓荷和福建三明沙縣半楓荷，以此優(yōu)良種源開(kāi)展后續(xù)的組培研究，見(jiàn)圖1。

1.3.2 無(wú)菌材料的建立

取半楓荷的當(dāng)年生枝條為外植體。在合適時(shí)間，一般最優(yōu)時(shí)間為連續(xù)晴天7 d后于12：00 AM～2∶00 PM取材，并將此優(yōu)良母株當(dāng)年生枝條為外植體。對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理獲得無(wú)菌材料，首先將其用洗潔精清洗并浸泡10 min，再用流動(dòng)水沖洗30 min后，置于無(wú)菌操作臺(tái)上，剪成帶有1～2個(gè)節(jié)間的莖段。將莖段用75%的乙醇處理25 s，再用0.1%升汞溶液浸泡處理10 min，期間不斷震蕩，最后用無(wú)菌水徹底清洗6遍，備用。

表1 MS組分

表2 改良MS組分

1.3.3 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將無(wú)菌材料接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度為25～27℃、光照強(qiáng)度為3 000～5 000 lx、光照時(shí)間為8～12 h/d的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)出不定芽觀察并記錄芽的長(zhǎng)勢(shì)，14 d后測(cè)量腋芽的高度，計(jì)算芽的誘導(dǎo)率。觀察記錄完成后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

表3 1/2改良MS組分

圖1 半楓荷優(yōu)良母株

1.3.4 半楓荷組織培養(yǎng)的芽增殖與生根

將誘導(dǎo)培養(yǎng)出的不定芽轉(zhuǎn)接至芽增殖培養(yǎng)基中，在溫度為25～27℃、光照強(qiáng)度為3 000～5 000 lx、光照時(shí)間為8～12 h/d的條件下，觀察記錄新芽的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)。將生長(zhǎng)狀況良好、長(zhǎng)度為2～3 cm的不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，溫度為25～27℃、光照強(qiáng)度為3 000～5 000 lx、光照時(shí)間為8～12 h/d。觀察并記錄生根時(shí)間、根的長(zhǎng)度，計(jì)算生根率。

1.3.5 移栽大田

將生根瓶苗轉(zhuǎn)至移栽大棚進(jìn)行煉苗。7 d后將其從瓶中小心取出，洗凈根部培養(yǎng)基后，用0.1%代森錳鋅浸泡處理2～3 min后，在陰涼處干燥，待植株枝干上的水分陰干的差不多時(shí)，移栽入事先已用0.1%高錳酸鉀消毒的基質(zhì)（泥炭土∶草炭∶珍珠巖為9∶6∶1）中。移栽后做好田間濕度管理，最后觀察記錄并計(jì)算成活率。

1.3.6 優(yōu)化組培配方

在以莖段為外植體的組培快繁過(guò)程中，改良MS培養(yǎng)基中的大量元素NH4NO3、KNO3的濃度，具體變化見(jiàn)表2、表3。并且在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、芽增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中調(diào)整激素濃度，添加稀土元素，增加Vc控制褐化，達(dá)到理想的增殖率、生根率。

1.3.7 計(jì)算方法

誘導(dǎo)率（%）=外植體起動(dòng)個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)× 100%；

增殖系數(shù)=現(xiàn)有不定芽數(shù)/接種不定芽數(shù)×100%；

生根率（%）=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%；

成活率（%）=（成活株數(shù)／接種株數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 半楓荷不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將無(wú)菌材料接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在合適的溫度、光照強(qiáng)度、光照時(shí)間條件下，培養(yǎng)14 d后誘導(dǎo)出了2～3 cm的不定芽，經(jīng)過(guò)計(jì)算得到誘導(dǎo)率為70%。

2.2 芽增殖與生根

將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。約7 d后可見(jiàn)不定芽與培養(yǎng)基接觸的地方冒出新的芽點(diǎn)，28 d后統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)為5.62%，葉片顏色正常，瓶苗生長(zhǎng)狀況良好，如圖2和圖3所示。將不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，5 d后可見(jiàn)其莖段末端切口處冒出白色根原基，繼續(xù)培養(yǎng)14 d后長(zhǎng)成2～3 cm的根，如圖4所示。計(jì)算得到此時(shí)的生根率達(dá)到98.7%。

2.3 生根瓶苗移栽大田研究

將生根瓶苗轉(zhuǎn)至移栽大棚，如圖2所示進(jìn)行穴盤(pán)移栽，在合適的溫度、濕度等條件的控制下，最終移栽成活率達(dá)到94.2%，得到半楓荷移栽苗木，見(jiàn)圖3。

2.4 組織培養(yǎng)優(yōu)化

以當(dāng)年生半楓荷莖段為外植體，通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基成分中的大量元素和激素濃度，添加稀土元素，增加Vc控制褐化，最終達(dá)到理想的增殖率3～4倍，生根率穩(wěn)定在95%以上，移栽成活率達(dá)到95%以上。

3 討論與結(jié)論

圖2 半楓荷穴盤(pán)移栽

圖3 半楓荷移栽苗木

圖4 半楓荷不定芽生根結(jié)果

利用優(yōu)良種源的當(dāng)年生半楓荷的莖段作為外植體，能直接誘導(dǎo)出芽，芽再增殖生根，這是木本植物快繁的主要途徑，生物學(xué)特性比較穩(wěn)定[9,10]。而本研究在莖段為外植體，直接誘導(dǎo)不定叢生芽，避免了現(xiàn)有技術(shù)中用愈傷分化叢生芽易出現(xiàn)變異的情況，再通過(guò)不定叢生芽的增殖、生根培養(yǎng)、組培苗的馴化移栽、組培成分優(yōu)化，最后建立起半楓荷完整的快速繁殖體系，并能夠很好地保持原品種特征。并且通過(guò)改變MS培養(yǎng)基中的大量元素NH4NO3、KNO3的濃度，在培養(yǎng)基中調(diào)整激素濃度，添加稀土元素，增加Vc控制褐化，達(dá)到理想的增殖率，生根率。

本研究的誘導(dǎo)率是用莖段誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率，全南縣來(lái)源的半楓荷的誘導(dǎo)率可以達(dá)到70%的水平，并且通過(guò)不定從芽的增殖，其增殖系數(shù)高達(dá)5.62，并且生根率和移栽成活率均較高，分別達(dá)到了98.7%和94.2%。對(duì)于沙縣來(lái)源的半楓荷進(jìn)行了相同的操作流程，組培成分改進(jìn)優(yōu)化后，其增殖系數(shù)超過(guò)預(yù)期目標(biāo)的3～4倍，生根率和移栽成活率均超過(guò)了95%。因此，利用此方法可以簡(jiǎn)單的、高效的培育出大量的半楓荷組培苗，從而有效地保護(hù)和繁殖該物種。

同時(shí)，本研究是依據(jù)供試材料取自福建三明沙縣、福建漳州南靖、江西贛州新余、江西贛州全南縣4個(gè)不同種源的半楓荷。重點(diǎn)對(duì)于江西贛州全南縣以及福建三明沙縣來(lái)源的半楓荷進(jìn)行試驗(yàn)觀測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表現(xiàn)出優(yōu)秀的增殖系數(shù)、生根率以及成活率，具一定的普適性，對(duì)生產(chǎn)有更強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

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