羅 潔 姜玉松 楊 帆 樊汶樵 李曉英

(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心，重慶402168)

棘腹蛙生長(zhǎng)激素/類胰島素樣生長(zhǎng)因子軸關(guān)鍵基因的克隆與序列特征分析

羅 潔 姜玉松 楊 帆 樊汶樵*李曉英

(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心，重慶402168)

機(jī)體的生長(zhǎng)激素(GH)/類胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)軸由GH系統(tǒng)和IGFs系統(tǒng)構(gòu)成，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)控生理代謝，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控方面有著重要作用。為明確棘腹蛙GH/IGFs軸的功能結(jié)構(gòu)和進(jìn)化特征，為棘腹蛙生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控方面的研究提供理論依據(jù)，本試驗(yàn)對(duì)棘腹蛙GH、類胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和類胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)進(jìn)行克隆并對(duì)其序列特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：1)與兩棲類模式動(dòng)物的多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，棘腹蛙GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的功能結(jié)構(gòu)域嚴(yán)格保守，具有一定的遺傳多態(tài)性；IGF-Ⅱ的N端呈簡(jiǎn)縮進(jìn)化趨勢(shì)。2)遺傳進(jìn)化聚類分析發(fā)現(xiàn)，棘腹蛙IGFs與兩棲動(dòng)物聚為一支，并與硬骨魚相對(duì)近緣，說(shuō)明IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ進(jìn)化地位相對(duì)原始；棘腹蛙GH則與蛙類、魚類等水生動(dòng)物相對(duì)近緣，暗示該基因具有趨同進(jìn)化趨勢(shì)。3)為進(jìn)一步明確上述基因的特異性功能位點(diǎn)，利用Swiss-model server軟件解析其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，最終確定IGF-Ⅰ的THR52、LEU53、PHE72、PHE73、SER74為潛在的功能分化位點(diǎn)，IGF-Ⅱ的TYR81、LYS82、LYS83為潛在的功能分化位點(diǎn)，GH的PHE208為潛在的功能分化位點(diǎn)。由此可知，棘腹蛙GH/IGFs軸的主要基因相對(duì)保守，但與已知模式物種相比，存在潛在的功能分化位點(diǎn)，可作為后期棘腹蛙GH/IGF軸功能研究和遺傳進(jìn)化特征分析的分子靶標(biāo)。

棘腹蛙；類胰島素生長(zhǎng)因子；生長(zhǎng)激素；序列分析；結(jié)構(gòu)特征

生長(zhǎng)激素(GH)是腺垂體細(xì)胞分泌的肽類激素，是影響動(dòng)物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要內(nèi)源因素。類胰島素生長(zhǎng)因子(IGFs)分為類胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和類胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)2種類型，是存在于血漿內(nèi)的一類既有促生長(zhǎng)作用又有胰島素樣作用的多肽。目前已闡明機(jī)體的生長(zhǎng)是由GH/IGFs軸所控制，GH從垂體分泌后，通過(guò)GH受體的介導(dǎo)進(jìn)而刺激肝臟和其他組織合成并分泌IGFs，后者通過(guò)IGFs受體的介導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)功能[1]。

棘腹蛙(Paaboulengeri)又名石坑、石蛙等，隸屬于無(wú)尾目，蛙科，棘蛙屬，是我國(guó)西部中高海拔區(qū)域特有的珍稀兩棲動(dòng)物[2-3]。由于環(huán)境污染、生態(tài)破壞等原因，野生棘腹蛙的規(guī)模日趨萎縮，現(xiàn)已被《中國(guó)瀕危物種紅皮書》[4]、《中國(guó)物種紅色目錄》[5]等收錄。棘腹蛙目前市場(chǎng)需求旺盛，人工飼養(yǎng)的子二代出欄價(jià)達(dá)到45～70元/kg，其人工養(yǎng)殖已經(jīng)成為山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要途徑。為更好地保護(hù)野生資源，同時(shí)滿足經(jīng)濟(jì)需求，棘腹蛙的人工養(yǎng)殖熱度逐年上升。

