郝 珉，宋 文，路 苓

（棗莊市立醫(yī)院兒科，山東棗莊277100）

孟魯司特鈉對(duì)支氣管哮喘患兒Th17/Treg細(xì)胞平衡及肺功能的影響

郝 珉，宋 文，路 苓

（棗莊市立醫(yī)院兒科，山東棗莊277100）

目的觀(guān)察孟魯司特鈉對(duì)支氣管哮喘患兒Th17/Treg細(xì)胞平衡及肺功能的影響。方法選取120例支氣管哮喘患兒，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組60例。所有患兒給予丙酸氟替卡松等常規(guī)治療，實(shí)驗(yàn)組加用孟魯司特鈉治療。分別于治療前和治療3個(gè)月后檢測(cè)和比較患兒的Th17、Treg細(xì)胞及其IL-17、IL-10和TGF-β1等細(xì)胞因子和肺功能。結(jié)果（1）所有患兒治療后Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17水平和PEF肺功能指標(biāo)均有顯著下降，Treg細(xì)胞及其分泌的IL-10和TGF-β1水平和FEV1、FEV1/FCV肺功能指標(biāo)均有顯著升高（P＜0.01）。且經(jīng)過(guò)孟魯司特鈉治療的實(shí)驗(yàn)組患兒的Th17細(xì)胞、IL-17水平和PEF的下降及Treg細(xì)胞、IL-10和TGF-β1水平、FEV1和FEV1/FCV的升高較對(duì)照組患兒更為明顯（P＜0.05或0.01）。（2）Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Th17細(xì)胞與FEV1、FEV1/FCV呈負(fù)相關(guān)，與PEF呈正相關(guān)；而Treg細(xì)胞與FEV1、FEV1/FCV呈正相關(guān)，與PEF呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論孟魯司特鈉可有效調(diào)節(jié)支氣管哮喘患兒的Th17/Treg細(xì)胞平衡，改善其肺功能，且Th17/Treg細(xì)胞與肺功能存在相關(guān)性。

孟魯司特鈉；支氣管哮喘；Th17；Treg；肺功能

支氣管哮喘是一種常見(jiàn)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，是多種免疫因素參與發(fā)病過(guò)程。Th1/Th2失衡是哮喘最經(jīng)典的免疫學(xué)說(shuō)，但近年來(lái)的研究表明Th17、調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞在其發(fā)病中亦發(fā)揮著重要的作用。Th17細(xì)胞可通過(guò)其分泌的IL-17等效應(yīng)因子可以刺激哮喘炎癥反應(yīng)，加重氣道高反應(yīng)性；而Treg細(xì)胞通過(guò)其分泌的IL-10、TGF-β1等效應(yīng)因子則發(fā)揮著免疫抑制作用。Th17和Treg細(xì)胞的作用相互拮抗，兩者失衡將加重氣道炎癥，導(dǎo)致哮喘發(fā)作[1-2]。孟魯司特鈉作為白三烯受體拮抗劑，可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)及氣道重塑，達(dá)到控制哮喘的目的。本研究通過(guò)觀(guān)察孟魯司特鈉與支氣管哮喘患兒Th17/Treg細(xì)胞平衡的關(guān)系，探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2013年1月～2015年1月在3所醫(yī)院兒科哮喘門(mén)診初診的120例支氣管哮喘患兒，均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組修訂的“兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)”。所有患兒來(lái)診前均無(wú)糖皮質(zhì)激素吸入治療史，不伴有急性感染，1個(gè)月內(nèi)無(wú)口服或靜脈使用糖皮質(zhì)激素等調(diào)節(jié)免疫藥物，不伴有其他免疫性疾病。120例患兒隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組60例。兩組患兒的性別構(gòu)成、年齡及疾病嚴(yán)重程度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 治療方法所有患兒給予丙酸氟替卡松吸入氣霧劑（輔舒酮，葛蘭素史克制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20010387）吸入治療，初始劑量為50μg或100μg bid，然后根據(jù)治療效果調(diào)整劑量至哮喘控制或降低至最小有效劑量。哮喘急性發(fā)作期可給予沙丁胺醇（萬(wàn)托林，葛蘭素史克制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字：H10940001）、異丙托溴銨（愛(ài)全樂(lè)，德國(guó)Boehringer Ingelheim Pharma GmbH&Co.KG，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20130135）等吸入治療。實(shí)驗(yàn)組患兒每天加用4 mg孟魯司特鈉咀嚼片（順爾寧，Merck Sharp&Dohme Limited，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20070058），睡前口服。分別于治療前和治療3個(gè)月后檢測(cè)和比較患兒的Th17/Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子和肺功能。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 Th17、Treg細(xì)胞的檢測(cè)[3]

（1）制備單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。抽取5 mL患兒靜脈血，置肝素抗凝管中。離心后取血漿置-80℃冷凍保存待測(cè)IL-17、IL-10和TGF-β1；采用Ficoll密度梯度離心法分離出PBMC，重懸細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度為2×106/mL。將PBMC懸液置于24孔培養(yǎng)板中，每孔依次加入20 ng/mL的佛波酯、1μg/mL的離子霉素和2 nmol/ mL的莫能星后，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。離心、PBS洗滌細(xì)胞后，分別取1×106PBMC置兩組實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管中待測(cè)Th l7和CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞。

