丁 旭，潘 妃，謝 潔，王 明，李 青，秦玉芝

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

幾種馬鈴薯耐凍性分析方法比較

丁 旭，潘 妃，謝 潔，王 明，李 青，秦玉芝

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

將費(fèi)烏瑞它、興佳二號、金山薯、紫2作為試驗(yàn)材料，取成熟的頂端功能葉片進(jìn)行低溫梯度處理，分別進(jìn)行電導(dǎo)率、過氧化氫DAB原位檢測、丙二醛和可溶性糖含量分析，綜合得出與耐寒表型相關(guān)性好、重復(fù)性高、方便操作的分析方法。結(jié)果表明：電導(dǎo)法簡單便于操作，技術(shù)要求低，試驗(yàn)結(jié)果可以直觀準(zhǔn)確地表明各品種耐凍性強(qiáng)弱，缺點(diǎn)是電解質(zhì)外滲率的測定受環(huán)境溫度影響大，數(shù)據(jù)重復(fù)性較低；丙二醛及可溶性糖含量的測定所需儀器、人員等均要求低，可操作性強(qiáng)，其缺點(diǎn)是操作過程較繁雜，重復(fù)性較低，且數(shù)據(jù)分析過程相對較難；DAB組織定位法所需儀器、人員要求極低，操作簡單，人工時間成本低，得到結(jié)果速度快，表型特征明顯，易于識別與比較不同品種的耐凍性的大小，同時重復(fù)性強(qiáng)，干擾因素小，更方便用于耐凍性研究。

電解質(zhì)滲出率；半致死溫度；丙二醛含量；可溶性糖含量；過氧化氫；DAB染色

目前，在測定植物耐凍性的方法中尤其突出且廣泛認(rèn)可的一種是相對電導(dǎo)率的測定，并擬合Logistic方程計(jì)算出半致死溫度進(jìn)行比較。徐偉等[1]以火焰無核、紅寶石無核2個葡萄品種的一年生休眠枝條為試驗(yàn)材料，通過測定其電解質(zhì)滲出率，得到了這2個品種的耐凍性大小的結(jié)論，并指出伴隨著低溫脅迫，各品種葡萄枝條的電解質(zhì)滲出率升高。鞏慧玲等[2]應(yīng)用電導(dǎo)率法擬合Logistic方程對二倍體材料、它們的雜交后代及四倍體材料進(jìn)行耐凍性的差異比較，得到二倍體材料H28-7的半致死溫度最高，耐凍性最弱。另一種方法是丙二醛（MDA）、可溶性糖含量的測定。林艷等[3]對大葉女貞不同品種單株的葉片進(jìn)行低溫處理，以MDA、可溶性糖的含量作為反映耐凍性的生理指標(biāo)，結(jié)果表明幼苗葉片MDA、可溶性糖含量隨處理時間延長逐漸上升；耐凍性弱的普通樹MDA、可溶性糖整體含量顯著高于耐凍性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)樹。此外，苗雨晨等[4]用ABA處理蠶豆葉片下表皮，發(fā)現(xiàn)ABA在誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉過程中，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞產(chǎn)生了H2O2。因此，過氧化氫這種敏感的信號分子是否可以作為研究耐凍性的信號分子，非常值得探究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及供試材料

試驗(yàn)于2015～2016年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院基地和實(shí)驗(yàn)室展開。以費(fèi)烏瑞它、興佳二號、金山薯、紫2作為試驗(yàn)材料。植物種植在盆中放置在屋頂生長，小粒種子一個盆中放一粒，大粒種子將塊莖進(jìn)行切割處理，取適當(dāng)大小種植在盆中。生長2個月左右，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法與低溫梯度處理 （1）取樣方法。參照李飛等[5]的方法，根據(jù)試驗(yàn)所需進(jìn)行略微調(diào)整，進(jìn)行材料低溫梯度處理。取葉片樣品時，同一生理指標(biāo)選擇不同植株相同部位，取長勢一致完全伸展的、充分成熟的頂端功能葉片，連帶葉柄取下，用蒸餾水反復(fù)沖洗并吸干葉片表面水分。（2）低溫梯度處理。將葉片放入50 mL離心管中，封口；將離心管放入低溫循環(huán)水浴鍋中，水浴鍋初始溫度設(shè)為0℃，保持30 min，向離心管中加入冰塊，保持30 min后取出，即0℃處理的樣品；然后將溫度從0℃降至-1℃，保持1 h后取出，即-1℃處理的樣品；以此類推至-7℃；每個處理3次重復(fù)。對照（CK）不進(jìn)行低溫處理。每個材料取出后放在冰上解凍，測量相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.2 MDA、可溶性糖含量測定 用硫代巴比妥酸法參照林艷等[3]的方法，但略有改動。稱取試材1 g左右置于研缽中，加入少量石英砂和10%三氯乙酸2 mL，研磨至勻漿，再加入8 mL 10%三氯乙酸進(jìn)一步研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心試管以5 000 r/min離心10 min，上清液為MDA提取液。取4支干凈試管編號：3支為樣品管（3個重復(fù)，各加入提取液2 mL），1支為對照管（加蒸餾水2 mL）；然后各管再加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液。搖勻，混合液在沸水水浴鍋中反應(yīng)15 min，迅速冷卻后取試管內(nèi)上清液用WFJ7200型分光光度計(jì)測量其在波長450、532、600 nm下的吸光度（A）值。并按公式（1）和（2）分別計(jì)算MDA、可溶性糖含量：

