方聰聰 毛善平 董慧敏 劉寶輝 王舜

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線粒體自噬與中樞神經系統疾病關系的研究進展

方聰聰 毛善平 董慧敏 劉寶輝 王舜

1 線粒體自噬

1.1 概念

細胞自噬(Autophagy)是真核細胞中進化上高度保守的、用于降解和回收利用細胞內生物大分子和受損細胞器的過程。根據底物進入溶酶體內的途徑不同可將自噬分為 3 種類型：微自噬 (microautophagy)、分子伴侶介導的自噬 (chaperonemediatedautophagy， CMA)、巨自噬 (macroautophagy)[1]。大多數情況下所指的自噬即為巨自噬或大自噬。巨(大)自噬可以分為選擇性和非選擇性，之前的研究認為自噬對降解底物沒有選擇性，最近的研究表明自噬體可以特異地包裹線粒體，并且通過自噬機制將其降解掉。這一選擇性降解過程被稱為線粒體自噬[2]。細胞自噬受體如p62等的發(fā)現也表明細胞自噬同樣具有很強的選擇性，這一類由細胞自噬受體介導的細胞自噬被稱為細胞選擇性自噬(Selective autophagy)。目前研究較多的選擇性自噬還包括Cvt(cytoplasm-to．vacuole transport)途徑、內質網自噬、過氧化物酶體自噬、核糖體自噬和脂類自噬。選擇性自噬途徑最主要的特征是有自噬受體(autophagyreceptor)的參與，它們對自噬底物有特異性的識別和運輸的作用，從而靶向自噬底物的降解，賦予依賴自噬降解的物質處于極其精密的動態(tài)調控之下。這些自噬受體都含有保守的LIR(LC3-interacting region) domain，這一重要結構域可以與自噬小體上的Atg8家族的分子結合，從而具有介導自噬降解的功能[3-4]。

線粒體自噬是 Lemasters[5]在2005 年首次提出的，主要是指在 ROS、營養(yǎng)缺乏、細胞衰老等刺激下細胞內的線粒體發(fā)生去極化損傷，損傷的線粒體被特異性包裹進自噬體中，并與溶酶體(lysosome) 融合，從而完成損傷線粒體的降解，維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定。線粒體自噬是研究較多的一種特異性自噬，它調節(jié)細胞對多余或功能受損的線粒體進行選擇性的清除。

1.2 線粒體自噬相關蛋白

1.2.1 線粒體融合蛋白1(mitofusin 1，Mfn1) 、2(mitofusin 2，Mfn2) 和顯性視神經萎縮蛋白1(optic dominant atrophy 1，OPA1) 是線粒體融合所需的蛋白，而線粒體分裂蛋白(dynamin-related protein，Drp1) 和分裂蛋白(fission1，Fis1) 為線粒體分裂所需的蛋白[6]。研究提示，PINK1 和Parkin 通過調節(jié)線粒體分裂和融合狀態(tài)，使線粒體分裂產生受損線粒體碎片后被選擇性自噬降解[7]。

1.2.2 經典自噬相關蛋白 主要有LC3和Beclin1；線粒體自噬的發(fā)生依賴上游線粒體自噬蛋白的募集。自噬相關蛋白LC3是哺乳動物細胞中酵母自噬相關基因(autopharmacy-related gene, ATGB)[8]的同源物，靶向定位于自噬體膜，參與自噬的形成，分為I型和II型[8]。當自噬發(fā)生時I型經泛素樣加工修飾與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，形成II型LC3, LC3-II蛋白結合并始終位于胞內自噬體膜上，其含量與自噬泡數量成正比，被認為是自噬體的標志分子[9]，研究中所測LC3水平均為LC3-II。因此，LC3-II也被廣泛應用于自噬標記物來研究哺乳動物中自噬的表達。自噬相關蛋白Beclinl 1是哺乳動物中首個被發(fā)現的具有調節(jié)細胞自吞噬作用的抑癌基因，定位于人染色體17q21，大約有150 kb，Beclin 1是自噬起始的重要調節(jié)因子[10]。Beclin 1本身并沒有酶活性，在多種重要的細胞分子如HIF- 1、Bcl -2、mTOR、 Bcl-xl、JNK Ambra 1等的參與下通過與磷脂酞肌醇3激酶(PIK3)結合形成ULK 1復合物來啟動自噬[11]。

