劉宏毅,陳全助，葉小真*，陳慧潔，李慧敏，馮麗貞

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院 福建 福州 350002)

桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定與分析

劉宏毅1,陳全助2，葉小真2*，陳慧潔1，李慧敏1，馮麗貞1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院 福建 福州 350002)

[目的]利用生物信息學(xué)方法探討ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在焦枯病菌對(duì)桉樹(shù)侵染過(guò)程中的解毒作用，為揭示桉樹(shù)焦枯病致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。[方法]本文利用BLAST、HMMER、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)、TCDB數(shù)據(jù)庫(kù)在全基因組內(nèi)對(duì)桉樹(shù)焦枯病菌的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行鑒定和分類(lèi)，并通過(guò)ProtCamp和IBS分別進(jìn)行亞細(xì)胞定位和結(jié)構(gòu)域圖繪制，依據(jù)同源性對(duì)其功能進(jìn)行推測(cè)分析。[結(jié)果]表明：桉樹(shù)焦枯病菌共有70個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們分屬于8個(gè)亞族。71%的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白位于細(xì)胞膜，10%位于液泡，其余部分位于線粒體、過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等內(nèi)膜系統(tǒng)上。桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含全分子、四分之三分子、半分子及四分之一分子。根據(jù)同源性推測(cè)桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與MDR、PDR、HMT、MPE、STE、P-FAT等幾種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較高相似性，同時(shí)還與核糖體合成、翻譯、過(guò)氧化物酶體合成的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較高相似性。[結(jié)論]桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白除作為外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)外源化學(xué)物質(zhì)、疏水性化學(xué)分子等物質(zhì)。還參與細(xì)胞代謝、翻譯、核糖體的合成、mRNA的輸出、β氧化，并通過(guò)為輔酶Q的輔助因子增強(qiáng)呼吸代謝等多項(xiàng)生命活動(dòng)為焦枯病菌的侵染提供能量。

桉樹(shù)；焦枯病菌；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporters)組成了已知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中最大的超家族，它是由含NBD(Nucleotide-binding domain)、TMD(Transmembrane domain)、NTE(N-terminal extension)等結(jié)構(gòu)域的蛋白共同組成的[1-2]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)域，可作為轉(zhuǎn)運(yùn)肽、糖、脂、重金屬螯合物等有機(jī)物的膜整合蛋白來(lái)行使其功能[3]。根據(jù)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所含有結(jié)構(gòu)域的類(lèi)型和數(shù)量等因素，將其分為ABCA-ABCI等九個(gè)亞族[4]。不同亞族的功能及所處的亞細(xì)胞位置等存在一定的差異。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌等生物中，不同生物間ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量存在較大的差異[5]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在抗真菌毒素或轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞毒素的過(guò)程中起著重要作用[6]。目前已知，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在保護(hù)人類(lèi)血腦屏障不受外源化學(xué)物質(zhì)或有毒代謝產(chǎn)物影響等作用；在植物中參與病原微生物應(yīng)答、重金屬調(diào)節(jié)、次生代謝產(chǎn)物運(yùn)輸以及植物生長(zhǎng)等過(guò)程;在真菌中具有分泌性信息素、合成鐵硫蛋白、保護(hù)病原真菌不受細(xì)胞抗真菌毒素的影響及核糖體合成等功能[7-9]。病原真菌在侵入植物寄主的過(guò)程中，需要這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白幫助克服寄主產(chǎn)生的抗真菌化合物或細(xì)胞毒素對(duì)自身的毒害作用[10]。

