梅為云,李 娜,劉 錄,陳繼坤,黃靳翔,高汪榮,周志宏,*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院,云南昆明 650500;2.云南省食品藥品監(jiān)督管理局,云南昆明 650106;3.石林綠汀甜柿產(chǎn)品開發(fā)有限公司,云南昆明 652200)

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HPLC法測定不同采收期的云南甜柿葉中三種黃酮的含量

梅為云1,3,李 娜1,2,劉 錄1,陳繼坤3,黃靳翔3,高汪榮3,周志宏1,*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院,云南昆明 650500;2.云南省食品藥品監(jiān)督管理局,云南昆明 650106;3.石林綠汀甜柿產(chǎn)品開發(fā)有限公司,云南昆明 652200)

利用回流提取法對不同采收期的云南甜柿葉進(jìn)行預(yù)處理,采用高效液相色譜法測定樣品中山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的含量。具體方法為:提取條件為提取溶劑45%乙醇,液固比20∶1,提取4次,提取時間90 min;液相色譜條件為采用ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱分離,甲醇-0.4%磷酸溶液為洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,檢測波長265 nm;三種黃酮的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%,平均回收率均在99%以上。該方法具有較好的分離效果和較高的穩(wěn)定性,適用于用來分析不同采收期的云南甜柿葉中上述三種黃酮的含量,測定結(jié)果表明三種黃酮在葉中積累具有規(guī)律性,隨柿果實成長不斷積累,并且果實成熟時達(dá)到最高。

甜柿,高效液相色譜法,山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷,山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷,槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷

柿子(Diospyroskaki)為柿樹科(Ebenaceae)柿樹屬(Diospyros)植物,是我國五大水果(葡萄、柑橘、香蕉、蘋果、柿子)之一[1],近年來在各地均有大面積種植,市場上也出現(xiàn)了多種資源再利用的深加工產(chǎn)品。柿葉是大規(guī)模種植后產(chǎn)生的可持續(xù)利用資源,因其富含多種活性成分和營養(yǎng)成分而倍受關(guān)注[2-4]。云南是甜柿水果規(guī)模化種植大省,甜柿葉資源的綜合利用尚處于起步階段,黃酮類成分是其主要功效成分[5],目前已有多篇文獻(xiàn)報道柿葉中總黃酮的提取工藝研究[6-8],以及部分文獻(xiàn)報道部分黃酮含量的測定[9-11]。但同時檢測不同采收期的柿葉中3種常見功效黃酮山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(1)[12]、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷(2)[13]和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)[14],尚屬首次,具有一定的現(xiàn)實意義。本文建立了一種HPLC色譜檢測方法,用于檢測不同采收期新鮮柿葉中三種黃酮類物質(zhì)的含量,并分析其在葉中積累的規(guī)律性,為合理利用柿葉提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同采收期的新鮮柿葉 均由昆明石林綠汀甜柿產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供;液相標(biāo)準(zhǔn)品由本實驗室組成員前期從柿葉中分離得到,經(jīng)包括核磁共振、質(zhì)譜在內(nèi)的多種波譜學(xué)手段鑒定為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(1)、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷(2)和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)(純度均≥99.9%)。甲醇為色譜純,乙醇為分析純 均購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;純凈水 購于杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

島津LC-2010AHT高效液相色譜儀 日本島津公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DHG-9240A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;SB-2000 EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛郎儀器有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液的提取 黃酮多為極性成分,易溶于醇和水中,為便于工業(yè)化生產(chǎn),本工藝采用常規(guī)的乙醇水為溶劑進(jìn)行回流提取?？疾烊N黃酮總得率(T)。

T(%)=提取的三種黃酮質(zhì)量之和(mg)/甜柿質(zhì)量(g)×100

1.2.2 對照品溶液的配制 分別取山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(1)、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷(2)和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(3),置于干燥器中于室溫下(25 ℃)干燥12 h,精密稱定各化合物,用甲醇配制成單品對照品溶液和混合對照品(質(zhì)量比1∶1∶1)溶液。

1.2.3 樣品溶液的配制 將不同采收期的新鮮柿葉自然曬干后于50 ℃下烘干至恒重,粉碎后過60目篩,稱取1.0000 g,按照1.2.1中的提取方式,將三次過濾收集的濾液合并,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70 ℃下減壓濃縮,甲醇定容至25 mL,經(jīng)0.45 μm膜過濾,待測。

1.2.4 色譜條件 色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測器:紫外檢測器。檢測波長:265 nm,柱溫30 ℃,甲醇-0.4%磷酸溶液為洗脫系統(tǒng)(具體洗脫條件見表1)。