1.2.3 在哺乳動物中已經得到證實的線粒體的選擇性自噬受體蛋白或者受體相關因子包括NIX/BNIP3L，FUNDC1，PINK1/Parkin，and BCL2L13 (Bcl-rambo)等[12-15]，自噬受體蛋白具有兩個共同功能性結構域：跨膜結構域和一個LIR模體。其選擇性自噬過程為自噬受體蛋白通過跨膜結構域固定于線粒體外膜上，通過LIR靶向LC3，進而通過自噬途徑降解。Orvedahl等人使用全基因組siRNA篩選的方法發(fā)現了一個新型的選擇性自噬因子SMURF1，它是一種HECT為主的泛素連接酶，靶向某些胞質蛋白[16]，可以在受損線粒體募集，促進線粒體自噬的發(fā)生[17]。在SMURF1缺陷的小鼠的心、腦及肝臟中觀察到線粒體腫脹、破碎及異常線粒體嵴結構等。然而SMURF1作為線粒體自噬受體的功能以及SMURF1和LC3的相互作用仍不清楚。

2 線粒體自噬的分子機制

保持線粒體健康的狀態(tài)和穩(wěn)定的數量對于細胞維持正常的功能有著重要的意義。目前，線粒體自噬被認為是一種重要的線粒體質量與數量調控機制，對維持線粒體功能穩(wěn)定性相當重要[18-22]。目前，雖然線粒體自噬得到廣泛的研究，但是對于線粒體自噬調控機制的研究還進行的很少。當細胞處于饑餓或缺氧條件時會誘導細胞的線粒體自噬，然而不同條件下引起線粒體自噬的機制并不相同。低氧條件是一種經典的誘導線粒體自噬的刺激[23]，用低氧混合氣體處理細胞，不管線粒體外膜蛋白TOM20還是內膜蛋白TIM23都被降解，同時LC3-II水平升高，表明低氧可以引起強烈的線粒體自噬。哺乳動物細胞中大自噬是最具特征的自噬，饑餓是介導大自噬的最強刺激[24-26]。Lemasters和colleagues在饑餓誘導自噬的研究中發(fā)現，線粒體可以被包裹到表面帶有自噬體標志物LC3的小泡中，這個過程大約在5 min內完成。早期的研究已經證實，細胞通過線粒體自噬可以調整細胞內部線粒體的數量，使之與代謝需求相匹配，同時清除功能受損的線粒體以完成對線粒體的質量控制[27-28]。下面介紹3種線粒體選擇性自噬的調控機制。

2.1 PINK1-Parkin 信號通路

Parkin是一個E3泛素連接酶，存在于細胞漿中[29]。Pink1是一個絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種蛋白激酶，位于線粒體外膜上，位于Parkin的上游發(fā)揮作用。Parkin沒有線粒體定位序列(mitochondrial targeting sequence，MTS)[30]。目前的研究認為Pink1能磷酸化Parkin，促進Parkin由胞漿到線粒體的轉位[31]。PINK1 可能被表達并轉運至所有線粒體上，但是在健康的線粒體上會被迅速降解掉，而受損的線粒體由于蛋白水解酶的活性被抑制，從而使PINK1得到有效的積累，PINK1 募集Parkin 定位在受損的線粒體，加強了E3 泛素連接酶的活性，可以使線粒體基質蛋白泛素化[32-33]，進而促進線粒體自噬發(fā)生(圖1)。譬如P62可以在泛素化的線粒體基質上積累[32-33]，進而與LC3 結合，介導泛素化的底物進入自噬體。細胞內的許多成分都可成為 Parkin 的泛素化底物。目前，在哺乳動物細胞線粒體已明確了3種parkin的底物[34]：線粒體融合蛋白(Mitofusin, Mfn)1，Mfn2[35-36]和電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1(voltage-dependent anion channel 1, VDAC 1)[37]。這3種底物都鑲嵌于線粒體外膜中。Parkin被募集到線粒體上后能通過介導以上泛素化底物的泛素化來參與線粒體的自噬。VDAC 1是線粒體通透性轉換孔的一個組成部分，VDAC 1的泛素化可能阻止細胞質中促調亡因子通過線粒體通透性轉換孔釋放，可能是parkin介導的線粒體自噬所必須的[31]，但也有人認為與其無關[33]。

