馬瀾婧，張浩浩，丁美玲，張成博，倪耀宗，田祖宏，唐光波，竇建華，聶勇戰(zhàn)

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710032)

小鼠間斷性禁食模型的建立及其對(duì)葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響

馬瀾婧，張浩浩，丁美玲，張成博，倪耀宗，田祖宏，唐光波，竇建華，聶勇戰(zhàn)*

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710032)

目的 探尋穩(wěn)定、可靠替代傳統(tǒng)熱量限制的小鼠模型建立方法及其對(duì)葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響。方法將40只SPF級(jí)16周齡C57BL/6J小鼠(雌雄各半)隨機(jī)按性別及喂養(yǎng)方式分為四組。自由飲食組給予基礎(chǔ)飼料自由取食，間斷禁食組正常飲食和禁食各24 h交替進(jìn)行，禁食日可自由飲水。監(jiān)測(cè)各組小鼠體質(zhì)量和血糖變化情況，并與建模前和建模12周行經(jīng)腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和經(jīng)腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 小鼠間斷性禁食12周后，體質(zhì)量和空腹血糖未見明顯變化。腹腔注射葡萄糖后血糖上升幅度減輕，腹腔注射胰島素后血糖下降比例增加。與對(duì)照組相比，上述耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積均明顯減低(P< 0.05)。結(jié)論小鼠間斷性禁食后胰島素敏感性增加，糖耐量改善，且該造模方法操作簡(jiǎn)單，可作為替代傳統(tǒng)熱量限制模型的有效選擇。

熱量限制；間斷性禁食；葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)；胰島素

代謝綜合征是一組以中心性肥胖、脂質(zhì)代謝紊亂、高血壓、高血糖，胰島素抵抗為表現(xiàn)的癥候群。代謝綜合征是導(dǎo)致糖尿病、脂肪肝和心血管病的重要危險(xiǎn)因素[1]。飲食限制被認(rèn)為可逆轉(zhuǎn)代謝綜合征，可有效預(yù)防糖尿病及心腦血管疾病。建立飲食限制模型是研究代謝綜合征發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)的重要基礎(chǔ)。傳統(tǒng)熱量限制(calorie restriction，CR)是指在保證不發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良的基礎(chǔ)上，將每日攝取的總熱量限制到自由飲食的60% ～ 70%[2]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道CR可防治衰老相關(guān)慢性疾病。但是其動(dòng)物模型實(shí)施困難，難以精確控制，對(duì)其動(dòng)物模型的探索已成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容。

間斷性禁食(intermittent fasting，IF)，指的是通過自由攝食和禁食交替來達(dá)到限制熱量攝入的作用，通常采用隔日禁食，即正常飲食日和禁食日各24 h交替進(jìn)行[3]。目前已有多項(xiàng)臨床研究表明應(yīng)用該飲食療法可使機(jī)體胰島素敏感性增加，糖耐量改善，與40%熱量限制的保護(hù)性作用類似[4-6]。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)C57BL/6J小鼠行間斷性禁食，觀察間斷性禁食對(duì)小鼠體質(zhì)量、空腹血糖、糖耐量和胰島素敏感性的影響，旨在探索更加簡(jiǎn)便、操作性高的飲食限制動(dòng)物模型，作為替代熱量限制更為穩(wěn)定、可靠的選擇。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)16周齡C57BL /6J小鼠40只，雌雄各半，雄鼠體質(zhì)量26.20 ± 1.27 g，雌鼠體質(zhì)量21.82 ± 0.94 g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SCXK(軍)2012-0007】。小鼠飼養(yǎng)在第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(軍)2012-0023】，環(huán)境溫度：(22 ± 2)℃，相對(duì)濕度 50% ～ 60%，光照12 h/12 h明暗交替，每籠5只飼養(yǎng)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給以人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑和儀器

50%高糖注射液(湖北科倫藥業(yè)有限公司)，生理鹽水(山東辰欣藥業(yè)有限公司)，胰島素(優(yōu)泌林R，美國(guó)禮來公司)，血糖儀和試紙(新活力型，瑞士羅氏公司)。

1.3 造模方法

16周齡C57BL /6J小鼠隨機(jī)按性別及喂養(yǎng)方式分為四組，每組各10只。自由飲食(ad libitum，AL)組給予基礎(chǔ)飼料自由取食，間斷禁食組正常飲食和禁食各24 h交替進(jìn)行，禁食日可自由飲水?？紤]到小鼠晝夜節(jié)律的影響，固定于下午6：00供應(yīng)食物。

1.4 檢測(cè)及觀察指標(biāo)

1.4.1 體質(zhì)量及血糖

造模前及間斷性禁食開始后每周監(jiān)測(cè)空腹體質(zhì)量(fasting body weight，F(xiàn)BW)，每?jī)芍芡ㄟ^剪尾法用血糖儀監(jiān)測(cè)空腹血糖(fasted blood glucose，F(xiàn)BG)。