本課題組前期對(duì)棘腹蛙的人工飼養(yǎng)條件進(jìn)行探索時(shí)發(fā)現(xiàn)，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其生長(zhǎng)發(fā)育，而溫度對(duì)GH/IGFs軸的影響尤為明顯。對(duì)棘腹蛙的遺傳特性研究發(fā)現(xiàn)棘腹蛙種群屬于一個(gè)單系分支[6-7]，在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)獨(dú)立[8-9]，并無(wú)其他模式物種的相關(guān)數(shù)據(jù)可以參考。本研究擬從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的信息入手，克隆GH/IGFs軸的關(guān)鍵基因(IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和GH)并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，深入了解其基因特性，發(fā)掘物種特異性的潛在功能作用位點(diǎn)，為探索以棘腹蛙為代表的兩棲動(dòng)物的生理反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

2歲齡健康棘腹蛙，飼養(yǎng)于重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心兩棲動(dòng)物流水養(yǎng)殖系統(tǒng)。Trizol、焦碳酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，cDNA合成試劑盒、Taq酶、PCR純化試劑盒購(gòu)自Promega公司，凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

基因序列主要基于前期本實(shí)驗(yàn)室建立的棘腹蛙蝌蚪的Illumina solexa第二高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)分別獲取了棘腹蛙GH、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的全長(zhǎng)基因序列，并經(jīng)過(guò)比對(duì)驗(yàn)證其序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果一致。最后，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)基因的特異性引物，所用引物如表1所示，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

1.3 cDNA制備

取雙毀髓法處死的棘腹蛙肝臟，立即放入液氮中。隨后總RNA按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取，并利用Promega公司的cDNA合成試劑盒說(shuō)明書完成單鏈cDNA(ss cDNA)的制備。

1.4 序列克隆與測(cè)定

利用高保真DNA Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-qPCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL、10×Ex Taq PCR buffer 2.5 μL、Ex Taq 0.65 U、dNTP(100 μmol/L)1 μL、MgCl21 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL，加ddH2O至總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序：1)94 ℃預(yù)變性4 min；2)94 ℃變性90 s；3)58 ℃退火90 s；4)72 ℃延伸90 s；5)將步驟2～4重復(fù)循環(huán)30次；6)72 ℃終延伸10 min；7)12 ℃保存。最后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后切取與基因長(zhǎng)度一致的片段，經(jīng)TaKaRa凝膠回收試劑盒純化后連接pMD 19-T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)JM109感受態(tài)細(xì)胞中，利用藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證后送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

1.5.1 遺傳多態(tài)性分析方法

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索GH、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的同源序列，利用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)和Boxshade Server序列對(duì)齊，最后結(jié)果由Photoshop CS6進(jìn)行處理。

1.5.2 遺傳進(jìn)化分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索近緣物種序列，利用ClustalW對(duì)齊后，利用MEGA 5.0軟件對(duì)GH、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ同源基因以鄰近(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，取1 000次重復(fù)檢驗(yàn)以估算各分支的置信值。

1.5.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

首先利用Phyre2軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/)檢索蛋白質(zhì)模型，然后使用Swiss-model server軟件(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)目的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，最后采用Swiss-Pdb-viewer軟件進(jìn)行圖像處理和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)還原。

2 結(jié)果與分析

2.1IGF-Ⅰ的序列特征分析

以2歲齡棘腹蛙肝臟組織cDNA為模板進(jìn)行

IGF-Ⅰ的基因擴(kuò)增(圖1-A)及測(cè)序(圖1-B)，并將棘腹蛙IGF-Ⅰ與已發(fā)布的2種蟾蜍的近緣基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者保守的功能結(jié)構(gòu)域存在較多的氨基酸位點(diǎn)突變(圖1-C)。

