李君，孫淑軍，王洋，劉才峰，仲興陽，徐峰，蔡志剛，張永煜，4＊＊

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院上海200438；2.上海交通大學(xué)藥學(xué)院上海200240；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)方證與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心上海201203；4.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)傣醫(yī)藥學(xué)院西雙版納600100；5.上海通微分析技術(shù)有限公司上海201203；6.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院上海201203）

29例肝細胞肝癌患者的腫瘤組織代謝組學(xué)研究＊

李君1，孫淑軍2，5，王洋3，劉才峰1，仲興陽1，徐峰1，蔡志剛6，張永煜3，4＊＊

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院上海200438；2.上海交通大學(xué)藥學(xué)院上海200240；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)方證與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心上海201203；4.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)傣醫(yī)藥學(xué)院西雙版納600100；5.上海通微分析技術(shù)有限公司上海201203；6.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院上海201203）

目的：運用組織代謝組學(xué)方法，探討肝細胞肝癌的發(fā)病機制與治療策略。方法：采用GC-MS分析肝細胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）患者癌組織和癌旁組織中的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物，進行單維和多維統(tǒng)計分析，尋找差異代謝物。通過KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫檢索和分析，獲得相關(guān)代謝通路。結(jié)果：經(jīng)PCA、PLS-DA分析得知癌組織和癌旁組織的代謝輪廓具有顯著性差異，經(jīng)OPLS-Loading plot分析尋找到25個差異性代謝產(chǎn)物，與之相關(guān)代謝通路有36條，多屬于糖代謝、氨基酸代謝和線粒體轉(zhuǎn)移代謝。25個差異物中ROC曲線下面積大于0.8的差異物有16個，經(jīng)分析該16個差異物與三磷酸腺苷結(jié)合盒（ATP-binding Cassette，ABC）轉(zhuǎn)運體代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸代謝有關(guān)。結(jié)論：肝癌組織細胞中存在沃伯格效應(yīng)（Warburg effect），即糖酵解異常增強，三羧酸循環(huán)減弱。線粒體轉(zhuǎn)運功能異常、鈷含量的升高，均可能與Warburg effect相關(guān)。能量代謝異常是肝癌的發(fā)病機制之一，阻斷相關(guān)代謝通路有望成為靶向治療的新途徑。

肝細胞肝癌腫瘤組織代謝組學(xué)沃伯格效應(yīng)

肝細胞肝癌（HCC）是一種常見的腹內(nèi)惡性腫瘤，在原發(fā)性肝癌中占比高達91.5%，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率、死亡率分別居惡性腫瘤排名的第5位、第3位，其5年生存率不到7%[1]。近幾年，中國肝癌發(fā)病人數(shù)約占全球肝癌患者的55%，其死亡率排在腫瘤疾病第2位，對中國人民生命健康造成嚴重威脅。目前，全世界約有3.5-4億的乙肝攜帶者，據(jù)估計50%的男性和14%的女性攜帶者最終會死于乙肝導(dǎo)致的肝硬化或肝癌[2]。然而，肝癌的發(fā)病機制仍然不十分明確[3,4]。研究者們曾在抗體[5,6]、細胞因子[7]和生化指標[8]等方面尋找與癌變相關(guān)的指標，但目前真正有價值并運用于臨床的極少。同時，中藥干預(yù)或介入的治療研究也越來越多，如復(fù)方苦參注射液[9]、華蟾素注射液[10]等分別聯(lián)合化療治療原發(fā)性肝癌，發(fā)現(xiàn)療效更優(yōu)。為了尋找更好的治療方式，HCC疾病的發(fā)病機制還有待進一步研究。