桉樹(shù)焦枯病(Calonectrialeaf blight)是熱帶和亞熱帶地區(qū)桉樹(shù)種植區(qū)危害最為嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重威脅桉樹(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[11]。桉樹(shù)焦枯病菌是由麗赤殼屬(Calonectria)真菌引起的病害，其無(wú)性態(tài)為帚梗柱孢屬(Cylindrocladium)真菌[12]。據(jù)統(tǒng)計(jì)Calonectria現(xiàn)有集群13個(gè)，共71種，其中C.pseudoreteaudii是福建省內(nèi)發(fā)現(xiàn)最早、分布最廣、致病力最強(qiáng)的病原菌株[13-15]。桉樹(shù)富含次生代謝物質(zhì)，包括類(lèi)黃酮類(lèi)和鞣質(zhì)等酚類(lèi)化合物以及蒎烯、萜烯醇等揮發(fā)性化感物質(zhì)，這些物質(zhì)有利于桉樹(shù)抵御蟲(chóng)害、病害等有害生物的侵襲[16]。課題組前期研究也表明桉樹(shù)葉片中多酚類(lèi)物質(zhì)含量、黃酮類(lèi)化合物含量、多酚氧化酶活性水平及其同工酶譜帶均與桉樹(shù)對(duì)焦枯病抗性成正相關(guān)[17]。有鑒于此，本文在課題組前期已對(duì)桉樹(shù)焦枯病菌(Ca.pseudoreteaudii)的全基因組進(jìn)行測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行鑒定及分類(lèi)，并進(jìn)一步進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化分析等，旨在明確ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在焦枯病菌對(duì)桉樹(shù)侵染過(guò)程中所起的作用，為揭示桉樹(shù)焦枯病菌致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及全基因組測(cè)序

供試菌株為Ca.pseudoreteaudiiYA51,由福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所于福建永安桉樹(shù)焦枯病危害區(qū)采集分離獲得[12]。該菌株全基因組測(cè)序和組裝委托給北京諾禾致源生物信息科技有限公司(Novogene)完成，GeneBank Assembly accession：MOCD00000000.1。

1.2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定分類(lèi)

采用HMMER軟件(http://hmmer.org/)所提供的hmmsearch功能，將Pfam30.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// pfam.xfam.org)中下載蛋白結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫(HMM,Hidden Markov Model)模型與導(dǎo)入的桉樹(shù)焦枯病菌蛋白蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，E值設(shè)定為1e-5，其余參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。將篩選出的結(jié)果導(dǎo)入Pfam在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，最終根據(jù)HUGO系統(tǒng)分類(lèi)法進(jìn)行分類(lèi)。

1.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

采用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)在線分析對(duì)桉樹(shù)焦枯病ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，用IBS(Illustrator for Biological Sequences, http://ibs.biocuckoo.org/)繪制其結(jié)構(gòu)域。

1.4 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能分析

將桉樹(shù)焦枯病ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與TCDB(Transporter Classification Database, http://www.tcdb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastp比對(duì)，E值設(shè)定為1e-50。

1.5 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析

采用ProComp9.0在線工具(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測(cè)。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)MEGA7.0軟件對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列進(jìn)行MUSCLE比對(duì)，進(jìn)一步通過(guò)臨近法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)置為1000次，并采用Poisson模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定與分類(lèi)

通過(guò)Hmmer與Pfam比對(duì)獲得具有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的原始數(shù)據(jù),總共在桉樹(shù)焦枯病菌中鑒定出70個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，約占總編碼蛋白數(shù)量的0.49%(表1)。這些基因廣泛分散于不同的桉樹(shù)焦枯病菌基因組支架(Scaffod)上。稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)含有50個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，約占總編碼蛋白數(shù)量的0.32%；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)含有29個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，約占總編碼蛋白數(shù)量的0.46%；禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中含有58個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，約占總編碼蛋白數(shù)量的44%，其總量均低于桉樹(shù)焦枯病菌(表1)[9,18]。根據(jù)HUGO(Human Genome Organization)系統(tǒng)分類(lèi)法，將其劃分為ABCA(1，1.4%)、ABCB(20，29%)、ABCC(15，21%)、ABCD(2，2.8%)、ABCE(1,1.4%)ABCF(3，4.3%)、ABCG(24，34%)、ABC1(4，5.7%)8個(gè)亞族(表2)，并進(jìn)行系統(tǒng)命名。其中，ABCG亞族為桉樹(shù)焦枯病菌最大的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞族，其數(shù)量遠(yuǎn)高于釀酒酵母與稻瘟病菌，說(shuō)明該亞族存在明顯的擴(kuò)張。桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分類(lèi)與稻瘟病菌的大致相同，都具有ABC1亞族，釀酒酵母和禾谷鐮刀菌中并沒(méi)有ABC1亞族。