A:棘腹蛙IGF-Ⅰ的基因擴(kuò)增；B:棘腹蛙IGF-Ⅰ的序列分析；C:已知兩棲動(dòng)物的IGF-Ⅰ遺傳多態(tài)性分析。NP_001156865.1注釋為非洲爪蟾IGF-Ⅰ；XP_002936875.1注釋為熱帶爪蟾IGF-Ⅰ；IGF__1-like-Pb注釋為棘腹蛙IGF-Ⅰ。黃色表示棘腹蛙IGF-Ⅰ潛在功能分化位點(diǎn)。

A: the gene amplification ofIGF-Ⅰ fromPaaboulengeri; B: the sequence analysis ofIGF-Ⅰ fromPaaboulengeri; C: the genetic polymorphism analysis ofIGF-Ⅰ from known amphibians. NP_001156865.1 represents forIGF-Ⅰ fromXenopuslaevis; XP_002936875.1 represents forIGF-Ⅰ fromXenopustropicalis; IGF__1-like-Pb representsIGF-ⅠfromPaaboulengeri. The potential differentiation amino acid sites ofIGF-Ⅰ fromPaaboulengeriare shadowed in yellow.

圖1 棘腹蛙IGF-Ⅰ序列特征分析

Fig.1 The sequence characteristic analysis ofIGF-Ⅰ formPaaboulengeri

取不同代表物種IGF-Ⅰ進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ主要分為兩大支，一支為高等哺乳動(dòng)物，一支為爬行動(dòng)物、鳥類和兩棲動(dòng)物；其中，棘腹蛙IGF-Ⅰ與無(wú)尾目?jī)蓷珓?dòng)物、部分水棲性爬行動(dòng)物聚為一支，與其他陸生脊椎動(dòng)物近緣，說(shuō)明棘腹蛙IGF-Ⅰ與兩棲類模式動(dòng)物爪蟾IGF-Ⅰ存在較大程度的遺傳分化。值得注意的是，揚(yáng)子鱷IGF-Ⅰ有3個(gè)拷貝，其中2個(gè)拷貝與鳥綱近緣，另1個(gè)拷貝與中華鱉單獨(dú)聚為一支，與緬甸蟒蛇和龜殼花蛇近緣，推測(cè)脊椎動(dòng)物的IGF-Ⅰ可能是由原始的爬行兩棲動(dòng)物起源而來(lái)。

為深入分析棘腹蛙IGF-Ⅰ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，我們利用Swiss-model server軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，如圖3所示。相較于人類IGFs蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3lri.1A[10]而言，兩者序列相似度達(dá)84.6%。其氨基酸序列中，氨基酸31～48處存在1個(gè)跨膜域，氨基酸51～109處為IGF-Ⅰ-like superfamily功能結(jié)構(gòu)域。IGF-Ⅰ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成分主要由2個(gè)β折疊和4個(gè)α螺旋構(gòu)成，且兩端存在未知功能區(qū)域，其中THR52、LEU53、PHE72、PHE73、SER74為物種特異的氨基酸突變位點(diǎn)，暗示該蛋白質(zhì)存在一定功能分化。

圖2 棘腹蛙IGF-Ⅰ的聚類分析Fig.2 The clustering analysis of IGF-Ⅰ form Paa boulengeri

A：棘腹蛙IGF-Ⅰ的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析；B：棘腹蛙IGF-Ⅰ的特異功能結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)；C：棘腹蛙IGF-Ⅰ與人類IGFs模板3lri.1.A[10]的蛋白質(zhì)構(gòu)象差異分析。

A: the 3D protein structure analysis of IGF-Ⅰ fromPaaboulengeri; B: the specific functional target prediction of IGF-Ⅰ fromPaaboulenger; C: the protein conformation difference analysis between IGF-Ⅰ fromPaaboulengeriand the IGFs template 3lri.1.A from human beings[10].