近年來，用組學(xué)技術(shù)來研究發(fā)病及病程機制的報道逐漸增多，包括基因組學(xué)、MicroRNA組學(xué)[11]、蛋白組學(xué)[12]、代謝組學(xué)[13]等。其中，代謝組學(xué)能夠跟蹤檢測代謝物之間的相互轉(zhuǎn)化與含量水平變化，這些信息與病理生理過程中的生物化學(xué)以及生理功能改變聯(lián)系起來可以作為潛在靶標和作用位點，進而確定相關(guān)的生物標志物[1]。與基因組學(xué)和蛋白組學(xué)等其他組學(xué)技術(shù)相比較，代謝組學(xué)可以展現(xiàn)其優(yōu)勢：①代謝組反應(yīng)基因和蛋白層面綜合作用下的最終結(jié)果，而基因和蛋白的微弱變化在代謝組中具有“延增效應(yīng)”[14]；②機體中小分子化合物的組成相對簡單，更容易闡釋其生物學(xué)功能；③代謝組的數(shù)據(jù)分析可通過KEGG或HMDB等數(shù)據(jù)庫進行輔助。目前已有不少研究者利用代謝組學(xué)方法對HCC的發(fā)病機制或早期診斷指標進行研究：Yin等[15]利用代謝組學(xué)技術(shù)尋找了血清中的HCC生物標志物；Patterson等[16]利用UPLC-ESI-QTOF/MS、UPLC-ESITOM/MS和GC-MS三種分析技術(shù)進行血漿脂類代謝物定量分析，尋找了HCC患者血漿中的潛在生物標記物；Shariff等[17]嘗試用尿液代謝標志物診斷HCC。上述多數(shù)研究均使用血液和尿液等的樣本，采用組織作為樣本的研究較少，例如王紅陽等[18]利用HCC患者的癌組織及其癌旁組織樣本，采用UPLC-MS聯(lián)用技術(shù)研究了HCC患者癌變組織的特異性代謝產(chǎn)物。然而值得注意的是，目前國內(nèi)采用GC-MS技術(shù)進行HCC組織代謝組學(xué)的研究卻鮮有報道。

本研究旨在采用組織代謝學(xué)技術(shù)研究肝細胞肝癌的發(fā)病機制，并探討其治療策略。具體將采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，對29例HCC患者肝癌組織進行代謝組學(xué)研究，找尋差異性代謝物及相關(guān)代謝通路，并初步探討HCC的發(fā)病機制與潛在的治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 6890/5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent科技有限公司）；DB-5 MS氣相毛細管色譜柱（美國Agilent科技有限公司）；Vortex-Genie 2微型漩渦混合器（美國Scientific Industries公司）；SBH 130D/3樣品濃縮儀（英國Stuart公司）；Centrifuge 5415R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Milli-Q Gradient超純水系統(tǒng)（美國Millipore中國有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SX-1型箱式電阻爐（上海樹立儀器儀表有限公司）；烘箱（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）；U9260-020低溫冷凍冰箱（英國）。

N-O-雙（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA，含1% TMCS，美國Sigma-Aldrich公司，批號：LC00975）；甲氧胺（美國Sigma-Aldrich公司，批號：2097987）；L-2-氯苯丙氨酸（美國Sigma-Aldrich公司，批號：060507）；十七酸（美國Sigma-Aldrich公司，批號：H3500）；甲醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：80080418）；氯仿（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：10006818）。

1.2 實驗對象與準入條件

本研究所使用樣本為病理診斷為肝細胞肝癌患者的癌組織和癌旁組織，共計29例，由第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院所采集。同時收集了入組患者的臨床信息，包括性別、年齡、術(shù)前血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Ala?nine Aminotransferase，ALT）、血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（As?partate Aminotransferase，AST）、血清甲胎蛋白（Alphafetoprotein，AFP）含量及腫瘤體積等信息。所有入組患者均自愿參加本試驗，并簽署知情同意書。另外，本研究的剔除標準包括：①除伴有乙型肝炎以外其他類型肝炎的肝細胞肝癌患者；②重癥患者；③并發(fā)糖尿病等代謝性疾病患者。

