樊曉旭，哈登楚日亞，2，王英麗，王 姣，劉春菊，遲田英，趙永剛，張志誠，吳曉東，王志亮

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，國家外來病研究中心，山東青島 266032；2. 內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特 010018；3. 常州市動物疫病預防控制中心，江蘇常州 213002）

塞尼卡谷病毒重組酶聚合酶擴增技術（RPA）實時熒光檢測方法的建立

樊曉旭1，哈登楚日亞1，2，王英麗1，王 姣3，劉春菊1，遲田英1，趙永剛1，張志誠1，吳曉東1，王志亮1

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，國家外來病研究中心，山東青島 266032；2. 內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特 010018；3. 常州市動物疫病預防控制中心，江蘇常州 213002）

塞尼卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV）可感染豬，引起類似口蹄疫病毒感染造成的水皰性病變，新生仔豬病死率達30%～70%。本研究利用重組酶聚合酶擴增技術（RPA），針對SVV 3D基因設計了引物和探針，并進行篩選、反應條件優(yōu)化以及敏感性、特異性和重復性試驗，建立了實時熒光RPA方法。結果顯示，本方法在40 ℃、10 min內檢測的最低濃度為28拷貝/μL；與口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒無交叉反應；通過3次重復試驗檢測2.8×106～2.8×101拷貝/μL的6個稀釋度樣品，在熒光強度達1 500 mV所需時間變異系數范圍在2.44%～14.95%。該等溫、快速擴增方法為豬群出現水皰性疾病的鑒別診斷提供了技術支持，對及時采取適當防控措施具有重要意義。

塞尼卡谷病毒；實時；熒光；重組酶聚合酶擴增

塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV），又稱為Senecavirus A（SVA），是豬原發(fā)性皰疹?。⊿wine idiopathic vesicular disease，SIVD）的主要病原。SVV感染豬群后，盡管不會造成與口蹄疫病毒相同的較大政治、經濟損失，但所引起的水皰性病變，與口蹄疫、豬水泡病、水泡性口炎、豬水皰疹等造成的病變相似，給臨床鑒別診斷造成了一定的困難[1]。目前，北美、南美地區(qū)以及澳大利亞都有豬群發(fā)生SIVD的報道[2]。我國于2016年也首次分離到了SVV[3]。目前，國內外已經開發(fā)了RT-PCR、熒光定量PCR、ELISA等SVV實驗室診斷方法，但上述方法操作繁瑣，需依賴昂貴的儀器，且耗時較長（2 h以上）[4-5]。本研究采用的重組酶聚合酶等溫擴增技術（Recombinase polymerase amplif i cation，RPA）是近年來出現的恒溫、核酸快速擴增技術，已廣泛用于病毒、細菌、寄生蟲診斷研究[6]。在擴增反應中，重組酶首先與上下游引物結合，尋找、定位同源的雙鏈DNA，進行鏈交換；聚合酶從上下游引物的3′端啟動模板合成，形成兩條雙鏈DNA。該方法在37～42 ℃，10～30 min，對核酸進行特異性擴增，最低可檢測1～1 000個拷貝的DNA或RNA分子。RPA結果讀取方式多樣，可采用瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光、側流層析試紙條的方式，如已成功建立了犬細小病毒2型RPA瓊脂糖凝膠電泳檢測方法、中東呼吸綜合征冠狀病毒RPA實時熒光方法、賈第鞭毛蟲RPA側流層析試紙條檢測方法[7-9]。目前國際上尚無采用實時熒光RPA檢測SVV的報道。本研究建立了實時熒光RPA檢測方法，為SVV快速診斷及防控提供了技術參考。

1 材料與方法

1.1毒株及核酸

口蹄疫病毒O型緬甸98株（FMDV）cDNA、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV） CH-1R株cDNA、豬瘟病毒C株（CSFV）cDNA、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）CV777株和豬傳染性胃腸炎病毒華毒株（TGEV）cDNA，由本實驗室保存。

1.2實時熒光RPA標準品的制備

根據NCBI中登錄的SVV全基因序列（NC_011349.1），合成基因共7.31 kb。全基因由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。選擇BamH I和EcoR I酶切位點，將目的基因克隆于pUC19載體中構建重組質粒pUC19-SVV，載體為pUC19，重組質粒濃度為300 ng/μL，約為2.8×1010拷貝數，作為實時熒光RPA標準品。

1.3主要儀器和試劑

實時熒光RPA監(jiān)測儀器TwistaTM，購自TwistDX公司；2×Probe qPCR Mix試劑盒，購自Takara公司；Twist Amp exo試劑盒，購自TwistDX公司。