圖3 棘腹蛙IGF-Ⅰ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

Fig.3 The protein structure analysis of IGF-Ⅰ from Paa boulengeri

2.2IGF-Ⅱ的序列特征分析

擴(kuò)增棘腹蛙的IGF-Ⅱ基因并測(cè)序，利用ClustalX 1.83軟件對(duì)其遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。其氨基酸序列中，氨基酸54～114處為IGF-Ⅱ的功能結(jié)構(gòu)域，氨基酸147～204處為IGF-Ⅱ的C端功能結(jié)構(gòu)域，暗示該基因可能主要參與棘腹蛙的免疫防御。與非洲爪蟾和熱帶爪蟾2種已知的兩棲模式動(dòng)物相比，棘腹蛙IGF-Ⅱ的拷貝數(shù)明顯減少，并且該基因的N端呈簡(jiǎn)縮進(jìn)化趨勢(shì)，且其功能結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)插入突變，說(shuō)明棘腹蛙IGF-Ⅱ的功能分化較為明顯。

A：棘腹蛙IGF-Ⅱ的基因擴(kuò)增；B：棘腹蛙IGF-Ⅱ的序列分析；C：已知兩棲動(dòng)物的IGF-Ⅱ遺傳多態(tài)性分析。XP_012816009、XP_012816008、NP_001107144、OCA36474.1注釋為熱帶爪蟾IGF-Ⅱ；NP_001085129、AAH72153.1、NP_001082128、AAH70545.1注釋為非洲爪蟾IGF-Ⅱ；IGF-2-Pb.aa注釋為 棘腹蛙IGF-Ⅱ。黃色表示棘腹蛙IGF-Ⅱ潛在功能分化位點(diǎn)，紅色下劃線表示N端功能分化區(qū)域。

A: the gene amplification ofIGF-Ⅱ fromPaaboulengeri; B: the sequence analysis ofIGF-Ⅱ fromPaaboulengeri; C: the genetic polymorphism analysis ofIGF-Ⅱ from known amphibians. NP_001085129, AAH72153.1, NP_001082128 and AAH70545.1 are stand forIGF-Ⅱ fromXenopuslaevis; XP_012816009, XP_012816008, NP_001107144 and OCA36474.1 are stand forIGF-Ⅱ fromXenopustropicalis; GF-2-Pb.aa representsIGF-ⅡfromPaaboulengeri. The potential differentiation amino acid sites ofIGF-Ⅱ fromPaaboulengeriare shadowed in yellow, and the N terminal differentiation region is underline in red.

圖4 棘腹蛙IGF-Ⅱ序列特征分析

Fig.4 The sequence characteristic analysis ofIGF-Ⅱ formPaaboulengeri

棘腹蛙IGF-Ⅱ同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖5)顯示，整個(gè)進(jìn)化樹分為三大支，一支為高等哺乳動(dòng)物類，一支為兩棲動(dòng)物類，另一支則包括硬

骨魚、陸生動(dòng)物及部分鳥類，說(shuō)明IGF-Ⅱ基因的進(jìn)化相對(duì)保守。

利用Swiss-model server軟件模擬IGF-Ⅱ蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，其與棘腹蛙IGF-Ⅰ蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似，主要由6個(gè)α螺旋構(gòu)成，其中TYR81、LYS82、LYS83存在特異的氨基酸位點(diǎn)突變，暗示該蛋白質(zhì)在物種進(jìn)化過(guò)程中存在一定的功能分化。

對(duì)比IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ作用位點(diǎn)和結(jié)合方式差異的預(yù)測(cè)，我們利用PDB-Viewer還原了這2種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)骨架，如圖3-A和圖6-A所示，黃色部分為IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ作用位點(diǎn)相同的區(qū)域，結(jié)果二者僅有3處區(qū)域有明顯差異，其蛋白質(zhì)修飾方式的對(duì)比顯示所有差異位點(diǎn)均位于功能結(jié)合區(qū)域(圖3-B和圖6-B)，隨后對(duì)二者功能差異位點(diǎn)的比對(duì)結(jié)果顯示二者差異部分有2處為IGFs保守的功能結(jié)構(gòu)域，其中一處為棘腹蛙IGF-Ⅰ特異的功能區(qū)域。由此可知，深入挖掘IGFs的功能對(duì)于研究棘腹蛙生理代謝的物種特異性具有重大意義。