表1 液相洗脫條件Table 1 Elution condition of HPLC

1.2.5 單因素實驗 采用以上的提取及測定方法對甜柿中三種黃酮進(jìn)行提取。提取條件為:固定液固比30∶1、提取時間30 min、提取次數(shù)2次,考察不同乙醇濃度(40%、60%、80%和100%)對三種黃酮得率T的影響;固定乙醇濃度60%、提取時間30 min、提取次數(shù)2次,考察不同液固比(20∶1、30∶1和40∶1)對三種黃酮得率T的影響;固定乙醇濃度60%、液固比30∶1、提取時間30 min,考察不同提取次數(shù)(2、3和4次)對三種黃酮得率T的影響;固定乙醇濃度60%、液固比30∶1、提取次數(shù)3次,考察不同提取時間(30、60和90 min)對三種黃酮得率的影響。進(jìn)行單因素實驗,考察各因素變量對甜柿中三種黃酮得率的影響。

1.2.6 正交實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,每個因素選取3個水平對甜柿中三種黃酮得率T進(jìn)行考察(表2)。

表2 因素水平表Table 2 The table of the factors and levels

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 利用Origin8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析實驗,每組實驗均重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 乙醇濃度的選擇 選取40%～100%的乙醇以20%為一個梯度,來考察三種黃酮的得率。發(fā)現(xiàn)用50%乙醇提取時,得率最高,故提取溶劑選擇50%的乙醇水溶液。

2.1.2 液固比的選擇 精密稱取等量的干燥柿葉的樣品,分別按照液固比(體積:質(zhì)量)為20∶1,30∶1,40∶1條件下加入50%乙醇水,各提取30 min,經(jīng)抽濾、濃縮、定容,取適量過0.45 μm濾膜,進(jìn)行HPLC測定,結(jié)果表明液固比在30∶1時得率較大,綜合考慮選取液固比為20∶1。

2.1.3 提取時間的選擇 精密稱取等量的干燥柿葉樣品,按液固比30∶1用50%乙醇水提取,提取時間分別為30,60,90 min,經(jīng)抽濾、濃縮、定容,取適量過0.45 μm濾膜,進(jìn)行HPLC測定。結(jié)果表明提取時間為90 min時得率較高,故提取時間選擇為90 min為宜。

2.1.4 提取次數(shù)的選擇 按照2.1.1,2.1.2,2.1.3中優(yōu)選的方法,根據(jù)以上思路最后確定提取次數(shù)3次為宜;4次時,得率與3次基本沒有變化。

2.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取影響三種黃酮得率的乙醇濃度,液固比,提取時間,提取次數(shù)四因素,設(shè)計四因素三水平的L9(34)正交實驗來進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化,正交實驗結(jié)果及分析見表3。

由表3可見,以T為指標(biāo),根據(jù)正交實驗結(jié)果,適宜的提取工藝為A1B1C3D3,所以選擇A1B1C3D3為提取柿葉中黃酮的適宜提取工藝條件,即提取溶劑為45%乙醇,液固比為20∶1,一次提取時間為90 min,提取次數(shù)為4次。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限實驗結(jié)果Table 4 Results of standard curve,detection limit and quantitation limit

表3 正交設(shè)計結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment

2.3 驗證實驗

取甜柿干燥粉末10.0 g,在最佳提取條件下提取4次,取平均值,驗證實驗結(jié)果。測得T的得率為(0.62±0.05) mg/g,明顯高于其它組合,說明實驗結(jié)果與該設(shè)計符合良好,優(yōu)化的提取工藝參數(shù)是可靠的,此正交實驗具有可行性。

2.4 色譜分離參數(shù)的確定

2.4.1 檢測波長的確定 采用雙光束紫外可見分光光度計對1～3進(jìn)行掃描,1～3均在265 nm附近有最大吸收。故選擇檢測波長為265 nm,對1～3進(jìn)行HPLC檢測。

2.4.2 流動相的確定 為了獲得較好的分離度,參照文獻(xiàn)的報道,本實驗選取了6組不同的流動相系統(tǒng)進(jìn)行比較:乙腈-水,乙腈-1‰磷酸水溶液,乙腈-0.4‰磷酸水溶液,甲醇-水,甲醇-1‰磷酸水溶液,甲醇-0.4‰磷酸水溶液。分別對不同采收期的柿葉中三種黃酮的含量進(jìn)行測定,通過比較各化合物的分離度、保留時間和峰形,最終選用甲醇-0.4‰磷酸水溶液系統(tǒng),具體條件見表2。

2.5 對照品和樣品溶液的色譜分離圖

取供試樣品溶液適量,參照上述液相方法進(jìn)行HPLC分析,記錄譜圖1。供試品中三種黃酮的色譜峰分離度及峰形均較好,符合高效液相色譜定量分析的一般要求。1～3的保留時間分別為47.02,36.39,24.48 min,均與單獨分析時保留時間一致。

圖1 供試品溶液色譜圖Fig.1 HPLC profile of the sample

2.6 線性關(guān)系、定量限及檢出限的考察

精密稱取1～3的質(zhì)量,分別配制成濃度為137.0,61.3、123.9 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,用甲醇對其進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋,經(jīng)HPLC分析,以對照品的峰面積為縱坐標(biāo),對照品濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表4所示。三種黃酮在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上。