1.4引物和探針設計

根據NCBI中登錄的SVV 3D基因序列（NC_011349.1），分別使用Primer 5.0軟件設計3組引物和探針，分別為：組合1（P-1），包括F1、R1、Pb1；組合2（P-2），包括F2、R2a、Pb2；組合3（P-3），包括F2、R2b、Pb2（表1）。將探針和引物進一步通過NCBI的BLAST進行序列比對分析，比較設計的探針和引物序列與主要豬病病毒（FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV）的序列匹配度，確定引物和探針的特異性，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5實時熒光RPA反應條件的優(yōu)化

在pUC19-SVV質粒模板濃度為10-3ng的條件下，按照Twist Amp exo試劑盒說明書，在50 μL反應體系中，在預添加exo酶的PCR反應管中加入Rehydration Buffer 29.5 μL，ddH2O 8.2 μL，10 μmol/L上游引物（F）2.1 μL，10 μmol/L下游引物（R）2.1 μL，10 μmol/L探針（P）0.6 μL，DNA模板5 μL，Mg2+2.5 μL；將PCR管放入實時熒光RPA監(jiān)測儀器TwistaTM，設定反應溫度和時間；在溫度為35、37、39、40、42 ℃下反應15 min，進行實時熒光RPA反應，檢測熒光強度。

1.6熒光定量PCR反應

采用Probe qPCR Mix試劑盒，使用前期研究報道的引物探針[5]，在20 μL的反應體系中，2×qPCR Mix 10 μL，上下游引物0.8 μL，探針0.4 μL，cDNA模板2 μL，加水補齊至20 μL，進行熒光定量PCR反應。反應條件為95 ℃ 2 min；94 ℃15 s、60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。將pUC19-SVV質粒標準品10倍倍比稀釋（2.8×106～2.8×100拷貝/μL）進行熒光定量PCR檢測，測定CT值。

1.7特異性試驗

應用1.5中所篩選的最優(yōu)反應體系，以FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV的cDNA作為模板，利用最佳反應條件進行實時熒光RPA檢測，評價該方法的特異性。

1.8敏感性試驗

應用1.5中所篩選的最優(yōu)反應體系，并參照方法1.6，將pUC19-SVV質粒標準品按10倍倍比稀釋至7個濃度（2.8×106～2.8×100拷貝/μL），分別作為模板，以最佳反應條件進行檢測，確定該方法的最小檢出量。測定熒光強度超過1 500 mV時所需的時間，同時進行實時熒光PCR反應，比較兩種檢測方法的敏感性。

1.9重復性試驗

應用1.5中所篩選的最優(yōu)反應體系，對2.8×106、2.8×105、2.8×104、2.8×103、2.8×102、2.8×101、2.8×100拷貝/μL，共7個稀釋梯度的pUC19-SVV質粒標準品做3批重復檢測，并以ddH2O作為陰性對照，確定檢測方法的重復效果。

1.10統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0進行數據的統(tǒng)計分析，計量資料以“均數±標準差”表示；組間計量資料的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1引物和探針

2 結果

2.1引物篩選

本研究設計了3組引物探針組合，通過NCBI的BLAST，并與主要豬病病毒（FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV）序列比對分析，確定其特異性良好。在39 ℃下，使用組合1、2、3，對2.8×102拷貝/μL樣品進行RPA擴增。結果顯示，組合1、3樣品相比陰性對照，隨時間推移熒光強度逐漸升高（圖1-A），其中組合3熒光強度可達3 000 mV以上，高于組合1和2，差異極顯著（P＜0.0001）（圖1-B）。此外，組合3達到1 500 mV所需時間顯著小于組合1，而組合2熒光強度未達到1 500 mV（圖1-C）。因此，選擇組合3引物探針用于后續(xù)方法的研究。

圖1 SSV RPA引物探針組合篩選

2.2實時熒光RPA反應條件優(yōu)化

為了篩選反應最佳溫度和最適時間，特選取35、37、39、40、42 ℃下，最長反應15 min，檢測濃度為2.8×103拷貝/μL樣品的RPA擴增情況。結果顯示，反應溫度越高，隨著反應時間的推移熒光強度上升越快，溫度為40 ℃和42 ℃時，在6 min內熒光強度即超過1 000 mV。而在3次重復實驗中，40 ℃的重復性好于42 ℃（圖2）。因此本研究選擇40 ℃為本方法的工作溫度。