2.3GH的序列特征分析

通過(guò)克隆測(cè)序(圖7-A)，獲得了棘腹蛙GH基因序列(圖7-B)。遺傳多態(tài)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)棘腹蛙GH與已知的兩棲動(dòng)物同源基因存在較少的氨基酸位點(diǎn)突變，并且其中大多數(shù)為同義氨基酸突變，對(duì)其功能結(jié)構(gòu)影響不大(圖7-C)。

與GH同源基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分析，結(jié)果如圖8所示。棘腹蛙的GH與牛蛙近緣，并與草魚、斑馬魚和淡水鰉等水生動(dòng)物單獨(dú)聚為一支，暗示水生動(dòng)物GH具有共同的祖先，鳥類與陸生動(dòng)物聚為一支，高等哺乳動(dòng)物單獨(dú)聚為一支，證實(shí)了棘腹蛙GH基因的進(jìn)化相對(duì)保守。

對(duì)棘腹蛙GH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖9所示。棘腹蛙GH具有典型的Hormone_1結(jié)構(gòu)域(圖9-C)，屬于典型的4-螺旋細(xì)胞因子(4-helix cytokines)(圖9-A)。其中，PHE208與模式脊椎動(dòng)物相比為突變位點(diǎn)(圖9-B和圖9-C)，而與兩棲模式動(dòng)物相比則相對(duì)保守，說(shuō)明棘腹蛙GH功能結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守。

3 討 論

在GH-IGFs軸中，GH處于上游位置，而IGFs則處于下游位置[12]。GH-IGFs軸的作用并不單一，是由多種因子和多種調(diào)控模式組成了GH合成與分泌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[13]。GH/IGF-Ⅰ軸作為調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的主線[14]，其信號(hào)轉(zhuǎn)遞通路主要是通過(guò)啟動(dòng)2條信號(hào)傳遞鏈，即磷酯酰肌醇-3激酶(PI3-K)激活途徑和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)激酶激活途徑，把有絲分裂和代謝信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，從而啟動(dòng)IGFs分泌，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及抑制細(xì)胞的凋亡。IGF-Ⅰ與其受體結(jié)合后，首先導(dǎo)致胰島素底物-1(IRS-1)磷酸化，IRS-1被磷酸化后，PI3-K和生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(Grb2)才能夠與其結(jié)合，由此啟動(dòng)2條信號(hào)傳遞鏈。一條途徑是PI3-K被激活并形成磷酸化磷酸肌醇(PIP3)，PIP3就是細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)，且PIP3途徑是抑制細(xì)胞凋亡的最經(jīng)典途徑。另一條途徑是激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)，ERK把信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)有絲分裂[15]。也就是說(shuō)，IGF-Ⅰ一方面通過(guò)增加細(xì)胞的有絲分裂來(lái)促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)，另一方面則通過(guò)抑制細(xì)胞的凋亡來(lái)促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)。

A：棘腹蛙IGF-Ⅱ的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析；B：棘腹蛙IGF-Ⅱ的特異功能結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)；C：棘腹蛙IGF-Ⅱ與人類IGFs模板3lri.1.A[10]的蛋白質(zhì)構(gòu)象差異分析。

A： the 3D protein structure analysis of IGF-Ⅰ fromPaaboulengeri; B: the specific functional target prediction of IGF-Ⅰ fromPaaboulenger; C: the protein conformation difference analysis between IGF-Ⅰ fromPaaboulengeriand the IGFs template 3lri.1.A from human beings[10].