式中，V為提取液體積（mL）；m為植物組織鮮重（g）；含量的單位為μmol/g。

1.2.3 電導(dǎo)率的測定 采用浸泡法，參照陳愛葵等[6]的方法。以冷凍后的離體馬鈴薯葉片為原料，在0℃至-7℃的溫度范圍內(nèi)，測定各葉片在各溫度時的相對電導(dǎo)率。取處理后離心管中的葉片，盡量保持葉片完整性，少含莖節(jié)。用蒸餾水沖洗干凈，并用濾紙吸干葉片表面水分，剪成適宜長度的長條，迅速稱量3份，每份0.1 g，分別置于含10 mL去離子水的試管中，封口，室溫下浸泡12 h后用DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀測定提取液電導(dǎo)率（R1），然后沸水浴20 min殺死葉片，冷卻至室溫，充分搖勻后測量浸提液電導(dǎo)率（R2）。電解質(zhì)滲出率=（R1/R2）×100%，將每個溫度3次測得的電導(dǎo)率計(jì)算平均值，與Logistic方程擬合。方程拐點(diǎn)即為材料的半致死溫度。

1.2.4 DAB組織定位 參照張小莉等[7]的方法。取低溫梯度處理后植物組織的葉片，用蒸餾水洗凈后將其置于50 mL離心管中。取適量DAB染液（1 mg/mL，pH值為3.8），用NaOH調(diào)pH值至5.8，分別加入預(yù)處理的植物組織，28℃避光保存8 h。吸去各管染液，加入80%乙醇，沸水浴數(shù)分鐘，吸出各管液體，加入無水乙醇并沸水浴直至葉片綠色完全脫去為止。加入無水乙醇，置于4℃冰箱內(nèi)保存一段時間后觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、差異顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電導(dǎo)法分析馬鈴薯耐凍性

2.1.1 低溫梯度處理馬鈴薯葉片相對電導(dǎo)率的變化

由圖1所示，本次試驗(yàn)的4個馬鈴薯材料其相對電導(dǎo)率均隨冷凍溫度的降低而升高，并且其升高幅度呈“慢—快—慢”的趨勢，呈典型的“S”形曲線。

圖1 不同品種馬鈴薯葉片經(jīng)地溫梯度處理后相對電導(dǎo)率的變化

2.1.2 馬鈴薯半致死溫度分析 通過Logistic方程y=k/(1+ae-bx)[其中，y為實(shí)測細(xì)胞傷害率；x代表冷凍溫度（℃）；k為細(xì)胞傷害率的飽和容量，即y的最大極限值，試驗(yàn)中k值為100；a、b為方程參數(shù)]對低溫處理溫度和相對電導(dǎo)率進(jìn)行擬合，結(jié)果表明相關(guān)系數(shù)均達(dá)極顯著水平（r=0.853-0.949，r0.01=0.834），表明擬合結(jié)果精確可靠，電解質(zhì)外滲率與低溫處理溫度之間遵循Logistic方程的變化規(guī)律，用曲線拐點(diǎn)表示各馬鈴薯品種的半致死溫度，即LT50=-lna/b。4個品種的半致死溫度、Logistic回歸方程及其擬合度如表1所示，所有材料半致死溫度均在-2.5℃與-2℃之間，其中費(fèi)烏瑞它的半致死溫度最低，為-2.378℃，金山薯的半致死溫度最高，為-2.136℃。根據(jù)半致死溫度的大小，得到的馬鈴薯品種耐凍性由強(qiáng)到弱為費(fèi)烏瑞它＞紫2＞興佳二號＞金山薯。