表1 桉樹(shù)焦枯病菌、稻瘟病菌、釀酒酵母和禾谷鐮刀菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的比較分析

2.2 桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域如圖1所示，其分別由全分子、四分之三分子、半分子及四分之一分子組成。其中，四分之一分子僅存在于ABC1亞族，其結(jié)構(gòu)域?yàn)閁biB；ABCA亞族為全分子，其結(jié)構(gòu)域?yàn)?TMD-NBD)2，其跨膜結(jié)構(gòu)域與其他亞族不同的是在前兩個(gè)螺旋之間額外多一個(gè)大環(huán)；ABCB亞族存在全分子及半分子，其結(jié)構(gòu)域分別為(TMD-NBD)2和TMD-NBD。ABCC亞族通常為全分子，但是在桉樹(shù)焦枯病菌中預(yù)測(cè)出較為特殊的半分子及四分之三分子；ABCE及ABCF亞族的結(jié)構(gòu)域均有兩個(gè)NBD結(jié)構(gòu)域，前者具有RLI結(jié)構(gòu)域，后者在兩個(gè)NBD中間存在一個(gè)延伸結(jié)構(gòu)域(Extension domain)；此外，ABCG亞族的結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c除ABC1亞族外的其余亞族反向拓?fù)?，其結(jié)構(gòu)域?yàn)?NBD-TMD)2，還存在部分半分子。其中，最為特殊的半分子為CpABCG20，其結(jié)構(gòu)域?yàn)門(mén)MD-NBD，與ABCB等亞族的結(jié)構(gòu)域較為相似，但其卻與裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似高達(dá)73.5%，我們推測(cè)其可能為假基因或與測(cè)序拼接錯(cuò)誤導(dǎo)致編碼蛋白序列的預(yù)測(cè)出錯(cuò)有關(guān)。

2.3 功能預(yù)測(cè)

Blastp比對(duì)結(jié)果如表3所示，桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白各亞族功能具有多樣性，參與焦枯病菌定殖過(guò)程中的各項(xiàng)生理活動(dòng)。其中，ABCA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與稻瘟病菌(M. oryzae)Abc4相似性達(dá)到了55%，我們推測(cè)其可能參與抗真菌藥物及Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)；桉樹(shù)焦枯病菌共有20個(gè)ABCB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分為4類(lèi)，分別含有13個(gè)多藥耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MDR，Multidrug Resistance Transporter)、5個(gè)重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMT，Heavy Metal Transporter)、1個(gè)線粒體肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MPE，Mitochondrial Peptide Exporter)及1個(gè)性信息素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(STE，The a-Factor Sex Pheromone Exporter)；桉樹(shù)焦枯病菌ABCC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的預(yù)測(cè)功能主要為藥物耦合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DCT，Drug Conjugate Transporter)；桉樹(shù)焦枯病菌ABCD與釀酒酵母ABCD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pxa1p和Pxa2p相似性為30%～40%，其可能作為異源二聚體合成完整的過(guò)氧化物酶體，并參與脂肪酸的β氧化。桉樹(shù)焦枯病菌ABCE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與釀酒酵母ABCE(Rli1p)相似性高達(dá)73%，其可能主要參與核糖體的合成和翻譯的起始；桉樹(shù)焦枯病菌CpABCF3與釀酒酵母中ABCF(Arb1p)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相似度高達(dá)73%，其余兩個(gè)相似度僅在30%左右。因此，CpABCF3可能與40S和60S核糖體的合成有關(guān)；ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要為多效耐藥性有關(guān)(PDR，Pleiotropic Drug Resistance)，除參與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)外，還參與多種脂質(zhì)分子的易位。桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白除CpABCG8外，與禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FgABC1)的相似度均達(dá)到30%，其中，CpABCG9與其相似度達(dá)到73%。此外，還含有部分半分子ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白又被稱為WBC(White-brown complex)，其在真菌中的功能仍然未知；桉樹(shù)焦枯病菌ABC1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CpABC1_1蛋白與酵母ABC1蛋白(P27697)的相似度為54%，CpABC1_2蛋白沒(méi)有相似度，其余兩個(gè)的相似度在30%左右，說(shuō)明CpABC1_1蛋白可能為輔酶Q的重要輔助因子。