1.3 標本采集與處理

1.3.1 標本采集

標本離體后，先觀察腫瘤的部位、范圍，注意與周邊正常組織相鑒別，時間約5-10 min。將癌腫、癌旁組織切成3-5塊、直徑約0.3-0.5 cm的組織塊，去除表面淤血，裝入已編號的凍存管中，并迅速投入液氮罐內(nèi)低溫保存、備用。記錄下患者基本信息、組織采集時間及腫瘤大小。

1.3.2 組織樣本前處理

用生理鹽水洗凈、擦干后，于精密天平稱重50 mg腫瘤組織；加入3倍量生理鹽水，勻漿后加500 μL甲醇，渦旋1 min，放入-20℃冰箱放置10 min，沉淀蛋白。經(jīng)12 000 r?min-1，4℃離心10 min；吸取上清200 μL于進樣瓶中，室溫下氮氣流吹干；加入15 mg·mL-1甲氧胺（吡啶溶劑）80μL，封蓋密封后，振蕩30 s；在30℃下?lián)u床（250 rpm）中反應(yīng)90 min進行甲氧胺對羰基的封閉反應(yīng)；加入80μL的BSFTA（含1%TMCS），振蕩30 s，在70℃的烘箱里反應(yīng)60 min；振蕩10 s，室溫下放置1 h后待GC/MS進樣分析[19]。

1.4 GC-MS分析

取三甲基硅烷衍生血清萃取物樣品1μL進行GC-MS分析。色譜和質(zhì)譜的分析參數(shù)設(shè)置如下：

1.4.1 液相色譜條件

進樣口溫度：270℃；進樣量：1.0μL；不分流進樣，載氣：高純氦（99.999%）；流速：1.0 mL?min-1；接口溫度：260℃；色譜柱：DB-5MS毛細管柱，色譜柱程序升溫進行檢測[20]。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃，溶劑延遲：5 min；電子碰撞電離電壓：70 eV，質(zhì)譜全掃描范圍（m/z）：30-600，采用全掃描方式。

表1 29例患者基本臨床信息

1.5 數(shù)據(jù)處理與模式識別

1.5.1 數(shù)據(jù)前處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Agilent MSD工作站自帶軟件轉(zhuǎn)化為NetCDF格式后，導(dǎo)入R軟件采用XCMS工具箱處理（http://meltin.scripps.edu/download/）。經(jīng)基線校正、峰辨識、峰對齊等計算過程，最終得到一個由指定的峰指數(shù)（保留時間-質(zhì)荷比）、樣品名稱、峰面積組成的三維矩陣表。

1.5.2 模式識別

本研究所采用的線性模式識別技術(shù)一般包括非監(jiān)督分析方法和有監(jiān)督分析方法兩種。三維矩陣經(jīng)過中心化、標準化后導(dǎo)入SIMCA-P11.5軟件（Umetrics,Umea, Sweden）后，采用主成分分析（Principal Component Anal?ysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析法（Partial Least Square-Discriminant Analysis，PLS-DA）進行數(shù)據(jù)處理，用來考察血液樣本總體代謝譜圖分布狀況，以觀察樣品的聚集、離散及離群點。采用正交偏最小二乘法判別分析法（Orthogonal Partial Least Square-Discriminant Analysis，OPLS-DA）來尋找對代謝輪廓貢獻較大的差異變量，即與疾病最相關(guān)的差異變量，權(quán)重系數(shù)VIP值越大，表明對模型的貢獻越大，采用VIP大于1.0為閾值選擇多維統(tǒng)計上的差異變量[21]。

為了驗證多維統(tǒng)計結(jié)果，采用Mann-Whitney U檢驗對所得差異代謝物進行分析，選擇P<0.05的差異物。同時滿足VIP大于1.0和單維統(tǒng)計P<0.05的代謝物被認為是最終差異代謝物。