圖6 棘腹蛙IGF-Ⅱ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

Fig.6 The protein structure analysis of IGF-Ⅱ fromPaaboulengeri

目前針對(duì)兩棲動(dòng)物GH功能的報(bào)道較少，在僅有的部分早期研究中發(fā)現(xiàn)，兩棲動(dòng)物變態(tài)前外源GH可刺激其幼體——蝌蚪的生長(zhǎng)且在幼體的生長(zhǎng)發(fā)育(尤其是肢的生長(zhǎng))中發(fā)揮特殊的作用[16]。外源性GH能促進(jìn)蟾蜍幼體的生長(zhǎng)，也能促進(jìn)牛蛙幼體下肢的生長(zhǎng)[17]。在蝌蚪發(fā)育的后期，血液中內(nèi)源性GH水平會(huì)不斷升高[16]。但內(nèi)源性GH在兩棲動(dòng)物幼體生長(zhǎng)、發(fā)育和變態(tài)中的確切作用仍然沒(méi)有相應(yīng)的報(bào)道。本研究針對(duì)棘腹蛙內(nèi)源GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者與已知兩棲模式生物相比均存在較多氨基酸突變位點(diǎn)，說(shuō)明其存在一定程度的功能分化。遺傳進(jìn)化樹聚類分析顯示，與已知兩棲模式動(dòng)物相比，棘腹蛙IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ均存在特異的物種分化趨勢(shì)，而GH的進(jìn)化則相對(duì)保守。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，與人類IGFs相比，棘腹蛙IGF-Ⅰ存在5處功能作用位點(diǎn)的分化區(qū)域，IGF-Ⅱ存在3處功能作用位點(diǎn)的分化區(qū)域；而棘腹蛙GH與模式脊椎動(dòng)物GH相比，則僅有PHE208處存在氨基酸突變，說(shuō)明該氨基酸位點(diǎn)對(duì)于棘腹蛙的功能分化具有重要研究?jī)r(jià)值。值得注意的是，該位點(diǎn)在兩棲動(dòng)物中則相對(duì)保守，暗示PHE208是兩棲動(dòng)物與高等哺乳動(dòng)物功能分化的氨基酸位點(diǎn)。

綜上所述，盡管功能結(jié)構(gòu)域和遺傳進(jìn)化特征相對(duì)保守，但棘腹蛙IGF-Ⅰ的THR52、LEU53、PHE72、PHE73、SER74，IGF-Ⅱ的TYR81、LYS82、LYS83以及GH的PHE208為潛在的功能作用位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)。鑒于本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)GH/IGFs軸易受到溫度影響，導(dǎo)致棘腹蛙蝌蚪無(wú)法變態(tài)甚至死亡，成蛙生長(zhǎng)異常。因此，本研究為揭示溫度如何介導(dǎo)GH/IGFs軸代謝機(jī)制進(jìn)而調(diào)控棘腹蛙生長(zhǎng)發(fā)育篩選了分子靶標(biāo)，并為今后棘腹蛙優(yōu)質(zhì)品種選育提供理論依據(jù)。

A：棘腹蛙GH的擴(kuò)增；B：棘腹蛙GH的序列分析；C：已知兩棲動(dòng)物的GH遺傳多態(tài)性分析。XP_002933088.2注釋為熱帶爪蟾GH；AAP4356.1和CAA31038.1注釋為牛蛙GH；GH pre__Pb注釋為棘腹蛙GH。黃色表示棘腹蛙GH潛在功能分化區(qū)域。

A： the gene amplification ofGHfromPaaboulengeri; B: the sequence analysis ofGHfromP.boulengeri; C: the genetic polymorphism analysis ofGHfrom known amphibians. AAP4356.1 and CAA31038.1 both stand forGHfromRanacatesbeiana; XP_012816009 and XP_002933088.2 both stand forGHfromXenopustropicalis; GH pre__Pb stand forGHfromPaaboulengeri. The potential differentiation amino acid sites ofGHfromPaaboulengeriare shadowed in yellow.

