楊 暉,馬 良,韓 霜,黃丹丹,張宇昊,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.西南大學(xué) 國家食品科學(xué)與工程實驗教學(xué)中心,重慶 400715)

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明膠添加量對兔皮明膠膜特性與結(jié)構(gòu)的影響

楊 暉1,馬 良1,韓 霜1,黃丹丹1,張宇昊1,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.西南大學(xué) 國家食品科學(xué)與工程實驗教學(xué)中心,重慶 400715)

從兔皮中提取明膠制備明膠膜,通過測定不同明膠添加量下膜的機(jī)械性能、水蒸氣透過率、亞基組成和結(jié)構(gòu),探究明膠添加量對明膠膜特性與結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明隨著明膠添加量的增加,明膠膜體系內(nèi)網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)變大,從而膜的厚度增加。力學(xué)結(jié)果顯示,明膠添加量為4 g/100 mL(w/v)時,明膠膜抗拉強(qiáng)度最高(p<0.05);明膠添加量為6 g/100 mL(w/v)時,明膠膜斷裂伸長率最低(p<0.05)。水蒸氣透過率結(jié)果表明隨著明膠添加量的增加,水蒸氣透過率呈現(xiàn)上升趨勢。凝膠電泳結(jié)果顯示,明膠添加量為4 g/100 mL(w/v)時,低分子量的蛋白組分產(chǎn)生更多交聯(lián),形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)的結(jié)構(gòu),此濃度下明膠膜的抗拉強(qiáng)度最大。FT-IR分析表明:當(dāng)明膠添加量增加至4 g/100 mL(w/v)時,酰胺A帶向高波數(shù)移動,說明肽鏈上的N-H基團(tuán)并沒有與甘油的-OH基團(tuán)相互反應(yīng),而是明膠分子的官能團(tuán)之間產(chǎn)生更強(qiáng)的相互作用,形成獨特的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。同時,酰胺Ⅰ帶曲線擬合結(jié)果也表明當(dāng)明膠添加量為4 g/100 mL時,膜內(nèi)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)較多,明膠分子之間的相互反應(yīng)達(dá)到最大化,明膠膜的穩(wěn)定性和成膜性能較優(yōu)。

兔皮,明膠膜,明膠添加量,結(jié)構(gòu)

在食品包裝領(lǐng)域,塑料制品因具有低成本性、輕便性和阻氣性等優(yōu)點而被廣泛使用[1],但是它缺少回收性,不具備可再生性和生物降解性。天然的生物高分子具有良好的生物相容性和可降解性,越來越多地被應(yīng)用到制造生物可降解膜中[2]代替部分傳統(tǒng)包裝材料。在天然生物高分子中,蛋白質(zhì)分子相對于多糖,其通過共價鍵相互作用的結(jié)合力更強(qiáng),有助于提高膜的力學(xué)特性。而在蛋白質(zhì)中,明膠來源廣泛、價格低廉,具有良好的成膜能力和功能應(yīng)用特性,適用于制備生物可降解包裝。

明膠是膠原在酸、堿、酶或高溫作用下的變性產(chǎn)物[3]。目前國內(nèi)外對于明膠膜的研究主要以水產(chǎn)明膠為主,通常是水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物,例如魚的皮、骨、鱗等[4-6]。但是水產(chǎn)明膠膜存在抗拉強(qiáng)度較低和水溶性較高的缺陷[5],一定程度上限制了其在食品包裝中的實際應(yīng)用,而哺乳動物明膠膜能較好的克服這些缺點,例如Avena[6]等人研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物明膠膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率比深海魚明膠膜的更大,即膜的機(jī)械性能更優(yōu);Hanani[7]對豬、牛、魚明膠膜進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)豬明膠膜的抗拉強(qiáng)度最大且水溶性最低。但是傳統(tǒng)的哺乳動物明膠通常來源于豬、牛的皮和骨,此類明膠原料由于瘋牛病、口蹄疫等安全問題和宗教信仰問題被限制使用。近年來我國兔肉加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,兔皮作為主要的加工副產(chǎn)物丟棄會造成浪費和對環(huán)境的污染,若從兔皮中提取明膠,試圖以兔皮明膠代替?zhèn)鹘y(tǒng)哺乳動物明膠,不僅能提高兔皮的利用率、延長兔肉加工產(chǎn)業(yè)鏈,還能克服水產(chǎn)明膠膜在抗拉強(qiáng)度和水蒸氣透過率方面存在的缺陷以及傳統(tǒng)哺乳動物明膠存在的安全問題。

