孫姍姍, 高亞輝, 陳俊德

1.廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建 廈門(mén) 361005; 2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所, 國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心, 福建 廈門(mén) 361005

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膠原蛋白肽金屬螯合物及其生產(chǎn)制備工藝的研究進(jìn)展

孫姍姍1,2, 高亞輝1, 陳俊德2*

1.廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建 廈門(mén) 361005; 2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所, 國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心, 福建 廈門(mén) 361005

膠原蛋白肽金屬螯合物是膠原蛋白肽與金屬離子通過(guò)配位共價(jià)結(jié)合或吸附結(jié)合方式形成的螯合物。該螯合物作為金屬礦物元素補(bǔ)充劑，具有生物利用率高、安全性高、生物活性高等優(yōu)點(diǎn)。綜述了膠原蛋白肽金屬螯合物的螯合機(jī)理、穩(wěn)定性、吸收利用、功能活性和生產(chǎn)制備工藝并展望了其開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，以期為相關(guān)研究提供參考。

膠原蛋白肽金屬螯合物；螯合機(jī)理；生物活性；生產(chǎn)制備工藝

隨著社會(huì)的快速發(fā)展，受膳食結(jié)構(gòu)、生活環(huán)境、生活習(xí)慣等多種因素的影響，人們普遍存在缺乏鈣、鎂、鋅、銅、鐵等金屬礦物元素的現(xiàn)象[1]。這些金屬礦物元素存在于人體組織和體液中，不僅作為人體內(nèi)酶反應(yīng)的活化劑，而且是人體各種代謝功能中的調(diào)節(jié)劑，具有明顯的營(yíng)養(yǎng)作用和生理功能[2]。膳食金屬礦物元素的缺乏會(huì)導(dǎo)致多種疾病[3～5]，例如，缺鐵會(huì)引起小細(xì)胞低色素性貧血、體力活動(dòng)和耐力受損、兒童認(rèn)知障礙[6,7]；缺鈣可能會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的代謝、骨骼生長(zhǎng)、凝血、神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮和心臟功能有影響，同時(shí)，會(huì)增加骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)[8]；鋅缺乏可能會(huì)引起侏儒病、皮炎、生長(zhǎng)智力發(fā)育不正常、厭食癥等[9]；缺銅會(huì)導(dǎo)致貧血、骨骼改變、冠心病等[10]。為此，營(yíng)養(yǎng)學(xué)家建議消費(fèi)者在日常飲食中應(yīng)選擇富含金屬礦物元素的食物[2]。因而，開(kāi)發(fā)適宜的金屬礦物元素補(bǔ)充劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

市售的金屬礦物元素補(bǔ)充劑有三個(gè)發(fā)展階段：無(wú)機(jī)礦物質(zhì)添加劑、有機(jī)礦物質(zhì)添加劑、蛋白肽(氨基酸)金屬礦物元素螯合物。前兩種礦物質(zhì)補(bǔ)充劑雖能在一定程度上補(bǔ)充人體所需的金屬礦物元素，但會(huì)與胃酸或者食物中的草酸結(jié)合形成沉淀，進(jìn)而阻礙吸收；而有些則具有較強(qiáng)的堿性，會(huì)對(duì)人體的胃腸道產(chǎn)生較大的刺激。由于這兩種礦物質(zhì)補(bǔ)充劑具有較大的毒副作用，且在人體內(nèi)的吸收利用效率低下[10]，故開(kāi)發(fā)高效無(wú)毒的第三代蛋白肽金屬螯合物礦物元素補(bǔ)充劑成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。膠原蛋白中存在很多潛在的具有生物活性的肽段[11,12]，低分子量的膠原蛋白肽容易被人體吸收，且具有顯著地與二價(jià)金屬礦物離子(如鈣離子、鐵離子、銅離子)結(jié)合的能力[13]，其分子結(jié)構(gòu)中的氨基、羧基、羥基、弧基等側(cè)基在不同條件下可以與金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)，形成穩(wěn)定的螯合物[3～5]。形成的螯合物同時(shí)具有金屬礦物質(zhì)和膠原蛋白肽的功能[10]，進(jìn)入人體時(shí)，不受食物以及胃腸道環(huán)境的影響，可以直接通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞奖蝗梭w吸收，提高了金屬礦物元素的吸收利用效率[10]。因而，膠原蛋白肽金屬螯合物具有生物效價(jià)高、吸收快、營(yíng)養(yǎng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景巨大。本文擬從膠原蛋白肽金屬螯合物的螯合機(jī)理、特性及其生產(chǎn)制備工藝等方面進(jìn)行討論，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 膠原蛋白肽金屬螯合物的螯合機(jī)理及特性