圖1 桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.1 Domain of ABC transport in C. pseudoreteaudii

2.4 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析

亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測(cè)如表2所示，桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有多樣性，廣泛分布于細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、等膜系統(tǒng)上。其中，ABCA亞族位于線粒體膜；ABCB亞族分別位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(1，5%)、線粒體(4，20%)、液泡(1，5%)、細(xì)胞膜(14，70%)；ABCC亞族分別位于液泡膜(3，20%)，細(xì)胞膜(11，73%)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(1，7%)；ABCD亞族位于過(guò)氧化物酶體上；ABCE亞族位于細(xì)胞膜上，ABCF亞族位于核膜及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中；ABCG亞族分別位于細(xì)胞膜(23，96%)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(1，4%)；ABC1亞族均位于線粒體上。桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白71%的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白位于細(xì)胞膜、10%位于液泡,其余部分位于線粒體、過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等內(nèi)膜系統(tǒng)上。與已知ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相符，各亞族間的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有共性，這表明桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在功能上具有一定的保守性。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA軟件構(gòu)建的neighbor-join系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)顯示，桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為6個(gè)亞群。其中，ABCE與ABCD處于同一個(gè)亞群，說(shuō)明其進(jìn)化關(guān)系較為接近。同理，ABCF亞族與ABCA亞族的進(jìn)化關(guān)系較為接近。ABCA亞族、ABCF亞族與ABCG亞族的結(jié)構(gòu)域各不相同，卻處在同一分支上，說(shuō)明這3個(gè)亞族的進(jìn)化關(guān)系卻較為接近。其余5個(gè)亞族的進(jìn)化關(guān)系相當(dāng)。

3 討論

基于桉樹(shù)焦枯病菌Ca.pseudoreteaudii的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，本文對(duì)桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行全基因組水平鑒定與分類(lèi)，共獲得70個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，約占總編碼蛋白數(shù)量的0.49%。根據(jù)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)域及保守序列的相似性將這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為8個(gè)亞族。此外，稻瘟病菌、禾谷鐮刀菌、桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的總數(shù)均大于釀酒酵母，這可能與這三種病原菌在侵染寄主過(guò)程中需要適應(yīng)更為復(fù)雜的環(huán)境有關(guān)，包括寄主分泌的抗真菌次生代謝產(chǎn)物等。這種擴(kuò)張現(xiàn)在在焦枯病菌上尤為明顯，這與桉樹(shù)富含次生代謝產(chǎn)物的特性密切相關(guān)。

表2 桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類(lèi)及亞細(xì)胞定位分析

*代表預(yù)測(cè)的蛋白雙定位情況， M代表線粒體膜EM代表內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，V代表液泡，PM代表細(xì)胞膜，P代表過(guò)氧化物酶體，S代表分泌蛋白，N代表細(xì)胞核，CY代表細(xì)胞質(zhì)。

表3 桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白各亞族功能預(yù)測(cè)

圖2 桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analysis of ABC transport in C. pseudoreteaudii