有學(xué)者研究表明明膠添加量會對明膠膜的特性與結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著性影響,例如Acosta[8]發(fā)現(xiàn)不同明膠-淀粉比例的共混膜在機(jī)械性能和水蒸氣透過率方面存在差異;Hosseini[9]等人研究發(fā)現(xiàn)明膠添量對水蒸氣透過率和力學(xué)性能有顯著影響;劉莉莉[10]研究發(fā)現(xiàn)明膠添加量會影響復(fù)合膜的透光率、水溶性和結(jié)晶度。綜上,本文以兔皮明膠為原料制備明膠膜,通過測定抗拉強(qiáng)度、斷裂伸長率、水蒸氣透過率等指標(biāo)探究明膠添加量對明膠膜特性的影響,同時通過紅外光譜、SDS-PAGE凝膠電泳研究明膠膜微觀結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兔皮 購于重慶阿興記食品有限公司,原料獲取后洗凈凍藏于-20 ℃冰箱中備用。

鹽酸、氯化鈉、硫化鈉、氫氧化鈣、硅藻土 成都市科龍化工試劑廠出品;甘油 生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn);過硫酸銨(APS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tris、β-巰基乙醇(2-ME)、四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍(lán)R-250 BIO BASIC公司出品;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%丙烯酰胺(丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量比為29∶1) 北京索萊寶科技有限公司出品。其中Tris、考馬斯亮藍(lán)R-250、30%丙烯酰胺為優(yōu)級純,其他試劑均為分析純。

JA3003B電子天平 上海精天電子儀器有限公司;PHS-25 型數(shù)顯酸度計 杭州雷磁分析儀器廠;DGG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;8002 型溫控水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器廠;CJ-78-1磁力攪拌器 上海將任實驗設(shè)備有限公司;Spectrun100紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司;Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀 美國Bio-Rad公司;G:BOX EF型凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司;紫外—可見光分光光度計752 上海菁華科技儀器有限公司;智能電子拉力機(jī)XLW-PC型 濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司;PERMA W3/060型水蒸氣透過率測試儀 濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司;數(shù)顯測厚規(guī),上海川陸量具有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔皮明膠的提取 兔皮明膠提取方法在于瑋[11]等報道的基礎(chǔ)上,稍加改動。具體提取工藝流程如下:

新鮮兔皮→清洗、去除皮下脂肪→脫毛→清洗、剪切→除雜蛋白→清洗→稀酸處理→提膠→過濾→熱風(fēng)干燥→成品明膠

為了提高明膠純度,在提膠過程中,向提膠料液中加入體積比為1∶50(硅藻土溶液:提膠液)的6%硅藻土溶液,隨后用孔徑為1.2 μm的微濾膜真空過濾。

1.2.2 明膠膜的制備 分別稱取3.0、4.0、5.0、6.0 g兔皮明膠置于200 mL燒杯中并加入0.88 g甘油(以4.0 g明膠質(zhì)量的22%計)和100 mL去離子水,室溫下溶脹2 h,60 ℃水浴加熱并間斷攪拌,使明膠完全溶解,形成均勻的液體,40 W超聲10 min,除去氣泡,制得明膠成膜溶液(film-forming solutions,FFS)。量取30 mL成膜溶液均勻平鋪于130 mm×130 mm的塑料培養(yǎng)皿上,在溫度(45±1) ℃下干燥24 h,揭下的膜置于干燥皿中平衡48 h后,作為待測樣品。