1.5.3 差異表達代謝物的鑒別

數(shù)據(jù)經(jīng)多維統(tǒng)計后，給出的差異變量，通過檢索代謝物譜庫（NIST庫）找到相對應(yīng)的化合物，并用標準品進行鑒定，從而得到可以區(qū)分兩組動物的差異表達的代謝物。

1.5.4 代謝通路分析

通過KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）和HMDB（http://www.hmdb.ca/）數(shù)據(jù)庫檢索代謝物代謝通路，并通過Metabolites Biological Role（http://csbg.cnb.csic.es/ mbrole/index.jsp）進行分析，確定相關(guān)代謝通路。

2 實驗結(jié)果

2.1 病例基本臨床信息

入組HCC患者29例，其中7例女性，22例男性患者。平均年齡為49.9歲。入組患者的ALT、AST、AFP、腫瘤大小和腫瘤分級信息見表1。

2.2 肝癌患者癌組織與癌旁組織之間代謝模式的比較

采用PCA和PLS-DA法對其癌組織和癌旁組織的代謝輪廓進行比較分析。從圖1可知，HCC患者的癌組織和癌旁組織整體輪廓分別集中在右上區(qū)域和左下區(qū)域，說明癌組織和癌旁組織的代謝圖譜存在差異，即HCC患者的癌組織存在特異性的代謝物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 肝癌患者癌組織與癌旁組織之間差異代謝產(chǎn)物

圖1 HCC患者的癌組織和癌旁組織比較的PCA圖和PLS-DA圖

圖2 HCC患者癌組織與癌旁組織比較的載荷圖

為了獲得HCC癌組織的代謝物質(zhì)基礎(chǔ)，我們將癌組織與癌旁組織比較，進行OPLS分析，其載荷圖（V-plot圖）。如圖2所示，通過多維統(tǒng)計和單維統(tǒng)計，選擇VIP>1.0并且單位統(tǒng)計P<0.05的差異變量，最終篩選找出25個差異峰，經(jīng)鑒定代謝差異物結(jié)果見表2。

2.4 肝癌患者癌組織與癌旁組織之間差異代謝通路分析

將表2中的差異代謝物，輸入KEGG數(shù)據(jù)庫和MBRole數(shù)據(jù)庫進行檢索，找到有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）的相關(guān)代謝通路（表3）。HCC患者癌組織與癌旁組織代謝途徑比較，共找到了33條相關(guān)的代謝通路。

2.5 肝癌患者癌組織與癌旁組織之間差異性代謝物的ROC分析

用以上差異性代謝物的峰值繪制ROC曲線，并求得ROC曲線下面積，篩選出ROC曲線下面積≥0.8的16個差異性代謝物（圖3、表4）。

表2 HCC患者癌組織與癌旁組織比較所得代謝差異物列表

圖3 16個顯著差異性代謝物的ROC曲線圖

將16個ROC曲線下面積≥0.8的差異代謝物進行KEGG數(shù)據(jù)庫和MBRole數(shù)據(jù)庫檢索，找到有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）的相關(guān)代謝通路。結(jié)果顯示，ABC trans?porters、Galactose metabolism、Amino sugar and nucleotide sugar metabolism這三條代謝通路具顯著性差異物。說明HCC患者癌組織和癌旁組織之間存在顯著性差異的代謝通路為ABC轉(zhuǎn)運體代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸代謝。

表3 相關(guān)代謝通路及信息列表

3 討論

本文采用GC-MS技術(shù)對29例HCC患者的癌組織和癌旁組織的代謝輪廓進行了分析，PCA、PLS-DA分析結(jié)果均表明，癌組織和癌旁組織的代謝輪廓具有顯著性差異，經(jīng)OPLS-Loading plot分析尋找到25個差異性代謝產(chǎn)物。將該25個代謝差異物進行Kegg和HM?DB數(shù)據(jù)庫檢索，得與之相關(guān)的代謝通路有36條，其中大多屬于糖代謝、氨基酸代謝和線粒體轉(zhuǎn)移代謝。將以上25個差異物進行ROC分析，發(fā)現(xiàn)ROC曲線下面積不小于0.8的差異物有16個，經(jīng)分析可知：該16個差異物多數(shù)與ABC轉(zhuǎn)運體代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸代謝有關(guān)。