1.1 螯合機(jī)理

膠原蛋白肽金屬螯合物的螯合方式主要為配位共價(jià)結(jié)合和吸附結(jié)合。膠原蛋白肽鏈上氨基酸的基團(tuán)類型是影響螯合物配位共價(jià)結(jié)合的重要因素。膠原蛋白肽鏈氨基酸的氰基、羰基、氨基、羧基、羰基、羥基、巰基和亞氨基與鈣離子(Ca2+)、銅離子(Cu2+)、錳離子(Mn2+)和鋅離子(Zn2+)結(jié)合形成離子鍵或配位鍵，緩解金屬礦物離子之間的拮抗作用，可確保螯合物的穩(wěn)定性[14～18]。膠原蛋白肽鏈氨基酸序列也是影響螯合物配位共價(jià)結(jié)合的主要因素。膠原蛋白肽 GPAGPHGPPG和Ca2+、Fe2+和Cu2+的螯合能力分別為 11.52±2.23 nmol/μmol、1.71±0.17 nmol/μmol 和 0.43±0.02 μmol/μmol[4]；GPYGPFGPWG和Zn2+的螯合能力為 56.74 μg/mg[19]；GKTGWPG和Zn2+的螯合能力為 83.56 μg/mg[20]；AGPAGPK與Ca2+的螯合能力為0.88±0.02 μg/mg[21]。此外，氯化鈣晶粒能夠通過(guò)吸附作用“嵌入”膠原蛋白肽的表面，形成膠原蛋白肽鈣螯合物[15,22～23]。

1.2 穩(wěn)定性

膠原蛋白肽的相對(duì)分子質(zhì)量是影響螯合物穩(wěn)定性的重要因素。蛋白肽和金屬的螯合能力與肽的分子量之間存在線性關(guān)系，隨著蛋白肽分子量的降低,螯合能力提高[24]，但當(dāng)?shù)鞍纂牡姆肿恿拷档偷揭欢ǔ潭群?，螯合物不穩(wěn)定[25]。膠原蛋白肽的氨基酸殘基、肽鏈氨基酸序列及空間立體結(jié)構(gòu)亦是影響膠原蛋白肽金屬螯合物穩(wěn)定性的重要因素[26,27]。膠原蛋白肽的半胱氨酸(Cys)殘基、組氨酸(His)殘基、天冬氨酸(Asp)殘基和谷氨酸(Glu)殘基有助于提高膠原蛋白肽金屬螯合物的穩(wěn)定性[26,28～30]。而對(duì)于鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽金屬螯合物，肽鏈氨基酸序列是影響其穩(wěn)定性的首要因素，空間立體結(jié)構(gòu)是次要因素[21]。

1.3 吸收利用

人體內(nèi)存在著獨(dú)立的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、耗能低、不易飽和等特點(diǎn)。當(dāng)金屬礦物離子和膠原蛋白肽螯合后，通過(guò)抑制刷狀緣上肽酶的水解活性，防止肽的水解，肽作為金屬礦物元素的配體，通過(guò)肽轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入粘膜細(xì)胞。膠原蛋白肽金屬螯合物以螯合態(tài)經(jīng)過(guò)胃及小腸，不但能夠被人體快速吸收，而且能夠降低螯合物之間的金屬礦物質(zhì)的拮抗作用，提高其吸收利用率[31]。研究表明，肽金屬螯合物的吸收率可高達(dá)90%以上，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)金屬礦物元素補(bǔ)充劑[32]。在膠原蛋白肽金屬螯合物的利用方面，膠原蛋白肽鈣螯合物的股骨鈣含量、股骨指數(shù)、鈣表觀吸收率、鈣保留率、提高骨密度能力、提高骨強(qiáng)度能力均高于傳統(tǒng)的碳酸鈣補(bǔ)充劑[10,33～34]。