1.2.3 厚度的測定 用測厚規(guī)在膜上隨機(jī)選取個10點,測定其厚度并計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.4 機(jī)械性能的測定 將膜剪切成50 mm×15 mm的矩形長條,用智能電子拉力機(jī)測定膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率。

參數(shù)設(shè)置:速度50 mm/min,夾具間距15 mm,測試溫度25 ℃,相對濕度65%。

每個樣品測定三次,求取平均值。

1.2.5 水蒸氣透過率(WVP)的測定 用水蒸氣透過率測試儀測定膜的水蒸氣透過率。

參數(shù)設(shè)置:時間間隔20 min,測試溫度25 ℃,相對濕度70%。

每個樣品測定三次,求取平均值。

水蒸氣透過率計算公式[12]:

式中:Δm-t時間內(nèi)的質(zhì)量增量,g;d-試樣厚度,cm;A-試樣透水蒸氣的面積,cm2;t-質(zhì)量變化穩(wěn)定后的兩次間隔時間,s;ΔP-試樣兩側(cè)的水蒸氣壓差,Pa。

1.2.6 紅外光譜分析 稱取一定量樣品與溴化鉀(KBr)混合研磨,于45 ℃下烘干后壓片,用Spectrun100紅外光譜儀進(jìn)行檢測。室內(nèi)溫度為25 ℃,掃描范圍:450～4000 cm-1,掃描次數(shù):32,分辨率4 cm-1。對1700～1600 cm-1波數(shù)的圖譜采用origin8.6數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行基線校正、去卷積和做二階導(dǎo)數(shù)圖譜,再自動擬合直至殘差最小,得到子峰圖譜(各子峰峰位及峰面積),最后根據(jù)積分面積計算對應(yīng)二級結(jié)構(gòu)的含量。

1.2.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析 稱取10 mg明膠膜溶解于1 mL蛋白變性劑[13]中,室溫振蕩24 h,離心取上清液,雙縮脲法測定上清液蛋白濃度[14],并將蛋白濃度稀釋到2 mg/mL,按體積比4∶1添加5×樣品緩沖液,沸水浴5 min,冷卻后上樣,上樣量為15 μL(Marker上樣量為10 μL),其中分離膠和濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6%和4%。15 mA恒流電泳,待溴酚藍(lán)跑到分離膠中后,電流調(diào)至25 mA。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色,2 h后用脫色液于40 ℃下振蕩脫色1 h。背景藍(lán)色脫凈后用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜,用Gene Tools數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 每次實驗設(shè)置三個平行實驗,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,并用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 進(jìn)行顯著性分析(Tukey;p<0.05),用origin8.6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠添加量對膜厚度的影響

表1 不同明膠添加量下膜的厚度Table 1 Thickness of films with different gelatin additions

表2 不同明膠添加量下膜的力學(xué)性質(zhì)Table 2 Mechanical properties of films with different gelatin additions

注:采用Tukey方法分析,字母a、b、c(同一行不同字母)表示顯著性差異(p<0.05,n=3)。由表1可知,隨著明膠添加量的增加,膜的厚度從54.3 μm逐漸增加到92.7 μm,這是因為明膠分子間通過氫鍵相互反應(yīng)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),隨著明膠體系內(nèi)明膠含量增加,網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)變大,膜內(nèi)體積增加,從而膜的厚度逐漸增加。