沃伯格[23]發(fā)現(xiàn)健康細胞中的能量來源于線粒體氧化糖類分子，而腫瘤細胞則靠糖酵解作用為自身供能，這種作用機制既不需要氧原子參與也不需要線粒體參與。同時，無論氧原子存在與否，腫瘤組織細胞的糖酵解率是正常組織的200倍[24]。沃伯格認為這種能量方式的變化是癌癥的根本原因。而本研究經(jīng)分析，得知肝癌組織與癌旁組織之間的代謝差異很大程度在于糖代謝和能量代謝。其中糖酵解是一個顯著性差異代謝通路，糖酵解即：1個葡萄糖分子轉(zhuǎn)變?yōu)?個丙酮酸分子[25-27]，同時釋放能量的過程。本研究癌組織中葡萄糖的含量是癌旁組織的0.51倍，而前者的丙酮酸則是后者的2.01倍，足以說明癌組織中糖酵解代謝增強，直接驗證了沃伯格反應(yīng)，即肝癌細胞通過糖酵解釋放的能量為自身供能。假設(shè)沃伯格反應(yīng)在肝癌細胞中是存在的，則肝癌細胞靠糖酵解反應(yīng)為自身供能，而線粒體中的三羧酸循環(huán)代謝減弱。而本研究中顯示三羧酸循環(huán)反應(yīng)確實有顯著性差異，涉及到的三個代謝物，C00022丙酮酸含量上升2.06倍，C00026草酰乙酸含量上升1.88倍，C00036戊二酸降低為0.48倍。其中，丙酮酸是三羧酸循環(huán)代謝的底物，該代謝物含量升高，說明三羧酸循環(huán)反應(yīng)強度降低，即癌細胞能量不需要三羧酸循環(huán)釋放提供，間接證實了沃伯格反應(yīng)。基于腫瘤能量代謝的特性，如何阻斷腫瘤的能量代謝成為目前研究的熱點。丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase，PK）是細胞糖酵解中的限速酶，將底物磷酸烯醇丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）催化生成丙酮酸。有研究[28]認為丙酮酸激酶M2型（Pyruvate Kinase M2，PKM2）是腫瘤組織有氧酵解的關(guān)鍵酶，其在腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。而諸如3-溴丙酮酸[29]、維生素K3、K5[30]及紫草醌類衍生物[31]等一些PKM2阻斷劑能夠有效抑制肝癌、卵巢癌及絨毛膜癌等多種腫瘤細胞的生長。綜上所述，如果能在患者肝癌組織中檢測到丙酮酸的代謝異常，抑制或阻斷PKM2活性或許有望成為一條潛在的靶向治療新途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞多條膜轉(zhuǎn)運及線粒體相關(guān)代謝通路異常，如ABC轉(zhuǎn)運體（ABC transporters）、蘋果酸-天冬氨酸穿梭（Malate-Aspartate Shuttle）、乙?；D(zhuǎn)移到線粒體（Transfer of Acetyl Groups into Mitochon?dria）。癌細胞供能途徑發(fā)生改變，勢必線粒體相關(guān)代謝會出現(xiàn)異常，丁忠陽等通過17例HCC患者肝癌組織及癌旁組織的分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)線粒體D-Loop區(qū)是一個具有高度多態(tài)性和突變性的區(qū)域，在肝癌中突變率較高[32,33]。Mirabella等[34]發(fā)現(xiàn)線粒體中某些mtD?NA的缺失或突變與腫瘤細胞凋亡過程有關(guān)[35]，可影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究中發(fā)現(xiàn)三條異常代謝通路ABC transporters、Malate-Aspartate Shuttle、Transfer of Acetyl Groups into Mitochondria均屬膜轉(zhuǎn)運相關(guān)，膜轉(zhuǎn)運的異常必然會直接影響能量傳遞，這極有可能是肝癌發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)。原發(fā)性肝癌的綜合治療已成為目前的趨勢，許多接受肝癌切除的患者常常需接受化療，而多藥耐藥（Multidrug Resistance，MDR）是化療失敗不可回避的重要原因[36]。如何選擇有效低毒的化療藥物常常是臨床醫(yī)師需要面臨的棘手問題。前文所提及的ABC轉(zhuǎn)運體，是膜轉(zhuǎn)運蛋白家族中的一類特殊蛋白。目前研究認為ABC轉(zhuǎn)運體能夠介導(dǎo)腫瘤的多藥耐藥，而由ABC蛋白家族編碼的MRP跨膜轉(zhuǎn)運蛋白與肝癌的耐藥機制關(guān)系更為密切[37,38]。然而，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌患者中ABC轉(zhuǎn)運體代謝的異常，將對此部分患者術(shù)后化療方案的選擇及療效評估起到一定提示作用。