（2）流式細(xì)胞檢測(cè)。Th 17組的實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管中分別加入FITC抗人CD 4 mAb，Treg組加入FITC抗人CD4 mAb和APC抗人CD25 mAb予細(xì)胞表面抗原染色，室溫避光孵育半小時(shí)。予PBS洗滌、固定、穿膜等處理，350 g離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞，每管200μL。Th 17組實(shí)驗(yàn)管中加入10 μLPE抗人IL-17 mAb，Treg組加入PE抗人Foxp3抗體予胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，對(duì)照管中加入同型對(duì)照抗體。Th17組和Treg組分別在室溫下和4℃下避光孵育1小時(shí)，洗滌后重懸細(xì)胞，24 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析。采用CD4直方圖設(shè)門(mén)區(qū)分出CD4+細(xì)胞，CD4、CD25設(shè)門(mén)區(qū)分出CD4+CD25+細(xì)胞，以IL-17、FOXP3+染色陽(yáng)性判定Thl7細(xì)胞，CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞。采用Cellsquest軟件散點(diǎn)圖分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。細(xì)胞流式檢測(cè)抗體及試劑購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。1.3.2血漿IL-17、IL-10、TGF-β1水平的檢測(cè)將-80℃冷凍保存的血漿置室溫半小時(shí)后，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血漿中的IL-17、IL-10、TGF-β1水平，所需試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Source公司，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)實(shí)施。

1.3.3 肺功能的檢測(cè)應(yīng)用德國(guó)小兒耶格肺功能儀檢測(cè)患兒的FEV1（第1秒用力呼氣量）、FEV1/FCV（第1秒用力呼量占用力肺活量比值）和PEF（呼氣峰流速）等肺功能指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用“s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后Th17/Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子的比較本研究中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患兒的Th17和Treg細(xì)胞及IL-17、IL-10和TGF-β1水平均無(wú)明顯差異。經(jīng)過(guò)常規(guī)治療及孟魯司特鈉治療后，兩組患兒的Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17水平均有顯著下降，Treg細(xì)胞及其分泌的IL-10和TGF-β1水平均有顯著升高（P＜0.01）。且經(jīng)過(guò)孟魯司特鈉治療的實(shí)驗(yàn)組患兒的Th17細(xì)胞、IL-17水平的下降及Treg細(xì)胞、IL-10和TGF-β1水平的升高較對(duì)照組患兒更為明顯（P＜0.05或0.01）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患兒治療前后Th17/Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子的比較（x±s）Table1 Comparison of Th17/Treg cells and theircytokines in both groups before and after treatment（x±s）

2.2 治療前后患兒肺功能的比較本研究中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患兒的FEV1、FEV1/FCV和PEF均無(wú)明顯差異。經(jīng)過(guò)常規(guī)治療及孟魯司特鈉治療后，兩組患兒的FEV1和FEV1/FCV均有顯著升高，PEF均有顯著下降（P＜0.01）。且經(jīng)過(guò)孟魯司特鈉治療的實(shí)驗(yàn)組患兒的FEV1、FEV1/FCV的升高和PEF的下降較對(duì)照組患兒更為明顯（P＜0.05或0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 Th17/reg細(xì)胞與肺功能的相關(guān)性研究Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（r=-0.694，P＜0.05）。Th17細(xì)胞與FEV1、FEV1/FCV呈負(fù)相關(guān)，與PEF呈正相關(guān)；而Treg細(xì)胞與FEV1、FEV1/FCV呈正相關(guān)，與PEF呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 兩組治療前后肺功能的比較（s）Table2 Comparison oflung function before and aftertreatmentin both groups（±s）

表2 兩組治療前后肺功能的比較（s）Table2 Comparison oflung function before and aftertreatmentin both groups（±s）

注：t1為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組治療前的比較，t2為實(shí)驗(yàn)組治療前、后的比較，t3為對(duì)照組治療前、后的比較，t4為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組治療后的比較，bP＜0.05，aP＜0.01

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表3 Th17/Treg細(xì)胞與肺功能的相關(guān)性Table3 Th17/Treg cells and lung function

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，多種氣道炎性細(xì)胞和炎癥因子參與其發(fā)病過(guò)程中。Th1/Th2平衡在支氣管哮喘的過(guò)程中作用關(guān)鍵，當(dāng)Th2占主導(dǎo)地位時(shí)，可趨化嗜酸性粒細(xì)胞，造成其在氣道內(nèi)浸潤(rùn)而引起炎癥。近年來(lái)研究表明，中性粒細(xì)胞亦是支氣管哮喘的重要炎性細(xì)胞，Th17和Treg細(xì)胞及其標(biāo)志性因子IL-17、IL-10和TGF-β1在中性粒細(xì)胞型哮喘的發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色[4]。

