曾 俊,楊瑞山,蔡曉洋,周海玉,黃 珍,王 盼,李 敏

(成都中醫(yī)藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室,四川成都 611137)

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俄色葉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

曾 俊,楊瑞山,蔡曉洋,周海玉,黃 珍,王 盼,李 敏*

(成都中醫(yī)藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室,四川成都 611137)

目的:研究俄色葉提取物對小鼠酒精性肝損傷的保護作用。方法:采用體積分數為50%的乙醇一次性灌胃造成小鼠急性肝損傷,檢測各組小鼠血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)的水平,及肝組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平的變化,同時HE染色觀察肝臟組織學改變。結果:俄色葉提取物能不同程度地降低小鼠血清中ALT、AST、TG、LDL-C水平,減少肝勻漿MDA含量,升高肝勻漿SOD、GSH-Px的活性。病理切片顯示各給藥組小鼠肝組織損傷均有不同程度的減輕。結論:俄色葉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷有一定的保護作用。

藏藥,俄色葉,酒精性肝損傷,保護作用

酒精性肝病(ALD)是世界范圍內導致急慢性肝病的主要原因[1],ALD及其并發(fā)癥也是最常見的死因之一[2]。酒精的濫用和依賴導致的ALD病譜包括脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化,甚至可發(fā)展至肝癌。ALD發(fā)病機制復雜,首先肝臟是機體乙醇代謝的主要場所,在乙醇代謝過程中,產生氧化應激損傷肝臟,氧化應激損傷有可能誘發(fā)脂質過氧化,進一步損傷肝臟;氧化應激亦可能引起肝細胞凋亡與再生,長期飲酒不僅會導致肝細胞凋亡,還可抑制患者的肝細胞增殖,導致ALD發(fā)生發(fā)展[3]。隨著現代人們生活方式的變化,ALD對人類健康產生了嚴重的威脅,但目前尚無FDA 批準的有效藥物療法。而大量非傳統(tǒng)藥物也有可能被證明為有效藥物,因此開發(fā)安全有效的能夠預防ALD的食品或保健品意義重大[4]。

“俄色葉”來源于薔薇科蘋果屬植物變葉海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.和花葉海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid. 的干燥葉及葉芽[5]。在甘孜州藏區(qū),俄色葉雖為藏族民間習用藥材,但俄色葉的食用歷史較長,其食品標準已在四川省衛(wèi)生廳備案。近年來俄色葉在食品、保健食品及藥品方面的使用量逐年增加,爐霍縣林業(yè)局已將其開發(fā)成保健茶“雪域俄色茶”,并已成為國家地理標志性產品。主要有攻堅化積、除膩滌滯、保肝利膽等功效,主治消化不良、高血壓、高血糖、高血脂及一些肝臟疾病[6-7]。現代研究表明俄色葉對CCl4引起的小鼠急性肝損傷具有很好的保護作用[8],其果實“俄色果”對急性酒精性肝損傷有一定的保護作用[9]。目前主要將俄色葉應用于降血壓、降血脂和降血糖等方面,對于保肝方面的研究較少。本實驗建立小鼠急性酒精性肝損傷的模型,通過觀察給予俄色葉提取物后小鼠生化、病理的改變,探討俄色葉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷有無保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明種小鼠 117只,體重(22±2) g,由成都達碩實驗動物有限公司提供,動物質量合格證號:SCXK(川)2013-24；俄色葉 四川省爐霍縣雪域俄色有限公司提供,經成都中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為薔薇科蘋果屬植物變葉海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes或花葉海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid的干燥葉及葉芽;聯(lián)苯雙酯滴丸(DDB) 浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司,批號:A02140302;低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)檢測試劑盒 南京建成工程研究所,批號分別為:20150420、20150420、20150521、20150417;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒 Abcam公司,批號分別為:Rm0739XL、Rm1377XL、Rm0149XL。

Mk3多功能酶標儀 美國賽默飛世爾儀器有限公司;DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;X-22R冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;圖像分析軟件Motic Images Advanced。

1.2 實驗方法

1.2.1 受試樣品的制備 稱取花葉海棠葉、變葉海棠葉干燥粉末(過三號篩),加入20倍體積蒸餾水,加熱回流提取2 h,紗布慮過,重復提取3次,合并濾液,濃縮成含生藥0.5 g/mL的藥液,生理鹽水溶解,得到不同濃度的提取液。