1.4.2 經(jīng)腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

實(shí)驗(yàn)前一日下午6：00至第二日早上10：00，小鼠禁食不禁水，一般禁食不超過16 ～ 18 h。小鼠稱重，按2 g/kg的劑量，腹腔注射葡萄糖。50%葡萄糖注射液用無菌去離子水配制成20%葡萄糖注射液，小鼠100 μL/10 g腹腔注射。分別檢測(cè)空腹16 h血糖和給葡萄糖后15、30、60、90、120 min血糖數(shù)值，觀察血糖變化趨勢(shì)。繪制曲線后計(jì)算曲線下面積(area under curve，AUC)。

1.4.3 經(jīng)腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)

實(shí)驗(yàn)當(dāng)天上午9：00至15：00，小鼠禁食不禁水，一般禁食不超過6 h。按1 U/kg(雌鼠0.75 U/kg)劑量腹腔注射短效胰島素，胰島素用無菌生理鹽水稀釋。分別檢測(cè)禁食6 h血糖及腹腔注射胰島素后15、30、60、90、120 min血糖數(shù)值，觀察和統(tǒng)計(jì)胰島素對(duì)血糖變化的影響。部分小鼠注射胰島素后會(huì)出現(xiàn)驚厥現(xiàn)象，出現(xiàn)此現(xiàn)象立即腹腔注射1 mL 20%葡萄糖注射液。實(shí)驗(yàn)操作終止。將注射胰島素后血糖下降比例繪制成曲線，計(jì)算曲線下面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量及血糖變化趨勢(shì)

每周監(jiān)測(cè)空腹體重，雌雄小鼠均維持在恒定水平，波動(dòng)小于5%體重(圖1A)；每?jī)芍軝z測(cè)空腹血糖，亦未見明顯下降趨勢(shì)(圖1B)。

圖1 小鼠體質(zhì)量和空腹血糖變化趨勢(shì)Fig.1 Changes of fasting body weight and fasting blood glucose in mice of each group

注：A.雄鼠造模前及禁食12周后AL組和IF組IPGTT；B. 雌鼠造模前及禁食12周后AL組和IF 組IPGTT；C. 雄鼠各組IPGTT對(duì)應(yīng)的AUC；D.雌鼠各組IPGTT對(duì)應(yīng)的AUC；*P < 0.05。圖2 各組小鼠經(jīng)腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)Note. A: IPGTT of male mice before and 12 weeks after AL or IF treatment. B: IPGTT of female mice before and 12 weeks after AL or IF treatment. C: AUC of IPGTT for male mice in each group. D: AUC of IPGTT in female mice in each group. *P < 0.05.Fig.2 Results of intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) in mice of each group

2.2 經(jīng)腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

間斷性禁食前及造模12周后，行經(jīng)腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)。無論雌雄小鼠，與造模前基線值相比， AL組注射葡萄糖后血糖上升幅度相同，曲線下面積無明顯改變，IF組血糖上升幅度則明顯降低，曲線下面積差距差異有顯著性(P< 0.05)；IF組與同周齡AL組相比，曲線下面積亦明顯降低，下降程度差異有顯著性(P< 0.05)(圖2)。證明間斷性禁食可改善小鼠糖耐量。

2.3 經(jīng)腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

間斷性禁食前及造模12周后，行經(jīng)腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。無論雌雄小鼠，與造模前基線值相比， AL組注射胰島素后血糖下降幅度相同，曲線下面積無明顯改變，IF組血糖下降比例明顯增加，曲線下面積差距差異有顯著性(P< 0.05)；IF組與同周齡AL組相比，注射胰島素后血糖下降比例顯著增加，整體曲線下面積下降程度差異有顯著性(P< 0.05)(圖3)。證明小鼠間斷性禁食后胰島素敏感性增加。