表4 ROC曲線下面積

氧化應(yīng)激一旦發(fā)生，自由基便開始激活，形成肝癌缺氧微環(huán)境的同時，將誘發(fā)一種重要的缺氧調(diào)節(jié)因子（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF1）的產(chǎn)生。目前認為HIF1對肝癌細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移起著重要的促進作用[39]。鈷元素可通過抑制細胞內(nèi)的呼吸酶而造成胞內(nèi)缺氧，間接刺激紅細胞生成素產(chǎn)生，進而促進骨髓造血[40]。氯化鉆作為目前常用的化學(xué)性低氧模型劑，其所含的Co2+可以與Fe2+競爭性結(jié)合血紅蛋白，含氧血紅蛋白生成減少，而脫氧血紅蛋白反而增加，使得細胞其處于一種“條件性”的缺氧狀態(tài)中[41]?；阝掚x子這種生物學(xué)特性，目前已有學(xué)者設(shè)計合成出一些含鈷的配合物，在抗氧化、抗腫瘤方面的研究中取得了一些進展。Nadia[42]等通過希夫堿合成鈷、銅、鎳等絡(luò)合物，發(fā)現(xiàn)它們具有一定抗氧化作用，其中鈷絡(luò)合物最高。而就抑制HepG2細胞而言，僅僅表現(xiàn)為輕度作用。Aha?med[43]等的研究發(fā)現(xiàn)氧化鈷鐵納米粒子能夠通過誘導(dǎo)氧自由基的生成，介導(dǎo)P53、BAX的表達升高、Bcl-2的表達降低以及caspase-3、caspase-9的活力增強，而促使HepG2細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)的差異性代謝通路中戊糖磷酸途徑（Pentose phosphate pathway）和VB6代謝（Vitamin B6 metabolism）均與鈷代謝密切相關(guān)。而且，數(shù)據(jù)顯示肝癌組織中的鈷（Cobalt；C00175）含量為癌旁組織的1.63倍，說明鈷含量在肝癌組織細胞中含量明顯上升。對于原發(fā)性肝癌的診斷，目前臨床中使用比較普遍的是甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein，AFP）。但正如本文納入的研究對象中，仍有部分患者甲胎蛋白顯示陰性。因此，鈷代謝異常的發(fā)現(xiàn)可以對原發(fā)性肝癌的診斷做有益補充。同時，能否將含鈷元素組成的金屬配合物運用到鈷代謝異常的肝癌患者治療上，篩選、研發(fā)更具特異性的化療藥物，以達到個體化治療的愿景，這將是頗具挑戰(zhàn)性的研究方向。