圖7 棘腹蛙GH的序列特征分析

Fig.7 The sequence characteristic analysis ofGHformPaaboulengeri

圖8 棘腹蛙GH的聚類分析Fig.8 The clustering analysis of GH from Paa boulengeri

A：棘腹蛙GH的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析；B：棘腹蛙GH的特異功能結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)；C：棘腹蛙GH與人類GH模板1bp3.1.A[11]的蛋白質(zhì)構(gòu)象差異分析。

A： the 3D protein structure analysis of GH fromPaaboulengeri; B: the specific functional target prediction of IGF-Ⅰ fromPaaboulenger; C: the protein conformation difference analysis between GH fromPaaboulengeriand the GH template 1bp3.1.A from human beings[11].

圖9 棘腹蛙GH的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

Fig.9 The protein structure of GH fromPaaboulengeri

4 結(jié) 論

棘腹蛙GH/IGFs軸的主要基因相對(duì)保守，但與已知模式物種相比，存在潛在的功能分化位點(diǎn)，可作為后期棘腹蛙GH/IGFs軸功能研究和遺傳進(jìn)化特征分析的分子靶標(biāo)。

[1] POLLAK M.The insulin and insulin-like growth factor receptor family in neoplasia:an update[J].Nature Reviews Cancer,2012,12(3):159-169.

[2] 費(fèi)梁,葉昌媛,黃永昭,等.中國(guó)兩棲動(dòng)物檢索及圖解[M].成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社,2005:137-139.

[3] YAN F,ZHOU W W,ZHAO H T,et al.Geological events play a larger role than Pleistocene climatic fluctuations in driving the genetic structure ofQuasipaaboulengeri(Anura: Dicroglossidae)[J].Molecular Ecology,2013,22(4):1120-1133.

[4] 汪松,趙爾宓.中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(兩棲類和爬行類)[M].北京:科學(xué)出版社,1998:80-83.

[5] 汪松,解焱.中國(guó)物種紅色名錄:第1卷:紅色目錄[M].北京:高等教育出版社,2004:1-224.

[6] SHAN X,XIA Y,ZHENG Y C,et al.The complete mitochondrial genome ofQuasipaaboulengeri(Anura:Dicroglossidae)[J].Mitochondrial DNA, 2014,25(2):83-84.

[7] XIA Y,HU L J,SHAN X,et al.Isolation and characterization of eleven polymorphic tetranucleotide microsatellite loci forQuasipaaboulengeri(Anura:Dicroglossidae)[J].Conservation Genetics Resources,2013,5(1):5-7.

[8] YUAN S Q,XIA Y,ZHENG Y C,et al.Development of microsatellite markers for the spiny-bellied frogQuasipaaboulengeri(Anura:Dicroglossidae) through transcriptome sequencing[J].Conservation Genetics Resources,2014,7(1):229-231.

[9] QING L Y,XIA Y,ZHENG Y C,et al.A de novo case of floating chromosomal polymorphisms by translocation inQuasipaaboulengeri(Anura,Dicroglossidae)[J].PLoS One,2012,7(10):e46163.

[10] LAAJOKI L G,FRANCIS G L,WALLACE J C,et al.Solution structure and backbone dynamics of long-[Arg(3)]insulin-like growth factor-Ⅰ[J].The Journal of Biological Chemistry,2000,275(14):10009-10015.

[11] SOMERS W,ULTSCH M,DE VOS A M,et al.The X-ray structure of a growth hormone-prolactin receptor complex[J].Nature,1994,372(6505):478-481.

[12] PERRINI S,LAVIOLA L,CARREIRAM M C,et al.The GH/IGF1 axis and signaling pathways in the muscle and bone:mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and osteoporosis[J].Journal of Endocrinology,2010,205(3):201-210.

[13] CANOSA L F,CHANG J P,PETER R E.Neuroendocrine control of growth hormone in fish[J].General and Comparative Endocrinology,2007,151(1):1-26.