Thl7細(xì)胞所分泌主要細(xì)胞因子是IL-17，肺內(nèi)IL-17水平的升高可引起氣道高反應(yīng)性。IL-17作為促炎癥因子，結(jié)合受體后，可誘導(dǎo)細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、TGF-β、TNF-ɑ等炎性因子，經(jīng)過(guò)NF-κB和MAPK途徑趨化中性粒細(xì)胞，最終引起氣道重塑。IL-17還可以刺激黏液素基因的表達(dá)，增加氣道黏液分泌。此外，IL-17還能活化Th2細(xì)胞，趨化嗜酸性粒細(xì)胞，產(chǎn)生IgE，影響Th1/Th2平衡。調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞（Treg細(xì)胞）在免疫過(guò)程中發(fā)揮反向調(diào)節(jié)作用，維持著免疫平衡。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是其主要分型，叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（FOXP3）是它的特征性標(biāo)志。它的主要功能特征是免疫無(wú)能性和免疫抑制性，可以通過(guò)表面因子與靶細(xì)胞受體結(jié)合而直接抑制免疫，還能通過(guò)分泌IL-10、TGF-β1等細(xì)胞因子的介導(dǎo)發(fā)揮免疫作用[5-7]。Th17細(xì)胞可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而Treg細(xì)胞可以抑制免疫強(qiáng)度，降低免疫損傷。TGF-β可誘導(dǎo)CD4+細(xì)胞分化為T(mén)reg細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥時(shí)，IL-6和TGF-β又可誘導(dǎo)CD4+細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞。Th17/Treg細(xì)胞的平衡對(duì)于哮喘患兒氣道炎癥的進(jìn)展非常重要。

孟魯司特鈉是一種白三烯受體拮抗劑，可切斷白三烯與受體的結(jié)合，阻斷炎癥反應(yīng)，減少黏液分泌，抑制氣道內(nèi)細(xì)胞增生，避免氣道重塑。研究表明，孟魯司特鈉可以降低IL-4的濃度，抑制TGF-β的產(chǎn)生，減少CD4+細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞。此外，孟魯司特鈉能刺激IFN-γ的產(chǎn)生，減少Th17細(xì)胞的分化。孟魯司特鈉還能促進(jìn)IL-10、TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)CD4+細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞[8-12]。本研究中，經(jīng)過(guò)孟魯司特鈉治療，實(shí)驗(yàn)組患兒的Th17細(xì)胞、IL-17水平較對(duì)照組患兒明顯下降，而Treg細(xì)胞、IL-10和TGF-β1水平明顯升高，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)常規(guī)治療及孟魯司特鈉治療后，實(shí)驗(yàn)組患兒的FEV1和FEV1/FCV較對(duì)照組顯著升高，而PEF顯著下降。且Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；Th17細(xì)胞與FEV1、FEV1/FCV呈負(fù)相關(guān)，與PEF呈正相關(guān)；而Treg細(xì)胞與FEV1、FEV1/FCV呈正相關(guān)，與PEF呈負(fù)相關(guān)。表明孟魯司特鈉可以通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞起到改善肺功能的作用。

綜上所述，孟魯司特鈉可以切斷白三烯與受體的結(jié)合，抑制氣道炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的免疫平衡，起到控制哮喘的作用。

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The influence ofmontelukaston the balance of Th17/ Treg and lung function ofchildren with bronchialasthma

Hao Min,Song Wen,Lu Ling
（Departmentof Pediatrics,Zaozhuang MunicipalHospital,Zaozhuang，Shandong，277100,China）

Objective To observe the influence of montelukaston the balance of Th17/Treg and lung function of children with bronchialasthma. Methods 120 children with bronchialasthma were selected and randomLy divided into the experimentalgroup and the controlgroup and 60 cases in each group.Allpatients were given fluticasone propionate and otherconventionaltreatments.The patients in the experimentalgroup were given montelukastadditionally.Determine and compare the quantity of Th17 and Treg cells,the levelof IL-17,IL-10,TGF-β1and the lung function before treatmentand 3 months later.Results（1）There are significantdecline in the quantity of Th17 cells,the levelof IL-17 and PEF,increase in the quantity of Treg cells,the levelof IL-10,TGF-β1and FEV1,FEV1/FCV of allpatients after treatment(P＜0.01).Itis significanthigher in the quantity of Th17 cells,the levelof IL-17 and PEF,lower in the quantity of Treg cells,the levelof IL-10,TGF-β1and FEV1,FEV1/FCV of patients in the experimental group than in the control group after treatment of montelukast(P＜0.05 or 0.01).（2）Th17 cells are negatively related to Treg cells(P＜0.05).Th17 cells are negatively related to FEV1,FEV1/FCV and positively related to PEF(P＜0.05).Treg cells are positively related to FEV1,FEV1/FCV and negatively related to PEF(P＜0.05).Conclusion Montelukast can modulate the balance of Th17/Treg of children with bronchial asthma,and improve their lung function.There are correlation between Th17/Treg cells and lung function.

Montelukast;Bronchialasthma;Th17;Treg;Lung function

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.21.004

郝珉,E-mail：walkonsnow@sina.com