唐莉娟馬 博劉 景周鴻淼張 振

(1.巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學院,新疆庫爾勒 841000;2.石河子大學動物科技學院,新疆石河子 832000;3.新疆疆南牧業(yè)有限公司,新疆喀什 843900)

結(jié)核分枝桿菌硫酸化酶基因的克隆及其原核表達、鑒定及純化

唐莉娟1馬 博1劉 景2周鴻淼1張 振3

(1.巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學院,新疆庫爾勒 841000;2.石河子大學動物科技學院,新疆石河子 832000;3.新疆疆南牧業(yè)有限公司,新疆喀什 843900)

本文擬對結(jié)核分枝桿菌ATP硫酸化酶基因進行原核表達，并鑒定其抗原性。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌H37Rv ATP硫酸化酶（cysD）基因設(shè)計引物，擴增出大小約為999bp的目的基因片段。將PCR純化產(chǎn)物克隆至PMD18-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體PMD18-T-cysD。以SacⅠ和HindⅢ雙酶切重組載體PMD18-T- cysD 和表達載體pET-32a（+），并將純化的cysD基因亞克隆至pET-32a（+）中，構(gòu)建出原核重組表達質(zhì)粒pET-32a-cysD。將pET-32a-cysD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coli BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析，可見約55KD目的蛋白帶。用Western blot分析方法鑒定該蛋白。結(jié)果顯示純化后所獲得的融合蛋白與抗結(jié)核分支桿菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。表明研究成功構(gòu)建了pET-32a-cys原核表達載體，純化的融合蛋白具有良好的免疫原性。

結(jié)核桿菌 硫酸化酶基因 原核表達

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界約有三分之一的人口被結(jié)核菌感染，每年約有800萬～1000萬新增結(jié)核病患者中，大約有300萬人因此而死亡[1]。1998年，法國巴斯德研究所完成了結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組全序列的測定工作，從而也是結(jié)核桿菌的研究進入了后基因時代，這使得在分子水平尋找新的抗結(jié)核靶點提供了可能。結(jié)核桿菌的硫代謝與它的毒力和氧化物耐受性有關(guān)，而ATP硫酸化酶能夠活化硫代謝中的腺苷酰硫酸和焦磷酸反應(yīng)，編碼ATP硫酸化酶的基因就是cysD[3]。本研究擬克隆cysD基因并構(gòu)建pET-32a-cysD重組質(zhì)粒，進行誘導(dǎo)表達，對獲得的目的蛋白進行抗原性分析，以期該重組蛋白為結(jié)核病診斷和尋找新的藥物靶點提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株、質(zhì)粒及其他試劑：結(jié)核桿菌菌株H37Rv由石河子大學人畜共患病實驗室惠贈。載體PMD-18-T和pET-32a、大腸桿菌 BL21（DE3）和JM109為本實驗室保存。Taq DNA聚合酶、SacⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收純化試劑盒等購自上海生工公司。

1.2 方法與結(jié)果

（1）引物。根據(jù)Genbank中序列，設(shè)計硫酸化酶cysD基因編碼區(qū)上下游引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。P1：5-gag ctc atg gca ata acc ata aat atg gtc-3，P2：5-aag ctt tca gaa gta tcc ctg ccg c-3，

應(yīng)用上述引物，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板進行PCR擴增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，得到cysD大小約999bp的目的基因，與預(yù)期大小一致。

（2）cysD基因PCR擴增及表達載體的構(gòu)建

結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提取，按照DNA快速提取試劑盒提供的說明書進行。以H37Rv基因組DNA為模板，應(yīng)用上述引物，PCR擴增cysD基因，反應(yīng)條件為94℃ 4min；94℃ 1min，56℃1min，72℃ 1min 循環(huán)30次；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿法抽提、乙醇沉淀后，雙酶切，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后，與相同酶切的PMD18-T 載體連接，培養(yǎng)于氨芐西林瓊脂平板，次日跳去克隆，提取質(zhì)粒。挑取酶切鑒定正確的克隆由上海生工生物有限責任公司進行測序，陽性克隆命名為 pET-32acysD。