1.2.2 動物分組、給藥與模型制備 將117只雄性小鼠適應性喂養(yǎng)4 d后隨機分為9組,每組13只:正常對照組,模型組,陽性對照組(DDB組,150 mg/kg),花葉海棠、變葉海棠各劑量組(0.6、1.2、2.4 g/kg)。受試樣品用生理鹽水配制,各組小鼠按0.2 mL/10 g體重灌胃容量來計算,正常對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水,按順序每天灌胃一次受試樣品,連續(xù)30 d,灌胃后自由飲食。實驗至第31 d,除正常對照組給予等體積蒸餾水外,陽性對照組、實驗組及模型組以12 mL/kg的量,用50%體積分數的乙醇溶液按順序灌胃,建立小鼠急性肝損傷模型。

1.2.3 一般情況觀察 實驗期間觀察小鼠的精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)光澤度及死亡等情況,并記錄進食量和飲水情況。

1.2.4 指標測定 末次灌胃后,小鼠禁食不禁水16 h,去除死亡小鼠,按原先給藥順序各組取8只小鼠摘眼球采血,分離血漿,取血清,按照試劑盒說明書分別測定血清中的ALT、AST、TG和LDL-C水平;準確稱取肝臟相同部位0.2 g,以1∶9(m/V)的生理鹽水制成肝勻漿,按照試劑盒說明書分別測定肝組織中MDA、SOD和GSH-Px水平。

1.2.5 肝臟病理組織學檢查 取小鼠肝臟左葉,4 ℃生理鹽水沖盡殘血,濾紙拭干,4%多聚甲醛固定液固定,石蠟包埋切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學變化。

2 結果與分析

2.1 一般情況觀察及死亡率

給予50%的乙醇染毒后,小鼠多先表現出興奮狀態(tài),繼而行走不穩(wěn),四肢癱軟,重者嗜睡、醉倒、呼吸急促、抽搐,此狀態(tài)持續(xù)2 h左右。12 h后觀察死亡情況,死亡率結果見表1。由表1可知,各給藥組均能明顯降低乙醇染毒后小鼠的死亡率。結果表明俄色葉提取物具有良好的保肝作用。

表1 俄色葉提取物對急性酒精性肝 損傷小鼠死亡率的影響(n=13)Table 1 Effects of Eseye extracts on mortality of mice with acute alcoholic liver damage(n=13)

2.2 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST、TG、LDL-C水平的影響

與正常對照組相比,模型組小鼠的ALT、AST、TG、LDL-C均顯著升高(p<0.01)。與模型組相比,除花葉海棠高劑量組小鼠的AST和變葉海棠低劑量組小鼠的TG無顯著差異外,其余各給藥組血清中ALT、AST、TG、LDL-C均顯著降低(p<0.05或p<0.01)。見表2。

表2 俄色葉提取物對急性酒精性肝損傷小鼠血清中 ALT、AST、TG、LDL-C 水平的影響Table 2 Effects of Eseye extracts on the level of ALT,AST,TG,LDL-C in mice serum with acute alcoholic liver ±s,n=8)

注:與正常對照組比較:**p<0.01,*p<0.05;與模型組比較:##p<0.01,#p<0.05。

表3 俄色葉提取物對急性酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、SOD、GSH-Px水平的影響±s,n=8)Table 3 Effects of Eseye extracts on the level of MDA,SOD,GSH-Px in mice liver homogenate with acute alcoholic liver ±s,n=8)

注:與正常對照組比較:**p<0.01,*p<0.05;與模型組比較:##p<0.01,#p<0.05。2.3 對急性酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

與正常對照組相比,模型組小鼠的MDA含量顯著升高(p<0.01),SOD、GSH-Px活性顯著降低(p<0.01);與模型組相比,花葉海棠低劑量組對MDA含量影響不顯著,變葉海棠低劑量組對SOD活性影響不顯著,花葉海棠高劑量組對GSH-Px活性影響不顯著,其余各給藥組MDA含量顯著降低(p<0.05或p<0.01),SOD、GSH-Px活性顯著升高(p<0.05或p<0.01)。見表3。