1.4 功能活性

膠原蛋白肽金屬螯合物具有多種功能活性。膠原蛋白肽-鉻(Ⅲ)螯合物可以顯著地降低血糖、增加肝糖原的合成并提高葡萄糖激酶的活性[35, 36]，還能夠顯著提高小鼠肝臟內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)[37]。膠原蛋白肽鐵螯合物具有較強(qiáng)的清除二苯基苦酰肼基自由基(DPPH)和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+)自由基的能力[38]。膠原蛋白肽-鋅螯合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抗菌活性，其抗菌活性優(yōu)于其他類型的螯合物，且可隨著鋅含量增加而快速增加[39]。

2 生產(chǎn)制備工藝

膠原蛋白肽金屬螯合物的生產(chǎn)制備工藝主要采用水相合成技術(shù)和固相合成技術(shù)。

2.1 水相合成技術(shù)

膠原蛋白肽金屬螯合物的水相合成技術(shù)是指膠原蛋白肽和金屬離子在溶液中，以離子態(tài)或者適當(dāng)?shù)碾娮优帕邪l(fā)生螯合，在配體與金屬離子之間形成配位鍵和(或)離子鍵，得到膠原蛋白肽金屬螯合物[40]。水相合成技術(shù)是在膠原蛋白肽金屬螯合物生產(chǎn)制備中最常用的方法。研究表明，利用水相合成技術(shù)生產(chǎn)制備金屬螯合物，所發(fā)生反應(yīng)的本質(zhì)是溶液中的游離配體取代金屬離子上配位水分子的過(guò)程。

影響螯合效果的因素主要有pH、原料配比、螯合時(shí)間和螯合溫度等。本課題組在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，pH是影響螯合效果最重要的因素之一[41]。不同類型的膠原蛋白肽和金屬離子螯合反應(yīng)所需的最佳pH不同。當(dāng)反應(yīng)體系的pH偏低時(shí)，反應(yīng)體系中多余的氫離子與金屬離子競(jìng)爭(zhēng)供電子基團(tuán)(即膠原蛋白肽分子)；當(dāng)pH偏高時(shí)，反應(yīng)體系中多余的羥基離子則與膠原蛋白肽分子爭(zhēng)奪電子受體(金屬離子)，從而降低反應(yīng)體系的螯合效率。此外，在螯合過(guò)程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，原料的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生變化，需隨時(shí)調(diào)節(jié)pH，保證反應(yīng)體系處于最佳狀態(tài)，以提高螯合效率。原料配比也是影響螯合效果的重要因素。螯合反應(yīng)需要合適的原料配比(即膠原蛋白肽與無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量之比)，過(guò)低配比會(huì)導(dǎo)致螯合反應(yīng)生成的螯合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，過(guò)高的配比則會(huì)造成配位分子的浪費(fèi)。此外，為了確定螯合的最佳工藝，還需要考察螯合時(shí)間和螯合溫度對(duì)螯合效果的影響。目前，考察膠原蛋白肽金屬螯合物的生產(chǎn)制備工藝時(shí)，通常以螯合率為指標(biāo)，pH、原料配比、螯合時(shí)間和螯合溫度為考察因素，利用單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)、中心組合實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)等多種分析方法確定膠原蛋白肽金屬螯合物的最佳螯合工藝(表1)。水相合成技術(shù)因其工藝簡(jiǎn)單、成本低，成為膠原蛋白肽金屬螯合物生產(chǎn)制備的主要方法。然而，該方法在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生大量的鹽類，影響其產(chǎn)品的附加值。為了提高膠原蛋白肽金屬螯合物的產(chǎn)品質(zhì)量和附加值，根據(jù)其產(chǎn)品特性，將目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)蛋白質(zhì)、活性肽及其衍生物的關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)用到螯合物的生產(chǎn)制備上是十分必要的。如構(gòu)建連續(xù)流離心、多級(jí)膜分離協(xié)同快速干燥集成工藝技術(shù)、規(guī)?；蛛x純化，得到分子量集中的膠原蛋白肽金屬螯合物；利用離子色譜、反相色譜等層析技術(shù)分離純化，得到高附加值的膠原蛋白肽金屬螯合物單體。