2.2 明膠添加量對膜力學(xué)性能的影響

由表2可知,隨著逐漸明膠添加量的增加,明膠膜的抗拉強(qiáng)度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,而斷裂伸長率呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢。相對于明膠添加量為3、5、6 g/100 mL的明膠膜而言,4 g/100 mL的明膠添加量對明膠膜的抗拉強(qiáng)度產(chǎn)生顯著性影響(p<0.05);明膠添加量為5 g/100 mL時,斷裂伸長率顯著降低至1.08%(p<0.05),且即使提高明膠添加量至6 g/100 mL,斷裂伸長率仍在1.05%左右。

明膠添加量為3 g/100 mL時,明膠體系內(nèi)明膠含量較低,因而明膠分子間相互作用降低,明膠膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中明膠分子主要與甘油相互作用,膜的剛性結(jié)構(gòu)被軟化,導(dǎo)致明膠膜斷裂伸長率較大,抗拉強(qiáng)度較低。隨著明膠添加量提高至4 g/100 mL,明膠分子與甘油相互作用的比例降低,絕大部分明膠分子通過水分子形成氫鍵相互作用,分子間作用力增強(qiáng),因而明膠膜的脆性增加,抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率分別呈現(xiàn)升高和降低的趨勢。但是當(dāng)明膠添加量增至5 g/100 mL時,抗拉強(qiáng)度呈現(xiàn)降低的趨勢可能由于明膠膜內(nèi)所形成的三維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)已經(jīng)達(dá)到極限,致密的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致分子間流動性降低[6]。

2.3 明膠添加量對膜水蒸氣透過率的影響

Hanani等人[15]研究發(fā)現(xiàn)厚度是影響明膠膜水蒸氣透過率的重要因素:隨著厚度增加,水蒸氣透過明膠膜時受到的阻力增加,使膜內(nèi)表面的平衡水蒸氣分壓增加,水蒸氣透過率會降低。但是由圖1可知,隨著明膠添加量的提高,明膠膜的水蒸氣透過率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。一方面因為明膠分子具有親水性,能與水分子通過氫鍵相互反應(yīng)[16],所以隨著明膠含量增加,膜內(nèi)水分子的吸附性增強(qiáng),從而水蒸氣透過率增加;另一方面由水蒸氣透過率公式可得,水蒸氣透過率值與厚度呈正相關(guān),即厚度越大水蒸氣透過率值越大。

圖1 明膠添加量對明膠膜水蒸氣透過率的影響Fig.1 The effect of different gelatin additions on the water vapor permeabilities of gelatin films

2.4 SDS-PAGE分析

不同明膠添加量下明膠膜各亞基組成如圖2所示,主要得到分子量分別為209、122、112 kDa的三條條帶,對應(yīng)于蛋白的α1、α2鏈以及β組分[17],說明明膠膜蛋白組分主要由兩條α鏈(α1和α2)和β組分(二聚物)組成。Hoque等人[18]研究發(fā)現(xiàn)明膠蛋白組分的降解可能會導(dǎo)致較低的抗拉強(qiáng)度,由圖2可知,當(dāng)明膠添加量為4 g/100 mL時,α1鏈和α2鏈譜帶強(qiáng)度最強(qiáng),而當(dāng)明膠添加量為3 g/100 mL和5 g/100 mL時明膠膜的條帶顏色較4 g/100 mL淺,可能是因為兩條α鏈存在部分降解,同時此條件下明膠膜的抗拉強(qiáng)度也顯著低于明膠添加量為4 g/100 mL的明膠膜(p<0.05),與Hoque[16]所報道的趨勢一致。

圖2 明膠添加量對明膠膜蛋白組分的影響Fig.2 The effect of different gelatin additions on the protein patterns of gelatin films注：M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1:明膠添加量3 g/100 mL; 2:明膠添加量4 g/100 mL;3:明膠添加量5 g/100 mL。