注：A.雄鼠造模前及禁食12周后AL組和IF組IPITT；B. 雌鼠造模前及禁食12周后AL組和IF 組IPITT；C.雄鼠各組IPITT對(duì)應(yīng)的AUC；D.雌鼠各組IPITT對(duì)應(yīng)的AUC；*P < 0.05。圖3 各組小鼠經(jīng)腹腔注射胰島素耐量實(shí)驗(yàn)Note. A: IPITT of male mice before and 12 weeks after AL or IF treatment. B: IPITT of female mice before and 12 weeks after AL or IF treatment. C: AUC of IPITT for male mice in each group. D: AUC of IPITT in female mice in each group. *P < 0.05.Fig.3 Results of intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT) in mice of each group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中每周監(jiān)測(cè)空腹體重，每?jī)芍軝z測(cè)空腹血糖，雌雄小鼠均維持在恒定水平，未見明顯下降趨勢(shì)。回顧文獻(xiàn)，IF可降低糖尿病SD大鼠的空腹血糖[7]。正常雄性SD大鼠IF 16周后，體質(zhì)量無明顯變化[8]；另一項(xiàng)研究[9]發(fā)現(xiàn)正常雄性SD大鼠IF 24周后，體質(zhì)量下降；兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)空腹血糖均未見降低。臨床試驗(yàn)中，正常體重受試者，雖然糖尿病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)因素改善，但是空腹血糖未改變[4，5]；體質(zhì)量方面，IF2周后未見降低[4]；另一項(xiàng)試驗(yàn)中，男性非肥胖受試著IF 3周后體質(zhì)量降低，女性受試者未見改變[5]。超重或肥胖者IF 6月后體質(zhì)量明顯下降[6]。結(jié)合文獻(xiàn)分析，本實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量和空腹血糖未下降，一方面是由于選用的正常非肥胖小鼠，另一方面可能是由于IF持續(xù)時(shí)間不夠長(zhǎng)。同時(shí)說明IF的保護(hù)性作用不依賴體質(zhì)量的下降。有意思的是，由于IF組小鼠在攝食日食量增加，幾乎達(dá)到自由飲食組小鼠的兩倍，所以也說明IF保護(hù)性作用亦不依賴攝入熱量的減少。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到無論雌雄小鼠IF 12周后糖耐量和胰島素敏感性均改善?；仡櫸墨I(xiàn)，Heilbronn 等[5]觀察發(fā)現(xiàn)正常體質(zhì)量受試者IF 3周后，女性葡萄糖曲線下面積增加，而男性卻未見明顯變化，表明短期IF后，男性可能比女性更受益。筆者分析由于該臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間較短，故女性未見明顯受益。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于IF 12周后再行IPGTT，時(shí)間較Heilbronn 等的臨床實(shí)驗(yàn)大大延長(zhǎng)，故雌鼠亦觀察到明顯糖耐量改善。另一方面，對(duì)于AL組IF前和3月后的IPGTT/IPITT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看到對(duì)于正常體質(zhì)量C57BL /6J小鼠，月齡對(duì)于糖耐量和胰島素敏感性無明顯影響。

關(guān)于該動(dòng)物模型對(duì)代謝內(nèi)穩(wěn)態(tài)的保護(hù)性作用，尚有其他可完善的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。比如小鼠血壓和心率等生命體征；游離脂肪酸、甘油三酯、膽固醇和高低密度脂蛋白水平等生化指標(biāo)；以及胰島素、瘦素、脂聯(lián)素、腦腸肽、胰島素樣生長(zhǎng)因子1[10]等激素水平。由于實(shí)驗(yàn)條件及經(jīng)費(fèi)限制未能完成。

本實(shí)驗(yàn)小鼠采用隔日禁食的飲食限制方法連續(xù)進(jìn)行12周后，小鼠生存狀況良好，糖耐量和胰島素敏感性改善，對(duì)于葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)達(dá)到與熱量限制類似的保護(hù)性作用，與臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，證明該造模方法有效可行。

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Establishment of a mouse model of intermittent fasting andcharacterization of its effect on glucose homeostasis

MA Lan-jing, ZHANG Hao-hao, DING Mei-ling, ZHANG Cheng-bo, NI Yao-zong, TIAN Zu-hong,TANG Guang-bo, DOU Jian-hua, NIE Yong-zhan*

(The State Key Laboratory of Cell Biology, Xi Jing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi’An 710032, China)

Objective To establish a stable and reliable mouse model as an alternative to the traditional model of impaired glucose tolerance induced by calorie restriction and its effect on glucose homeostasis. Methods Forty 16-week-old SPF C57BL/6J mice (half male and half female) were randomly divided into four groups by sex and the way of feeding. The mice in the ad libitum (AL) group had free access to basic diet, while the mice in the intermittent fasting (IF) group had normal diet and fasting on alternate days, with free access to water on the fasting days. The changes of body weight and blood glucose concentration in each group were monitored, and intraperitoneal glucose tolerance test and insulin tolerance test in mice were performed before and after the 12-week IF treatment. Results At 12 weeks after IF treatment, the body weight and blood glucose concentration of mice did not show significant difference. After i.p. injection of glucose, the blood glucose concentration of IF mice was less increased than the AL group, and after the insulin injection, the blood glucose concentration was more decreased. Compared to the AL group, the areas under the curve of tolerance test in the IF group were significantly decreased (P< 0.05). Conclusions After IF treatment, the mice show an enhanced sensitivity to insulin and improved glucose tolerance. This establishment method of mouse model of intermittent fasting is easy and simple, therefore, can be used as an effective alternative to traditional calorie restriction model of impaired glucose tolerance.

Caloric restriction; Intermittent fasting; Glucose homeostasis; Insulin

國(guó)家自然科學(xué)基金重大國(guó)際合作項(xiàng)目(編號(hào)：81120108005)。

馬瀾婧(1987-)，女，碩士生，研究方向：肝臟糖脂代謝。Email: malanjing@sohu.com

聶勇戰(zhàn)(1970-)，男，教授，博士，研究方向：肝臟糖脂代謝。

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0024-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.005

2016-12-31