表1 多種分析方法確定的最佳螯合條件

除常規(guī)的水相合成技術(shù)外，磷酸化技術(shù)、硫醇化技術(shù)、超聲技術(shù)也被應(yīng)用到膠原蛋白肽螯合物的水相合成技術(shù)中。研究表明，與未磷酸化的類人膠原蛋白肽相比，磷酸化后的類人膠原蛋白肽與鐵離子螯合，在結(jié)合位點(diǎn)和表觀吸附常數(shù)上都顯著增加[45]；磷酸化后膠原蛋白肽螯合鈣的螯合率遠(yuǎn)高于普通膠原蛋白肽螯合鈣，吸收率遠(yuǎn)高于氯化鈣和葡萄糖酸鈣[46,47]。而硫醇化后的類人膠原蛋白，能提供更多的羰基、巰基基團(tuán)與鋅離子結(jié)合，與類人膠原蛋白相比，硫醇化類人膠原蛋白熱力學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，具有更好的生物相容性[48]。超聲波的空化作用可以產(chǎn)生微沖流，能有效打破邊界層，加快反應(yīng)物的反應(yīng)速度，提高膠原蛋白肽和金屬離子的螯合率[49]。采用超聲技術(shù)制備魚(yú)膠原蛋白肽螯合鋅，螯合率可高達(dá)96.07%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的水相合成技術(shù)[50]。與傳統(tǒng)的水相合成技術(shù)相比，超聲技術(shù)具有反應(yīng)時(shí)間短、螯合率高等特點(diǎn)。但該技術(shù)在規(guī)模化生產(chǎn)時(shí)，對(duì)廠房的安全措施、操作人員的安全意識(shí)要求較高。

2.2 固相合成技術(shù)

膠原蛋白肽金屬螯合物的固相合成技術(shù)是指將固態(tài)膠原蛋白肽和含金屬礦物元素的無(wú)機(jī)鹽混合，經(jīng)過(guò)螯合反應(yīng)得到螯合物。水相合成技術(shù)主要用于制備生產(chǎn)溶解性良好的膠原蛋白肽金屬螯合物，對(duì)于溶解性差和不溶的螯合物卻無(wú)能為力。為解決水相合成技術(shù)在生產(chǎn)上的不足，開(kāi)發(fā)了固相合成技術(shù)，用于制備生產(chǎn)溶解性差和不溶的膠原蛋白肽金屬螯合物[51]。然而，傳統(tǒng)的固相合成技術(shù)存在的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低等缺點(diǎn)，影響其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，使得微波固相合成技術(shù)生產(chǎn)制備溶解性差和不溶的膠原蛋白肽金屬螯合物成為研究的熱點(diǎn)。

膠原蛋白肽與金屬離子的配比是影響微波固相合成螯合效果的關(guān)鍵因素。配比過(guò)低，合成反應(yīng)生成的螯合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易降解；配比過(guò)高，導(dǎo)致螯合能力降低，生產(chǎn)成本增加。此外，微波輻射時(shí)間、微波合成功率、引發(fā)劑和脫酸劑的選擇、反應(yīng)物粒度等都會(huì)影響微波固相合成的螯合效果。如微波輻射時(shí)間過(guò)短，膠原蛋白肽金屬螯合物的螯合率較低；若輻射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則易造成反應(yīng)體系溫度過(guò)高，熱量無(wú)法快速釋放，導(dǎo)致螯合物分解。因此，需加快微波固相合成的生產(chǎn)制備工藝技術(shù)的研發(fā)工作，以期生產(chǎn)出高質(zhì)量、高附加值、低成本的螯合物產(chǎn)品[51,52]。如采用微波固相合成技術(shù)合成鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽鋅螯合物，確定最佳反應(yīng)條件為：微波時(shí)間105 s，微波功率252 W，膠原蛋白肽和硫酸鋅質(zhì)量比3∶1，合成的鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽鋅螯合物的螯合率為29.34%[53]；采用微波固相合成技術(shù)，制備真鯛魚(yú)膠原蛋白肽-鉻(Ⅲ)螯合物，確定最佳螯合條件為，微波功率為100 W，微波反應(yīng)時(shí)間為5 min，配體與鉻離子(Ⅲ)的摩爾比為1∶1[54]。微波固相合成技術(shù)具有縮短反應(yīng)時(shí)間、提高原料的利用效率、減少能耗、減少?gòu)U液排放等優(yōu)點(diǎn), 但該技術(shù)方法在規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)時(shí)需要制定嚴(yán)格的安全防護(hù)措施。