最近的研究表明, Parkin和Pink1蛋白參與了膜電位降低引起的線粒體自噬的發(fā)生[38-39]。Shoushui[40]等的研究也表明線粒體鈣單向轉運體抑制劑可以通過調節(jié)線粒體膜電位來抑制線粒體過度自噬，從而在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經保護作用。體外培養(yǎng)的肝細胞在饑餓的情況下能觀察到快速的線粒體被降解的情況，而用線粒體MPT孔的抑制劑CsA能夠在抑制膜電位降低的同時抑制線粒體自噬的發(fā)生[41]。所以，線粒體膜電位的降低可以誘導PINK1-Parkin 信號通路，從而介導線粒體自噬的發(fā)生。

PINK1激活Parkin的過程包括PINK1磷酸化Parkin的Ub1結構域S65和磷酸化泛素上一個類似S65位點(PUb)[42-44]，Ub1的磷酸化會增加Pub對Parkin的親和力，進一步穩(wěn)定活化的Parkin[45]。如果PINK1磷酸化泛素S65位點以外的其他位點如pUb(S20) or pUb(S57)均不能激活Parkin[46]。

因Parkin 是一種泛素連接酶，故PINK1-Parkin 信號通路介導線粒體自噬的發(fā)生不僅依賴自噬-溶酶體的活性，還依賴UPS(E3泛素連接酶)Parkin傳遞泛素至底物的過程。因此，去泛素化酶(DUBs)就有望成為線粒體自噬的阻滯劑。若用去泛素酶DUBs(USP)干預可能就會導致泛素-蛋白酶體循環(huán)障礙，底物泛素化障礙，不能募集線粒體自噬相關蛋白，進而導致線粒體自噬的下調。亦有報道去泛素化酶家族DUBs中USP15[47],USP30[48]和USP35[49]直接去泛素化Parkin的底物，下調線粒體自噬。而USP8直接靶向Parkin本身，反而有助于線粒體自噬的發(fā)生[50]，然而USP8上調線粒體自噬是通過去泛素化Parkin還是穩(wěn)定內源性Parkin仍不清楚。

2.2 線粒體自噬蛋白受體的磷酸化

通過調節(jié)線粒體膜上自噬受體蛋白的磷酸化水平是控制線粒體自噬的重要途徑。最新的研究表明，在哺乳動物細胞中線粒體自噬受體蛋白FUNDCl參與了缺氧介導的線粒體自噬[23]。其中，FUNDC1的磷酸化在線粒體自噬調控中發(fā)揮了關鍵作用。FUNDC1是一個三次跨膜蛋白，定位在線粒體外膜上。在正常情況下FUNDCl的18位酪氨酸可以被Src蛋白激酶磷酸化，從而降低與LC3的結合能力。在缺氧條件下Src蛋白激酶的活性會受到抑制，使得FUNDCl去磷酸化，FUNDCl和LC3相互作用增強，從而介導線粒體自噬的發(fā)生。大量的研究證明，Bnip3和Nix與LC3同樣有直接的相互作用。它們與FUNDCl一起在缺氧介導的哺乳動物細胞線粒體自噬中發(fā)揮著重要作用[51-52]。