2.4 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理學的影響

由圖1可得光鏡下觀察各組小鼠肝組織切片,正常對照組肝小葉結構完整、清晰,肝細胞索放射狀排列,肝細胞核清晰、胞質均勻,未見增生及假小葉形成,肝細胞未見變性、壞死,及各類細胞浸潤;模型組小鼠大部分肝小葉結構基本完整,但肝細胞出現中重度水腫變性,肝細胞間隙不清,胞漿淡染、偶見細胞壞死,肝竇間及匯管區(qū)周圍可見炎細胞浸潤,未見脂肪變性。DDB組和俄色葉提取物各劑量組小鼠肝細胞索放射狀排列,肝細胞正常,無明顯變性,肝細胞胞漿著色較均勻,細胞核結構清晰。其中俄色葉提取物各組偶見少許細胞水腫及炎細胞浸潤(圖1D-1、D-3、E-1),未見脂肪變性。病理圖片見圖1。

圖1 俄色葉提取物對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理學影響(HE,×100)Fig.1 Effects of Eseye extracts on Histopathological of liver in mice with acute alcoholic liver damage(HE,×100)

3 討論

乙醇誘導小鼠急性肝損傷實驗結果表明:模型組小鼠血清ALT、AST、TG、HDL-C顯著升高,肝組織SOD、GSH-Px活性顯著降低,MDA含量顯著升高,病理切片觀察到肝組織細胞中重度水腫變性、可見少許炎性細胞浸潤,偶見細胞壞死,說明乙醇在代謝中對肝細胞產生了脂質過氧化、對肝細胞膜、細胞微粒體的損害作用,并導致肝功能、血脂的異常。而提取物各劑量組均能明顯降低血清中ALT、LDL-C水平,能不同程度降低AST、TG;同時能不同程度降低肝組織中MDA,不同程度增加SOD、GSH-Px活性,減少病理組織切片中細胞的水腫、炎性細胞的產生和細胞壞死,表明俄色葉提取物具有一定的保護肝臟的作用。俄色葉提取物中主要含黃酮類成分,其中含量最高的成分為根皮苷[17-18]。馮天艷[19]等研究表明,根皮苷對CCl4致小鼠急性肝損傷具有明顯保護作用。

4 結論

俄色葉提取物對酒精性急性肝損傷有一定的保護作用,其作用機制可能是通過調節(jié)肝功能、清除自由基、抑制脂質過氧化以及增強抗氧化能力來完成的,該機制有待進一步研究。俄色葉中含有多糖類、鞣質類、黃酮類等多種化學成分,其中黃酮類化合物含量最大并具有抗氧化活性,且根皮苷已被發(fā)現具有保肝作用,但其他成分是否具有保肝作用,需要進一步研究。

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Hepatoprotective effects of Eseye extracton acute alcoholic liver damage in mice

ZENG Jun,YANG Rui-shan,CAI Xiao-yang,ZHOU Hai-yu,HUANG Zhen,WANG Pan,LI Min*

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,The Ministry of Education Key Laboratory for Standardization ofChinese Medicines,State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research Development and Utilization of ChineseMedicines Resources Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology,Chengdu 611137,China)

Objective:To investigate the hepatoprotective effects of Eseye extracts against alcohol-induced acute liver injury in mice. Method:The acute liver injury animal model was established in mice by alcohol gavage(50%). The serum levels of ALT,AST,LDL-C and TG were determined. MDA,SOD and GSH-Px were detected in the liver homogenate,as well as the histopathological changes of the liver were observed by HE staining. Result:Eseye extract decreased the levels of ALT,AST,TG and LDL-C in serum. Meanwhile,the MDA content in liver homogenate was reduced whereas the activity of SOD and GSH-Px were increased by Eseye extract. According to the liver histopathological observation,all of treatment groups showed alleviation in mice liver injury to varying degrees. Conclusion:Eseye extract has protective effects on acute liver injury induced by alcohol in mice.

Tibetan medicine;Eseye;alcoholic liver injury;preventive effect

2016-12-06

曾俊(1992-),女,碩士研究生,研究方向:中藥品種、質量與資源研究,E-mail:z_zengj@163.com。

*通訊作者:李敏(1962-),女,本科,教授,研究方向:中藥品種、質量及資源研究,E-mail:028limin@163.com。

全國第四次中藥資源普查(2012-H-100)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)13-0311-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.058