圖2不同溫度條件下RPA反應

在40 ℃的條件下，利用組合3引物探針，將拷貝數為2.8×106～2.8×100拷貝/μL的7個稀釋度標準品和ddH2O，作為陰性對照擴增20 min，結果顯示，擴增10 min時，濃度為28個拷貝/μL樣品的測定結果為陽性。當擴增20 min時，2.8 拷貝/μL樣品熒光強度值緩慢提升到1 000 mV。陰性對照從實驗開始至結束一直未出現明顯擴增。因此，本實驗選擇10 min作為擴增設定時間，檢出限為28個拷貝/μL（圖3）。

圖3不同濃度質粒標準品RPA反應時間

2.3特異性試驗

為了確定RPA方法的特異性，選取濃度為2.8×105、2.8×101拷貝/μL SVV陽性標準品以及FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV的cDNA進行反應，cDNA濃度均為10 ng/μL，用量為5 μL。結果表明，隨著反應時間的推移，反應10 min后，SVV陽性標準品熒光強度明顯升高，相比之下，其他病毒陽性cDNA測得的熒光強度無明顯升高變化，說明本方法可以特異性擴增SVV核酸，可用于SVV的檢測（圖4）。

圖4 SVV實時熒光RPA的特異性試驗

2.4敏感性試驗

為了確定實時熒光RPA方法的最小檢出量，本研究分別選取不同稀釋度標準品作為模板進行檢測，以實時熒光RPA監(jiān)測儀要求的熒光強度1 500 mV作為陽性檢出限，并與熒光定量PCR方法進行敏感度比較。結果顯示，RPA方法可在4 min內檢測到濃度為2.8×106拷貝/μL的樣品，對應的熒光定量PCRCt值為16.06±0.03，在10 min內，可檢測最低濃度為2.8×101拷貝/μL的樣品，對應的熒光定量PCRCt值為34.41±0.46（圖5），說明實時熒光RPA敏感度與熒光定量PCR方法相當，但檢測所需要的時間從熒光定量PCR的2 h縮短至10 min。

圖5 SVV實時熒光RPA的敏感性試驗

2.5重復性試驗

為了評價本檢測方法的重復性，采用了6個不同稀釋梯度的pUC19-SVV質粒標準品作為模板，進行3次重復試驗。結果如表2所示，反應10 min，各時間點熒光強度值組間變異系數范圍在0.39%～39.78%，熒光強度達1 500 mV所需時間變異系數范圍在2.44%～14.95%。樣品濃度越高，檢測所需時間越短，2.8×106拷貝/μL樣品在4 min內，熒光強度值即可達到1 500 mV。

表2SVV實時熒光RPA的重復性試驗

3 討論

通常認為，豬水皰性疾?。╒esicular disease，VD）由口蹄疫病毒（FMDV，小RNA病毒科口瘡病毒屬）、水皰性口炎病毒（VSV，彈狀病毒科水皰病毒屬）、豬傳染性水泡病毒（VESV，杯狀病毒科水皰疹病毒屬）、豬水皰?。⊿VD，小RNA病毒科腸病毒屬）4種病毒引起。但近年來，美國、巴西、澳大利亞等國陸續(xù)發(fā)現了豬“水皰性”臨床癥狀，而經檢測，上述4種病毒均為陰性。隨后，該病被確定為豬原發(fā)性皰疹病（Swine idiopathic vesicular disease，SIVD）[2]。SVV本身并不會給生產造成嚴重影響。但由于動物感染該病毒后，口部、鼻腔部以及蹄冠帶等部位出現皰疹，需要進行快速、準確鑒別診斷，以排除動物感染FMD的可能。目前，針對SVV感染的診斷方法包括病毒中和試驗、間接ELISA、競爭ELISA方法、PCR方法[10-11]。此外，本實驗室成功建立了快速、敏感的TaqMan熒光定量PCR診斷方法，僅需2 h，即可通過核酸的特異性擴增，完成鑒別診斷[5]。

在RPA診斷方法研究中，Wang等[9]采用瓊脂糖凝膠電泳方式，檢測RPA擴增的犬細小病毒2型，在10 min可最低檢測到10拷貝DNA分子；Abd El Wahed 等[7]采用實時熒光的方式，檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒，在10 min可最低檢測到10拷貝RNA分子；Teoh等[12]建立的登革熱實時熒光RPA方法耗時20 min，檢出限為10個拷貝的RNA分子；Rohrman等[13]建立的側流層析試紙條RPA方法檢測HIV，在10 min可最低檢測到1 000個拷貝數的DNA分子；Crannell等[8]開發(fā)的側流層析試紙條RPA方法檢測賈第鞭毛蟲，在30 min可最低檢測到10個拷貝數的DNA分子。本研究開發(fā)的SVV實時熒光RPA方法，在10 min內可檢測28個拷貝數的DNA分子，敏感度與上述研究結果類似，在反應時間上，將熒光定量PCR耗時2 h縮短至10 min，在保證檢測敏感度的同時提高了檢測效率。