FUNDC1作為新的線粒體自噬受體的發(fā)現使我們有機會進一步研究哺乳動物細胞線粒體自噬的調控機制。進一步研究FUNDC1介導的線粒體自噬與Parkin介導的線粒體自噬的相互關系及FUNDC1的生理功能及其與疾病發(fā)生的關系顯得十分必要。

2.3 Bnip3/Nix介導的線粒體自噬

Bnip3除了最初發(fā)現在細胞死亡中發(fā)揮著重要的作用，同時它也是細胞自噬乃至線粒體自噬過程中的重要參與者。Bnip3在缺血再灌注損傷的情況下會激活自噬反應，后者清除損傷的線粒體，可能會起到一種保護作用[53]。最近的研究表明，Bnip3和自噬的關鍵蛋白LC3有直接的相互作用，介導了線粒體自噬的發(fā)生[54]。Nix和Bnip3在蛋白序列上有56%的同源性，并且在人的很多組織中廣泛表達。Nix在紅細胞成熟過程中參與線粒體自噬被廣泛研究。有學者發(fā)現Nix被誘導也可引起線粒體膜電位下降，從而激活自噬機制，引起線粒體被選擇性地清除[55]。也有研究表明，Nix可能是一個線粒體自噬的直接受體，它能夠和LC3蛋白直接結合，并募集LC3到損傷的線粒體上而引起線粒體自噬的發(fā)生[56](圖1)。

3 線粒體自噬與中樞神經系統疾病的關系

線粒體自噬是一種選擇性清除多余或受損線粒體的自噬過程，在調節(jié)細胞內線粒體數量和維持線粒體正常功能等方面發(fā)揮重要作用，與諸多生理和病理學過程密切相關。線粒體自噬對于生理和病理狀態(tài)下神經細胞的功能維持十分重要。其中，線粒體自噬與神經系統退行性疾病的關系已經得到廣泛研究。

圖1 經典自噬與線粒體自噬的主要相關信號通路 PINK1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；Parkin為泛素連接酶；Beclin1為自噬關鍵蛋白；LC3為自噬特異性蛋白；VADC1為陰離子選擇性通道蛋白；FUNDCl為線粒體自噬受體分子；Binp3為凋亡相關基因；Nix為促凋亡蛋白；Ub為泛素；Drp1為線粒體分裂蛋白；p53為腫瘤抑制因子；Bcl?2為抗凋亡蛋白；mTOR為雷帕霉素靶蛋白

3.1 線粒體自噬與帕金森病

大量研究表明線粒體損傷是PD的一個重要因素[57]。在老年個體多巴胺能神經元mtDNA缺失很常見，而在PD患者這種現象更為嚴重和普遍。PD患者的黑質和杏仁核線粒體自噬功能是有缺陷的[58]；線粒體復合物I抑制劑可導致PD。多個PD相關的致病基因對線粒體功能有影響。帕金森病相關基因編碼蛋白(PINK1和PARKIN 基因分別表達PINK1 蛋白和PARKIN 蛋白)參與調控線粒體自噬，二者協同調節(jié)細胞內線粒體質量控制通路(線粒體自噬)以維護線粒體質量和能量生成。 其中，PINK1 大量表達于黑質，存在于線粒體內(主要定位于線粒體內側膜，少量定位于內外側膜間腔)或者表面[59]，參與線粒體代謝、氧化應激、氧化磷酸化、鈣穩(wěn)態(tài)、線粒體動力和異常蛋白質的蛋白酶體降解過程[60]。而PARKIN 主要選擇性聚集于陳舊線粒體的外側膜，將泛素聯結于待降解蛋白并參與調節(jié)自噬小體吞噬、降解此線粒體。研究發(fā)現線粒體自噬缺陷與帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發(fā)生有關。對帕金森病模型的研究發(fā)現，細胞中存在增大和水腫的線粒體[61]，表明帕金森病的發(fā)病與線粒體清除失敗相關。PINK1、PARKIN 突變的發(fā)生通過損害募集線粒體自噬蛋白于陳舊線粒體、陳舊線粒體分離及陳舊線粒體轉運這三大過程而導致受損線粒體的堆積，進而促進神經元退行性變的發(fā)生及最終帕金森病的形成(圖2)。