[14] BARTKE A.Impact of reduced insulin-like growth factor-1/insulin signaling on aging in mammals:novel findings[J].Aging Cell,2008,7(3):285-290.

[15] JONES J I,CLEMMONS D R.Insulin-like growth factors and their binding proteins:biological actions[J].Endocrine Reviews,2002,16(1):3-34.

[16] MCLEAN E,DONALDSON E M.The role of growth hormone in the growth of poikilotherms[M]//SCHREIBMAN M.The endocrinology of growth,development,and metabolism in vertebrates.Amsterdam:Elsevier,1993:43-71.

[17] KIKUYAMA S,KAWAMURA K,TANAKA S,et al.Aspects of amphibian metamorphosis: hormonal control[J].International Review of Cytology,1993,145:105-148.

*Corresponding author, associate professor, E-mail: wonderbreeze@126.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Cloning and Sequence Characteristic Analysis of Growth Hormone/Insulin-Like Growth Factors Axis Key Genes fromPaaboulengeri

LUO Jie JIANG Yusong YANG Fan FAN Wenqiao*LI Xiaoying

(ChongqingResearchCentersofConservationandDevelopmentonRare&EndangeredAquaticResources,CollegeofLifeScience&Forestry,ChongqingUniversityofArt&Science,Chongqing402168,China)

Growth hormone (GH)/insulin-like growth factors (IGFs) axis was composed of GH system and IGFs system, which can promote cell proliferation, regulate growth and development, regulate physiological metabolism, as well as played an important role in the regulation of growth and development. In order to clear the functional structure and evolution characteristics of GH/IGFs axis fromPaaboulengeriand to provide the theoretical basis for regulation study of growth and development forPaaboulengeri, theGH, insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ) and insulin-like growth factor-Ⅱ (IGF-Ⅱ) fromPaaboulengeriwere cloned and the sequence characteristics of them were analyzed. The results showed as follows: 1) multiple sequence alignment with amphibian model animals revealed thatGH,IGF-Ⅰ andIGF-Ⅱ displayed respective genetic polymorphisms within conserved functional domains, and the N-terminal domain ofIGF-Ⅱ showed a abbreviated evolution trend. 2) The phylogenic clustering analysis found thatIGFsfromPaaboulengeriand amphibians were classified to one cluster, and they had a near relationship with bony fish, which indicatedIGF-Ⅰ andIGF-Ⅱ were comparatively ancient genes.IGFsfromPaaboulengerihad a near relationship with aquatic animals such as frogs and fishes, which impliedGHhad a trend of convergent evolution. 3) To further define the specific functional sites of above genes, the protein structure of them were analyzed by Swiss-model server software, and some potential functional differentiation sites were found including THR52, LEU53, PHE72, PHE73 and SER74 from IGF-Ⅰ, TYR81, LYS82 and LYS83 from IGF-Ⅱ, and PHE208 from GH. The results indicate that the major genes of GH/IGFs axis fromPaaboulengeriare relatively conserved, but their exist some potential functional differentiation sites compared with known model species, which can be as molecular targets for the functional study and genetic characteristics analysis of GH/IGFs axis fromPaaboulengeriin future.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(7)：2492-2501]

Paaboulengeri; IGFs; GH; sequence analysis; structure characteristics

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.07.034

2016-12-07

重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究(重點(diǎn))專項(xiàng)(cstc2015jcyjBX0013)；重慶市前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究(一般)項(xiàng)目(cstc2014jcyjA80042)；永川區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Ycstc,2015nc1001)；重慶文理學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(R2013LS14，R2014LX07)

羅 潔(1983—)，女，河南周口人，博士，從事微生物與免疫研究。E-mail: luojiecq@sina.cn

*通信作者：樊汶樵，副教授，E-mail: wonderbreeze@126.com

S917.4

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1006-267X(2017)07-2492-10