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在病原菌侵染過(guò)程中起著重要的作用，其通過(guò)細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜運(yùn)輸病原菌在侵染過(guò)程中所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、信號(hào)分子和寄主植物分泌的抗真菌毒素等，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在其中扮演尤為重要的角色。真菌中，ABCA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)量極少，釀酒酵母中不含有ABCA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(表1)，在稻瘟病菌(M.oryzae)及Botryotiniafuckeliana中分別發(fā)現(xiàn)兩個(gè)ABCA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[9]。稻瘟病菌的ABCA(Abc4)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被驗(yàn)證為與其致病性和附著孢的生成有關(guān)[19]。桉樹(shù)焦枯病菌中含有1個(gè)ABCA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(表3)，與Abc4相似性達(dá)到55%，我們推測(cè)其可能與焦枯病菌的致病性存在密切聯(lián)系；桉樹(shù)焦枯病菌中共含有13個(gè)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋(表3)，其主要與病原菌對(duì)藥物的抗性機(jī)制有關(guān)。研究表明，赤霉菌(Gibberellapulicaris)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCB亞族)Gpabc1參與轉(zhuǎn)運(yùn)馬鈴薯產(chǎn)生的抗真菌毒素，使其能夠抵御馬鈴薯塊莖產(chǎn)生的抗真菌毒素日奇素等的毒害作用[20]。除此之外，灰霉菌(Botrytiscinerea)BcatrB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)AtrB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均與病原菌的致病性有關(guān)[21-22]。桉樹(shù)焦枯病菌共含有5個(gè)HMT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(表3)，其主要與重金屬物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。例如，Botryotiniafuckeliana的HMT蛋白(AbcB蛋白)參與轉(zhuǎn)運(yùn)鐵載體肽分解產(chǎn)物[23]。

桉樹(shù)焦枯病菌ABCC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的預(yù)測(cè)功能主要為藥物耦合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DCT，Drug conjugate transporter)，與細(xì)胞內(nèi)毒性化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)有著密切聯(lián)系，它能將毒性化合物轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中儲(chǔ)存或轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外[9]。暗示著桉樹(shù)焦枯病菌ABCC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能參與焦枯病菌到解毒作用的過(guò)程中。稻瘟病菌(M.Oryzae)DCT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCC亞族)MoABC5參與轉(zhuǎn)運(yùn)水稻葉片產(chǎn)生的植物毒素，說(shuō)明其與病原菌對(duì)抗真菌毒素的應(yīng)答存在聯(lián)系[24]。

桉樹(shù)焦枯病菌中共含有24個(gè)PDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(表3)，PDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白除參與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)外，還參與多種脂質(zhì)分子的易位。研究表明，指狀青霉菌(Penicilliumdigitatum)中共有5個(gè)ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在抑霉唑的作用下發(fā)生上調(diào)表達(dá)[25]。禾谷鐮刀菌(F.graminearum)的PDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG亞族)FgABC1與抗真菌化合物苯霜靈的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，將其編碼基因敲除后，導(dǎo)致病原菌對(duì)苯霜靈的敏感性增加[26]。除此之外，釀酒酵母ABCG(Snq2p，Pdr5p，Pdr10p，Pdr11p，Pdr15p)通過(guò)輸出多種疏水性分子來(lái)實(shí)現(xiàn)其多效耐藥性[27]。釀酒酵母ABCG(Pdr11p，Aus1p)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還與固醇類(lèi)物質(zhì)的攝入及厭氧生活有關(guān)[28]。桉樹(shù)焦枯病菌ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與已知ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能具有較高的相似度，我們推測(cè)其與轉(zhuǎn)運(yùn)抗真菌化合物、脂類(lèi)、固醇類(lèi)等疏水分子存在密切聯(lián)系。