表1 不同品種馬鈴薯葉片的Logistic方程和半致死溫度

2.2 MDA及可溶性糖含量法分析馬鈴薯耐凍性

如表2所示，隨著冷凍溫度的降低，4個馬鈴薯品種MDA含量總體上呈上升趨勢，但由于耐凍性的差異，溫度降幅太大，導(dǎo)致部分品種表現(xiàn)出上升到極大值后又降低的趨勢。其中，金山薯、興佳二號在-2℃時，達(dá)到峰值，金山薯與對照呈極顯著差異（P≤0.01），與興佳二號呈顯著差異（P≤0.05）；紫2在-3℃時達(dá)到峰值，并與對照呈顯著差異（P≤0.05）；費(fèi)烏瑞它直至-4℃MDA含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，且與對照呈顯著差異（P≤0.05）。由此可見，費(fèi)烏瑞它耐凍性強(qiáng)于紫2，興佳二號和金山薯耐凍性最弱。

表2 不同品種馬鈴薯葉片MDA及可溶性糖含量隨冷凍溫度的變化及差異

隨著處理溫度的降低，4個馬鈴薯品種可溶性糖含量呈現(xiàn)下降和上升交替出現(xiàn)的現(xiàn)象。從總體看，可溶性糖含量隨著處理溫度的降低呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。其中，興佳二號呈“升—降—升”趨勢；金山薯、紫2、費(fèi)烏瑞它呈“降—升”趨勢。可溶性糖是植物耐凍性的主要保護(hù)物質(zhì)，可溶性糖的增多對耐凍有好的效果[8]。費(fèi)烏瑞它在-4℃時可溶性糖含量最高，且與對照呈極顯著差異（P≤0.01）。興佳二號在-2℃時，可溶性糖含量最高，與對照呈極顯著差異（P≤0.01）。金山薯在0℃時出現(xiàn)峰值，與對照呈極顯著差異（P≤0.01）。這表明興佳二號耐凍性強(qiáng)于金山薯。

圖2 不同品種馬鈴薯經(jīng)低溫梯度處理后葉片中過氧化氫含量的變化

綜上所述，由MDA及可溶性糖含量綜合分析得到各馬鈴薯品種耐凍性強(qiáng)弱關(guān)系為費(fèi)烏瑞它＞紫2＞興佳二號＞金山薯。

2.3 DAB組織定位法分析馬鈴薯耐凍性

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨冷凍脅迫加強(qiáng)，葉片紅褐色斑點(diǎn)或斑塊越來越多，抗凍能力越差，葉片受害表象越明顯。耐凍性強(qiáng)的品種，受到的傷害小，反之，受到的傷害大。各品種葉片表現(xiàn)如圖2。由此可見，耐凍性最強(qiáng)的為費(fèi)烏瑞它，最弱的為金山薯。各馬鈴薯品種的耐凍性由強(qiáng)到弱排列為費(fèi)烏瑞它＞紫2＞興佳二號＞金山薯。

3 討 論

測定電解質(zhì)外滲率擬合Logistic方程得到半致死溫度，測定MDA含量、可溶性糖含量以及過氧化氫原位檢測的方法都能比較出4個馬鈴薯品種的耐凍性強(qiáng)弱，且得到相同的結(jié)果，即各馬鈴薯品種的耐凍性由強(qiáng)到弱依次為費(fèi)烏瑞它＞紫2＞興佳二號＞金山薯。

但就各分析方法的試驗(yàn)過程以及數(shù)據(jù)處理而言，有如下特點(diǎn)。電導(dǎo)法簡單便于操作，技術(shù)要求低，花費(fèi)人工時間短，尤其擬合Logistic方程進(jìn)行回歸分析得到的半致死溫度可以直觀準(zhǔn)確的表明各品種耐凍性強(qiáng)弱；但是電解質(zhì)外滲率的測定受環(huán)境溫度影響大，敏感度高，數(shù)據(jù)重復(fù)性較低，且破壞供試材料，使其失去自然態(tài)。MDA及可溶性糖含量的測定所需儀器，人員等均要求低，使實(shí)驗(yàn)便于操作實(shí)施，可操作性強(qiáng)；其缺點(diǎn)主要是操作過程較繁雜，所耗時間成本大，容易造成較大誤差，重復(fù)性較低；并且數(shù)據(jù)處理相對其他方法來說復(fù)雜，分析過程較難。