取各單品對照品溶液,用甲醇稀釋后進(jìn)行HPLC分析,調(diào)整溶液濃度得出信噪比為3和10時,即可得樣品的最低檢出限和定量限,結(jié)果見表4所示。

2.7 精密度及穩(wěn)定性實驗

取適量已經(jīng)配制好的混合對照品溶液,過濾后進(jìn)行HPLC分析,連續(xù)進(jìn)樣6次,(1～3)三種對照品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.26%,0.59%和0.19%,表明儀器精密度良好,該方法精密度符合要求。

2.8 重復(fù)性實驗

取同一供試品溶液,平行測定6次,考察HPLC測定的重復(fù)性,三種黃酮的RSD分別為0.95%,0.89%和0.78%,符合要求。

2.9 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液,據(jù)實驗所得條件,于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣測定,結(jié)果表明,三種黃酮的RSD分別為0.84%,0.80%和0.68%,符合要求。說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率實驗

取已知含量的供試品9份,精密加入1～3對照品,按實驗所得方法測定,結(jié)果表明,該分析方法回收率97.68%～100.33%,平均回收率98.87%,RSD值為1.00%;92.08%～101.56%,平均回收率96.72%,RSD值為3.31%;91.36%～100.11%,平均回收率95.18%,RSD值為3.20%。故該方法可以滿足分析測試的要求。

2.11 不同采收期的柿葉中三種黃酮含量的測定

按照前面的方法,對不同采收期的甜柿葉13批樣品進(jìn)行三種黃酮含量的測定,結(jié)果見表5。

表5 不同采收期的甜柿葉中三種黃酮的含量(%)Table 5 The contents of 1～3 in the leaves of Yunnan Diospyros kaki in different harvest periods(%)

從表5中可以看出,9月,10月采收的柿葉,三種黃酮的含量均高。

3 結(jié)論與討論

通過對云南甜柿葉中黃酮提取工藝的研究,得出了適宜的提取工藝條件:提取條件為提取溶劑45%乙醇,液固比20∶1,提取4次,提取時間90 min。另外本實驗確定了云南甜柿葉中三種黃酮1～3高效液相色譜分析條件:采用ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱分離,甲醇-0.4%磷酸溶液為洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,檢測波長265 nm;三種黃酮的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%,平均回收率均在99%以上。

通過對昆明石林綠汀甜柿產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供不同采收時間的甜柿葉進(jìn)行三種黃酮成分的測定表明,三種黃酮在葉中的積累具有規(guī)律性:隨著柿葉

采收不斷積累,至9月份達(dá)到最高值,隨后開始降低,即隨著果實成長不斷累積,果實成熟時達(dá)到最高。因此,對柿葉黃酮的利用可以在果實成熟后采摘同時進(jìn)行,一方面不影響果實采收,另一方面提高柿葉的綜合利用效率。

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Determination of three flavonoids in the leaves ofYunnanDiospyroskakiin different harvest periods by HPLC

MEI Wei-yun1,3,LI Na1,2,LIU Lu1,CHEN Ji-kun3,HUANG Jin-xiang3,GAO Wang-rong3,ZHOU Zhi-hong1,*

(1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China;2.Yunnan Province Food and Drug Administration,Kunming 650106,China;3.Shilin Luting Sweet Persimmon Development Limited Company,Kunming 652200,China)

A HPLC method was developed for determinating the contents of Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside,Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside,and Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside in the leaves of YunnanDiospyroskakiin different harvest periods. The extraction conditions were 45% ethyl alcohol, the ratio of liquid-solid of 20∶1,extraction time of 90 min for 4 times. The HPLC elution was carried out using methanol-0.4% phosphate system at a flow rate of 1.0 mL/min,the injection volume was 10 μL,and the detector wavelength was set at 265 nm. The RSD values of the three flavonoids were all less than 1% and the average recoveries were all above 99%. This method showed good separation effect and high stability,and could be used for determining the contents of the three flavonoids in the leaves of YunnanDiospyroskakiin different harvest periods. The result showed that the accumulation of them in leaves of YunnanDiospyroskakiexhibited regularity,and the contents were increasing along with fruit growing.

Diospyroskaki;HPLC;Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside;Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside;Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside

2016-12-27

梅為云(1969-), 男, 本科, 農(nóng)藝師，研究方向:深度開發(fā)利用甜柿資源,E-mail:2582265377@qq.com。

*通訊作者:周志宏(1971-), 男,博士,副研究員，研究方向:中藥化學(xué),中藥資源開發(fā)與利用，E-mail:kmzhouzh@163.com。

國家自然科學(xué)基金(81060338);云南省自然科學(xué)基金(2010CD072,2013FA040)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)13-0244-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.046