近年來，尿液和血液等無創(chuàng)、微創(chuàng)體液樣品，因取材方便、受試對象損傷小、預(yù)處理簡單及樣本量大，常作為代謝組學(xué)研究的主要樣本。針對疾病廣譜代謝物的大規(guī)模篩查，運用此類樣品具有獨特優(yōu)勢[44]。目前，組織代謝組學(xué)研究一般選用同一個患者或同一個受試動物的病變組織和正常組織進行比較分析，可排除了由于年齡、性別、患病異同等因素導(dǎo)致的組間系統(tǒng)誤差，且更能反應(yīng)病理狀態(tài)，故組織代謝組學(xué)更適合用于做疾病的發(fā)病機制和個性化診療研究。本研究發(fā)現(xiàn)了一些肝癌代謝差異物并探討了差異物的代謝途徑類型，而肝癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的全程機制，還有待進一步研究。后續(xù)我們將補充血液、尿液及糞便的標本，結(jié)合基因組學(xué)、蛋白組學(xué)的方法進行更深入地篩查及研究，力求為尋找原發(fā)性肝癌診治的新靶標做有益的探索。

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Research on Tissue Metabolomics of 29 Patients with Hepatocellular Carcinoma

Li Jun1,Sun Shujun2,5,Wang Yang3,Liu Caifeng1,Zhong Xingyang1, Xu Feng1,Cai Zhigang6,Zhang Yongyu3,4
(1.Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200438,China; 2.School of Pharmacy,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China; 3.Center for Traditional Chinese Medicine and Systems Biology,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,

Shanghai 201203,China; 4.School of Traditional Dai Medicine,West Yunnan University of Applied Sciences,Xishuangbanna 600100,China; 5.Unimicro(Shanghai)Technologies Co.Ltd.,Shanghai 201203,China; 6.Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China)

The present study aimed to research pathogenesis and therapeutics of hepatocellular carcinoma(HCC)with the method of tissue metabolomics.A combined gas chromatography–mass spectrometry(GC–MS)method was developed suitable for analyzing the endogenous small molecule of liver cancer tissues and adjacent tissues.The unidimensional and multidimensional statistics were used to look for differential metabolites.And then,the KEGG and HMDB database were utilized to find related differential pathways and pathogenesis of HCC.The PCA and PLS-DA showed that there were significant differences on the endogenous small molecule of liver cancer tissues and adjacent tissues.Through the OPLS-Loading plot analysis,there were 25 differential metabolites and 36 relevant pathways.The differential pathways belong to carbohydrate metabolism,amino acid metabolism and mitochondrial transfer.There were 16 metabolites’area under the ROC curve which was bigger than 0.8,which were related with ATP-binding cassette (ABC)transporters,galactose metabolism,amino sugar and nucleotide sugar metabolism.It was concluded that the Warburg effect exists in HCC cells.The energy of HCC cell was from glycolytic function,because the glycolysis was enhanced and the citric acid cycle decreased.Mitochondrial dysfunction and the increased cobalt content may correlate with the Warburg effect,which may be one of the pathogenesis of liver cancer,and expected to become the breakthrough point of a new targeting therapeutic approach.

Hepatocellular carcinoma,tumor tissue,metabonomics,Warburg effect

10.11842/wst.2017.04.006

R735.7

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：王晶）

2017-04-17

修回日期：2017-04-20

＊國家自然科學(xué)基金面上項目（81373519）：基于整體代謝網(wǎng)絡(luò)的異病同證（三焦）濕熱證的證候基礎(chǔ)及病變機制研究，負責(zé)人：張永煜；上海市科委項目（13401900306）：黃芩總黃酮苷元有效組分抗腎纖維化的成藥性研究，負責(zé)人：張永煜。

＊＊通訊作者：張永煜，本刊編委，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：證候及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與體內(nèi)代謝。