在認識到線粒體自噬參與帕金森病病理機制的同時，我們也應該注意到，與自噬相似，線粒體自噬似乎也存在著穩(wěn)態(tài)，即線粒體自噬的缺失或過度活化都會對中樞神經系統造成損害，而適當的保持穩(wěn)態(tài)的線粒體自噬對于維持中樞神經系統正常的功能活動至關重要。

圖2 PINK1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；Parkin為泛素連接酶；LC3為自噬特異性蛋白；VADC1為陰離子選擇性通道蛋白；Ub為泛素；Miro為線粒體外膜錨定蛋白；Milton為結合蛋白；MFN為線粒體融合蛋白；KIF5為驅動蛋白；Drp1為線粒體分裂蛋白 (1)PINK1蛋白募集PARKIN由胞漿定位于陳舊線粒體的外膜[39]，并將線粒體膜上的VDAC1(parkin介導的Lys27泛素化和P62介導的自噬的作用靶點[37])泛素化，導致泛素連接調節(jié)蛋白p62集聚在線粒體，進而與自噬蛋白LC3家族直接接合，使得被分離出來的老化受損的線粒體通過自噬被清除[37]；(2)PINK1募集PARKIN從胞漿移向受損線粒體外層膜，促進線粒體融合蛋白(MFN，線粒體表面的大GTP酶，重要的促線粒體融合因子)發(fā)生泛素化，將受損線粒體單獨分離出來，并最終啟動自噬；(3)帕金森病患者的線粒體轉運出現缺陷。線粒體通過線粒體外膜錨定蛋白Miro和結合蛋白Milton被綁定在微管上形成微管線粒體轉移復合體，其中Miro固定在線粒體外膜并與Milton結合，Milton與KIF5(驅動蛋白)結合，而PINK1蛋白能與此復合體相互作用，且發(fā)現Miro為PINK1下游作用物(PINK1基因沉默后線粒體裂解通過Miro的過表達而被抑制)。

3.2 線粒體自噬與缺血性腦血管病

缺血性腦血管病尤其是急性期涉及線粒體的廣泛損傷，包括線粒體超微結構的改變、膜流動性的改變、膜電位的改變、能量泵的改變及自由基的改變。線粒體損傷后其通透轉化孔(mPTP)開放，線粒體腫脹、破裂，釋放細胞色素酶C及凋亡因子，啟動凋亡信號，造成神經細胞不可逆性死亡。臨床上很多藥物如丁苯酞、丹參等就是通過減少線粒體損傷來發(fā)揮腦保護作用。諸多研究都已經發(fā)現腦缺血中有自噬-溶酶體的激活。自噬在缺血性腦損傷過程中發(fā)揮保護作用的機制尚不完全明確。線粒體自噬可能在其中發(fā)揮了關鍵作用。有研究發(fā)現腦缺血/復灌過程可以誘導缺血腦區(qū)神經元發(fā)生線粒體自噬, 抑制復灌過程中的線粒體自噬則加重缺血導致的細胞色素C釋放、神經元凋亡及腦組織損傷，提示線粒體自噬是一種腦缺血/復灌病理過程中重要的內源性保護機制[62]。在缺血性腦損傷過程中基因沉默Parkin 可干擾OGD(oxygen-glucose deprivation)復灌模型誘導的線粒體自噬，并進一步加重神經元損傷，提示Parkin介導了該過程中的線粒體自噬[62](圖3)。Parkin 是否是缺血/復灌誘導線粒體自噬的唯一機制，通過調控Parkin 能否逆轉缺血性腦損傷等問題仍未明確，值得進一步深入研究。李強、孫曉江等[63]的研究利用 MCAO模型，通過電鏡、免疫組化western-blot等技術首次證實了線粒體自噬在 MCAO 模型中的表達規(guī)律，推斷上調線粒體自噬可能會有利于減輕缺血再灌注所致的神經細胞損傷。線粒體作為一種重要的細胞器對缺血狀態(tài)下的神經元命運發(fā)揮了至關重要的作用[64-65]。