桉樹(shù)焦枯病菌中含有大量與抗真菌毒素轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白，包括13個(gè)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、15個(gè)DCT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、24個(gè)PDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(表3)，約占桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的67%，這說(shuō)明盡管桉樹(shù)可通過(guò)增加多酚類(lèi)化合物及黃酮類(lèi)物質(zhì)等抗真菌毒素提高抗焦枯病的能力，但焦枯病菌則通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和MFS(Major facilitator superfamily)等其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的協(xié)同作用，將細(xì)胞毒素轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞器中儲(chǔ)存或分泌到細(xì)胞外，減少抗真菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的毒害作用。此外ABCD、ABCE、ABCF、ABC1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還參與多項(xiàng)生命活動(dòng)，包括細(xì)胞代謝、翻譯、核糖體的合成、mRNA的輸出和β氧化等。這些功能在功能在釀酒酵母等真菌中已獲得廣泛驗(yàn)證[29-32]。

4 結(jié)論

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在焦枯病菌侵染桉樹(shù)的過(guò)程中可能發(fā)揮著多重作用。MDR、PDR、DCT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可作為外排泵將焦枯菌中的桉樹(shù)抗真菌次生代謝物質(zhì)排到胞外、轉(zhuǎn)運(yùn)外源化學(xué)物質(zhì)、疏水性化學(xué)分子等。還可通過(guò)HMT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬化學(xué)物質(zhì)。此外ABCD、ABCE、ABCF、ABC1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還參與多項(xiàng)生命活動(dòng)，包括細(xì)胞代謝、翻譯、核糖體的合成、mRNA的輸出、β氧化和通過(guò)為輔酶Q的輔助因子增強(qiáng)呼吸代謝來(lái)為焦枯病菌的侵染提供能量等。桉樹(shù)焦枯病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分類(lèi)、鑒定、功能預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)域分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)可為后期ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋的功能驗(yàn)證提供參考，為弄清ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在焦枯病菌致病機(jī)制中所起作用奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：崔 貝)

Identification and Analysis of ABC Transporter inCalonectriapseudoreteaudii

LIUHong-yi，CHENQuan-zhu，YEXiao-zhen，CHENHui-jie，LIHui-min，F(xiàn)ENGLi-zhen

(1. Forestry College, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China；2. Jinshan College, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China)

[Objective]Using bioinformatics method to investigate the detoxification of ABC transporters in Calonectria during the process infectingEucalyptus, and to provide references for revealing the pathogenic mechanism ofCalonectria. [Method] Using BLAST, HMMER, Pfam database, TCDB database to indentify and classify the ABC transporter ofCalonectriawithin the whole genome, and to predict subcellular localization and the domain structure scheme with ProtCamp and IBS, respectively. [Result]Calonectriahas a total of 70 ABC transporters, which belong to 8 subfamilies. 71% of the transporters are located in the cell membrane, 10% in the vacuole, and the rest in the mitochondria, peroxisome, endoplasmic reticulum and other endometrial systems.CalonectriaABC transporter has 4 types of molecules, contains full-size molecules, 3/4 molecules, half molecules and 1/4 molecules. According to the homology it is estimate thatCalonectriaABC transporters has high similarity with MDR, PDR, HMT, MPE, STE, P-FAT and other transporters. It also has high similarity with the ABC transporters related to the synthesis of ribosome, translation and synthesis of peroxisome. [Conclusion] The ABC transporter ofCalonectriapseudoreteaudiican transport exogenous chemicals, hydrophobic chemical molecules. It is also involved in cell metabolism, translation, ribosome synthesis, the export of mRNA, beta-oxidation, and provide energy for infecting as a cofactor of coenzyme Q.

Eucalyptus；Calonectrialeaf blight；ABC transporter；domain；subcellular localization

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.04.022

2016-07-14

福建省財(cái)政廳項(xiàng)目(K81150002、K81139238、K8112004A)

劉宏毅(1990—)，男，碩士研究生.主要從事森林病理學(xué)研究.E-mail:fjliuhongyi@126.com

* 通訊作者：葉小真，女，講師.主要從事森林病理學(xué)研究.E-mail:lisayxz@163.com

S763.7

A

1001-1498(2017)04-0685-08