RPA方法開發(fā)近10年，除了其等溫、快速擴增的優(yōu)點外，引物設計復雜、生產成本較高給本方法的實際應用造成一定的困難。在引物設計方面，由于單鏈綁定蛋白需要寡核苷酸長度在30～35 bp以上才能將引物整合到雙鏈DNA[14]，因此RPA的上下游引物長于普通PCR及qPCR引物；此外，RPA探針長度約為46～52 個核苷酸，也長于qPCR的探針，加之目前無軟件輔助，RPA引物探針設計難度高于普通PCR及qPCR。盡管如此，RPA商業(yè)開發(fā)公司，TwistDX公司在引物設計方面給出了相關建議：擴增產物長度在500 bp以內，以100～200 bp 為宜；5′端3～5個核苷酸應當避免出現多個G；在3′端應有GC；避免連續(xù)出現多個相同核苷酸；GC 含量占30%～70%；避免引物形成二聚體和二級結構[6]。在實際的實驗中，按照上述建議設計了3組探針引物。結果發(fā)現，有2組可用于實驗，其中組合3（148 bp）的擴增效果好于組合1（210 bp），也印證了“片段長度100～200 bp 為宜”的要求。在生產成本方面，以本研究應用的實時熒光RPA為例，單個樣品的檢測成本約50元人民幣，高于實時熒光定量PCR（約20元/樣）。但是，實時熒光RPA監(jiān)控儀價格為45 000元左右，遠低于實時熒光定量PCR儀（30萬～50萬），且該儀器體積小，便于攜帶，反應耗時短，更適于POC（床旁）及現場檢測。例如，2014年幾內亞暴發(fā)埃博拉疫情時，RPA技術被成功應用到移動實驗室對埃博拉病毒的現場快速診斷中[15]。綜上，本研究設計并成功篩選出一組引物探針，建立了實時熒光RPA方法，用于SVV核酸的檢測。結果顯示，反應在40 ℃ 10 min內，可最低檢測到陽性標準品的濃度為28 拷貝/μL，且不與FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV等發(fā)生交叉反應。本方法特異、敏感、重復性良好，且使用方便、耗時短，可在豬群出現水皰性臨床癥狀的早期做出快速診斷，便于及時采取有效措施，控制疫病的傳播擴散。

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（責任編輯：朱迪國）

Establishment of a Real-time Fluorescent Recombinase Polymerase Amplif i cation（RPA）for the Detection of Seneca Valley Virus

Fan Xiaoxu1，Hadengchuriya1，2，Wang Yingli1，Wang Jiao3，Liu Chunju1，Chi Tianying1，Zhao Yonggang1，Zhang Zhicheng1，Wu Xiaodong1，Wang Zhiliang1
（1. National Research Center for Exotic Animal Disease，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018；3. Changzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Changzhou，Jiangsu 213002）

Seneca valley virus（SVV）can affected swine，which can cause vesicular lesions similar to the infection of foot and mouth disease virus，with the neonatal mortality rate of 30%～70%. A real-time RPA method was established in this study，based on recombinase polymerase amplification technology （RPA）. Assemblies of primers and probes targeting SVV 3D gene were developed and screened，while reaction conditions were optimized before sensitivity，specif i city and repeatability of the test were determined. The results showed that the lowest concentration of 28 copies/μL could be detected within 10 min at 40 ℃. No cross reaction was found between SVV and the foot and mouth disease virus，classical swine fever virus，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus. In the 3 repeated tests of six series diluted samples（2.8×106～2.8×101copies/μL），the coeff i cient of variation of time when the fl uorescence intensity reached 1 500 mV was in the range of2.44%～14.95%. The isothermal and rapid amplif i cation method provides technical support for the differential diagnosis of vesicular disease among swine，and it is of great signif i cance to take appropriate preventive measures in a timely manner.

Seneca valley virus；real-time；f l uorescence；recombinase polymerase amplif i cation

S852.65

A

1005-944X（2017）08-0081-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.022

國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0501104）

并列第一作者：樊曉旭、哈登楚日亞

王志亮