有學者利用體內、外缺血性腦損傷模型，比較了長時程缺血及缺血/復灌兩種病理條件下自噬對腦損傷的作用，結果發(fā)現自噬在長時程缺血模型中發(fā)揮了神經損傷作用，而在缺血/復灌模型中通過抑制細胞凋亡發(fā)揮了神經保護作用[62]。 這些研究提示腦缺血過程中自噬的復雜性，其作用可能受缺血的時程、嚴重程度及腦區(qū)部位等因素調控，也揭示了簡單利用自噬抑制劑作為抗腦缺血藥物的潛在風險。

圖3 線粒體自噬與缺血性腦血管病 Ψm為膜電位；mPTP為線粒體通透性轉換孔；VADC1為陰離子選擇性通道蛋白；PINK1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；Parkin為泛素連接酶；LC3為自噬特異性蛋白

3.3 其他神經系統疾病

除了帕金森病(PD)[66]，現已在阿爾采默病(AD)[67]、亨廷頓舞蹈病(HD)[68-69]、傳染性海綿狀腦病(Prion disease)[70]及蛛網膜下腔出血[71-72]的神經細胞中發(fā)現自噬體，提示自噬除了參與神經系統退行性疾病的發(fā)病過程，還涉及腦血管病的病理生理過程。但究竟是通過自噬性死亡途徑，還是信號通路抑或者是直接在基因水平調控自噬以及多大程度上依賴線粒體自噬，仍待進一步的研究。

4 總結與展望

了解選擇性自噬及自噬-溶酶體途徑對于正確把握線粒體自噬的分子機制以及具體發(fā)病機理有著深遠的意義，將為深入理解線粒體自噬是如何參與中樞神經系統疾病的病理生理過程，發(fā)現新的潛在藥物及治療靶點提供有益的思路。譬如DUBs影響PINK1-Parkin信號通路的激活進而導致線粒體自噬的發(fā)生障礙，對應的藥物應用于臨床就可影響相關疾病的發(fā)展和預后。自噬作為一種新的缺血性腦損傷的干預靶點正得到越來越多的共識，已有基礎研究專注于調控自噬的活性化合物篩選[73-74]。近年來也有一些臨床前研究以干預自噬為靶點對中樞神經系統疾病進行治療[75-79]，這也可能成為腦卒中及神經系統退行性疾病基礎研究與潛在臨床應用的新熱點。對自噬的分子生物學機制的深入研究，尤其是對研究較少的選擇性自噬發(fā)生機制的探索，將有助于尋找新的藥物干預分子靶點[80-82]。線粒體自噬和其他非選擇性自噬一樣，自噬不足或過度對神經細胞都是有害的，尤其是對急性腦血管病，要想發(fā)揮線粒體自噬對神經細胞的保護作用，前期的體外研究中不僅需要對神經細胞活力與自噬流強度進行動態(tài)監(jiān)測，還要嚴密記錄線粒體功能及數量最佳時段，這或許才可以為線粒體自噬抑制劑(激動劑)治療急性腦缺血提供指導意義。另外，促進線粒體自噬的治療可能僅對線粒體自噬缺陷的PD患者有效，而鑒定線粒體自噬不足所致的疾病亞型例如檢測和分析患者線粒體自噬分子機制的生物學標志物可能有助于確定對上調線粒體自噬治療敏感的疾病亞型，從而可以開展針對性治療。

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(2016-06-20收稿 2016-07-13修回)

武漢市科技攻關計劃項目(編號為2013060602010270)作者單位：430060 武漢大學人民醫(yī)院神經內科[方聰聰 毛善平(通信作者)董慧敏 劉寶輝 王舜]

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1007-0478(2017)02-0165-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.025