（3）pET-32a- cysD融合蛋白的表達。將pET-32a- cysD轉(zhuǎn)化至DE3，涂布于含55μg/ml氨芐西林的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行PCR鑒定，將鑒定正確的菌斑接種于含30μg/ml氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌過夜取200ul接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37℃分別誘導(dǎo)0h，2h，4h，5.5h，6h，測定OD值分別是0.266、1.032、1.079、1.157、1.169?？梢娬T導(dǎo)重組菌相對大腸桿菌DE3和未誘導(dǎo)重組菌多出一條表達帶，分子量約45KD（圖1）。

圖1 cyD重組質(zhì)粒的蛋白表達鑒定

（4）pET-32a- cysD融合蛋白的Westernblot鑒定。將pET-32a-cysD以及陰性對照大腸桿菌DE3經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDG膜上，可見誘導(dǎo)重組菌pET-32a- cysD在約55KD處明顯被抗體所撲獲。一抗共采用兩種，一是抗His標簽的單抗，另一種一抗是人的結(jié)核陽性血清，Western blot實驗結(jié)果見圖2。

圖2 重組菌表達Western-Blot電泳結(jié)果

3 討論

近十年來，多藥耐藥和廣泛耐藥型結(jié)核桿菌引起的肺結(jié)核病例越來越多。目前，尋找新的抗結(jié)核靶點以及相關(guān)藥物成為抗結(jié)核藥物研究領(lǐng)域的熱點。自1998年結(jié)核桿菌的基因序列被破解以來，人們加深了對結(jié)核桿菌的認識，先后發(fā)現(xiàn)了大批新的抗結(jié)核靶點，其中不乏一些潛在的藥物靶點。在結(jié)核桿菌中，結(jié)核桿菌的毒力和氧化物耐受性均受到硫代謝的影響，代謝中半脫氨酸的合成過程對結(jié)核桿菌的感染有正向調(diào)節(jié)的左右，這也為這也為抗結(jié)核菌藥的篩選提供了新的靶標。另外，微生物的硫代謝途徑大多不存在于人體內(nèi)。因此，微生物的硫代謝途徑被認為是一個有潛力的抗結(jié)核領(lǐng)域。

本實驗構(gòu)建了含有結(jié)核桿菌硫酸化酶cysD基因的原核表達載體pET-32a-cysD，并在大腸桿菌DE3中進行了誘導(dǎo)表達。原核表達要求簡單且表達效率較高，結(jié)果顯示pET-32acysD融合蛋白在低溫誘導(dǎo)下為可溶性表達，并且Western-blot證實融合蛋白可與抗His標簽的單抗、人的結(jié)核陽性血清特異結(jié)合。融合蛋白的成功表達，為應(yīng)用硫酸化酶cysD基因進行下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

[1] Zhou M，Xie L，Yang Z，Zhou J，Xie J. HYPERLINK “http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27023679” Lysine Succinylation of Mycobacterium tuberculosis Isocitrate Lyase（ICL）fine-tunes the Microbial Resistance to Antibiotics[J].J Biomol Struct Dyn. 2016，（29）：1-40.

[2] Vladimirsky MA，Shipina LK，Makeeva ES，Alyapkina YS，Mikheev AY，Morozov VN. HYPERLINK “http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27021397”Application of water-soluble nanofilters for collection of airborne Mycobacterium tuberculosis DNA in hospital wards[J].J Hosp Infect.，2016，（2）：9.

[3] Peeling PW，Smith PG，Bossuyt PM. A guide for diagnostic e-valuations[J].Nat Rev Microbiol.，2006，4（12）：2-6.

[4] Cole ST，Brosch R，Parkhill J，et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence[J].Nature.，1998，393（6685）：537-544.

[5] Rachel Pinto，Quing Xui Tang，Warwick J. The Mycobacterium tuberculosis cysD and cysNC genes form a stress-induced operon that encodes a tri-functional sulfate-activating complex[J]. Microbiology.，2004，（150）：1681-1686.