3 展望

近年來(lái)，營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑已經(jīng)成為我國(guó)保健品領(lǐng)域的最快增長(zhǎng)點(diǎn)之一，其市場(chǎng)需求呈快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。如此巨大的市場(chǎng)催生了大量的產(chǎn)品。隨著競(jìng)爭(zhēng)的加劇和廣大消費(fèi)者對(duì)保健產(chǎn)品認(rèn)識(shí)的不斷提高，高安全性、高生物利用度的膠原蛋白肽金屬螯合物營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑深受消費(fèi)者的青睞，具有巨大的市場(chǎng)前景。然而，與美國(guó)、西歐等發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)的膠原蛋白肽金屬螯合物營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑行業(yè)尚處于初級(jí)階段，行業(yè)集中度不高，產(chǎn)品同質(zhì)化現(xiàn)象嚴(yán)重。造成該現(xiàn)象的原因在于：一方面，雖然我國(guó)高校、研究所在膠原蛋白肽金屬螯合物的機(jī)理、穩(wěn)定性、吸收利用和功能活性方面取得了豐碩的研究成果，然而，科研工作者對(duì)市場(chǎng)需求不甚了解，難以突破膠原蛋白肽金屬螯合物行業(yè)存在的實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸；另一方面，我國(guó)企業(yè)家以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，在膠原蛋白肽金屬螯合物生產(chǎn)制備工藝研究方面做了大量的工作，但由于缺乏基礎(chǔ)理論支撐，開(kāi)發(fā)高質(zhì)量、高附加值的產(chǎn)品困難重重。因此，急需建立科研院所、高校和企業(yè)為主要支撐的產(chǎn)業(yè)技術(shù)聯(lián)盟，發(fā)揮科研院所、高校和企業(yè)相互聯(lián)合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的作用，將膠原蛋白肽金屬螯合物的理論研究和生產(chǎn)制備工藝與規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)相結(jié)合，以期研發(fā)一批具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的產(chǎn)品，進(jìn)而帶動(dòng)我國(guó)營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑保健品產(chǎn)品集群的形成。

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Progress of Collagen Peptide Metal Chelates and Related Production Technologies

SUN Shanshan1,2, GAO Yahui1, CHEN Junde2*

1.SchoolofLifeSciences,XiamenUniversity,FujianXiamen361005,China; 2.MarineBiologicalResourceComprehensiveUtilizationEngineeringResearchCenteroftheStateOceanicAdministration,theThirdInstituteofOceanographyoftheStateOceanicAdministration,FujianXiamen361005,China

Collagenpeptidemetalchelatesareformedbycollagenpeptidesandmetalionsthroughcoordinatecovalentbondingoradsorptionbinding.Theyhavebeenconsideredasthepotentialapproachtodeliveringmetalmineralelementstoconsumerswithmanyvirtues,suchashigherbioavailability,highersafetyandhigherbioactivity.Chelatemechanism,stability,absorptionandutilization,functionalactivityandproductiontechnologiesofcollagenmetalchelateswerereviewedandthedevelopmentprospectwerealsoforeseeninthispaper,whichwasexpectedtoprovidereferenceforrelatedreasearches.

collagenpeptidemetalchelates;chelatemechanism;functionalactivity;productiontechnologies

2017-04-07; 接受日期：2017-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41106149；41676129)資助。

孫姍姍，碩士研究生，主要從事蛋白工程研究。E-mail: shshsun123@163.com。*通信作者：陳俊德，副研究員，主要從事蛋白工程研究。E-mail:jdchen@tio.org.cn

10.19586/j.2095-2341.2017.0024