而DBA組織定位法是將過氧化氫作為測定耐凍性的信號分子，所需儀器、人員要求極低，操作簡單，人工時間成本小，得到結(jié)果速度快，表型特征明顯，易于識別比較不同品種的耐凍性的大小，同時重復(fù)性強(qiáng)，干擾因素小。

4 結(jié) 論

過氧化氫的DAB組織定位檢測可以同傳統(tǒng)測定耐凍性的方法一樣，用于檢測所需植物的耐凍性。并且比傳統(tǒng)方法操作簡單、人工耗時少、干擾因素少、重復(fù)性高，更方便用于耐凍性研究，在馬鈴薯耐凍性資源的篩選與評價及耐凍性育種等領(lǐng)域均可推廣使用。

[1] 徐 偉. 電導(dǎo)法測定無核葡萄的抗寒性[J]. 南方農(nóng)業(yè)，2014，（6）：25-27.

[2] 鞏慧玲，馮再平，蔣繼明. 電導(dǎo)率法配合Logistic方程確定馬鈴薯低溫馴化前后葉片的半致死溫度[A]. 馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與現(xiàn)代可持續(xù)農(nóng)業(yè)[C]. 哈爾濱：中國作物學(xué)會馬鈴薯專業(yè)委員會. 2015.309-313.

[3] 林 艷，郭偉珍，徐振華，等. 大葉女貞耐凍性及冬季葉片丙二醛和可溶性糖含量的變化[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（25）：68-72.

[4] 苗雨晨. ABA誘導(dǎo)蠶豆氣孔運(yùn)動中H2O2和Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究[D]. 開封：河南大學(xué)，2002.

[5] 李 飛，雷尊國，劉 杰，等. 野生馬鈴薯材料苗期耐凍性鑒定[J].中國蔬菜，2008，（12）：6-10.

[6] 陳愛葵，韓瑞宏，李東洋，等. 植物葉片相對電導(dǎo)率測定方法比較研究[J]. 廣東第二師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，30（5）：88-91.

[7] 張小莉，王鵬程，宋純鵬. 植物細(xì)胞過氧化氫的測定方法[J]. 河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2009，44（1）：103-106.

[8] 阿依古麗·鐵木兒，玉蘇甫·阿不力提甫，等. 新疆地方梨品種耐凍性評價[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（28）：217-225.

（責(zé)任編輯：夏亞男）

The Comparison of Several Kinds of Potato about Cold Resistance Analysis Method

DING Xu，PAN Fei，XIE Jie，WANG Ming，LI Qing，QIN Yu-zhi
（College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Mature blades from Favorita, Xingjia No.2, Jingshanshu, GS393 and Zi 2 as the experimental materials, leakage ratio of electrolyte(REC), DAB reaction , alondialdehyde(MDA), soluble sugar contents under low temperature gradient processing were measured, coming to a comprehensive analysis method which closely related with phenotypic correlation of cold resistance, high repeatability, and convenient operation. The results showed that electrical conductivity method is easy to operate with simple technical requirements. The experimental results intuitively indicated that the frost resistance strength of each type. However, the disadvantage is that the electrolyte leakage rate of determination is infuenced by environmental temperature, leading low data repeatability. Low instruments and personnel requirements are required to test Malondialdehyde (MDA) and soluble sugar contents, especially the well maneuverability. Its defect is that operation process is relatively complex, low repeatability and relatively complicated data processing compared with other methods. DAB reaction asks extremely low instrument, low researchers, simple operation and less artifcial time. It can product results quickly and obvious phenotypic characteristics, simply identify the strength of the comparing the frost resistance of different varieties. At the same time, it is more convenient for frost resistance research with high repeatability and less interference factors.

leakage ratio of electrolyte(REC); semi-lethal temperature(LT50); malondialdehyde(MDA) content; soluble sugar content; hydrogen peroxide; DAB reaction

S532

：A

：1006-060X（2017）06-0014-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.006.005

2017-04-24

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目”（XCX15130）

丁 旭（1996-），女，甘肅定西市人，本科生，園藝專業(yè)。

秦玉芝