2.5 FT-IR分析

不同明膠添加量下明膠膜的酰胺A帶的吸收特征峰分別位于3400、3421、3419 cm-1處。酰胺A帶主要表征N-H基團(tuán)的伸縮振動,由圖3可知,隨著明膠添加量的提高,波數(shù)逐漸向高頻率移動,說明當(dāng)明膠添加量增至4 g/100 mL后,肽鏈上的N-H基團(tuán)并沒有與甘油的-OH基團(tuán)相互反應(yīng),相反明膠分子的官能團(tuán)之間產(chǎn)生了更加強(qiáng)烈的相互作用[11],形成獨特的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。酰胺B帶吸收峰在2929、2928 cm-1左右,并無明顯差異。1043 cm-1為甘油吸收特征峰[18]。明膠膜酰胺Ⅰ帶的吸收峰分別位于1636.2、1636、1649 cm-1處,發(fā)現(xiàn)當(dāng)明膠添加量為5 g/100 mL時,酰胺Ⅰ帶顯著增加。Doyle等人[19]研究發(fā)現(xiàn)酰胺Ⅰ帶對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有明顯影響,因此對紅外光譜圖1700～1600 cm-1范圍進(jìn)行去卷積和高斯擬合,分離出相應(yīng)子峰。根據(jù)文獻(xiàn)報道[20-22],將主要子峰峰位做如下歸屬:1630、1642、1652、1662 cm-1分別為β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋和三螺旋結(jié)構(gòu)。由表3可知,隨著明膠添加量增加,膜內(nèi)無規(guī)則卷曲含量逐漸降低,說明此時膜內(nèi)結(jié)構(gòu)改變,分子秩序有所升高[23]。明膠膜的特性與無規(guī)則卷曲和三螺旋結(jié)構(gòu)含量有關(guān),兩者比值低說明膜內(nèi)無序結(jié)構(gòu)較少,表明膜穩(wěn)定性能較優(yōu)[24]。當(dāng)明膠添量為4 g/100 mL時,兩者的比例最低,說明此時膜內(nèi)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)較多,明膠分子之間的相互反應(yīng)達(dá)到最大化,即明膠的穩(wěn)定性和成膜性能較優(yōu)。

圖3 不同明膠添加量紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of films with different gelatin additions 表 3 不同明膠添加量下明膠膜二級結(jié)構(gòu)含量(%)Table 3 The secondary structured content of gelatin films at different gelatin additions(%)

明膠含量(g/100mL)345β-折疊3491210467無規(guī)則卷曲350414201758α-螺旋323754510三螺旋結(jié)構(gòu)409546554

3 結(jié)論

結(jié)果表明,隨著明膠添加量的提高,明膠膜的厚度和水蒸氣透過率呈現(xiàn)上升的趨勢。力學(xué)結(jié)果顯示,當(dāng)明膠添加量為4 g/100 mL時,明膠膜的抗拉強(qiáng)度產(chǎn)生最大;當(dāng)明膠添加量為3 g/100 mL時,明膠膜的斷裂伸長率最大。SDS-PAGE結(jié)果表明,當(dāng)明膠添加量為4 g/100 mL時,明膠膜的譜帶強(qiáng)度最大,說明明膠膜體系內(nèi)的低分子量蛋白產(chǎn)生更多交聯(lián)。FT-IR結(jié)果顯示當(dāng)明膠添加量增至4 g/100 mL時,酰胺A帶向高波數(shù)移動,說明明膠基質(zhì)中呈現(xiàn)更多明膠分子自身之間的相互反應(yīng),從而形成獨特的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

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Effect of gelatin additions on the propertiesand structure of rabbit skin gelatin films

YANG Hui1,MA Liang1,HAN Shuang1,HUANG Dan-dan1,ZHANG Yu-hao1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The effect of gelatin additions on the properties and structure of rabbit skin gelatin films was studied by measuring the mechanical properties,water vapor permeabilities,subunit content and structure. The results showed that the thickness increased because gelatin network structure in the gelatin film system increased with increasing the addition of gelatin. Mechanical property results showed that the tensile strength of gelatin films was the highest when the addition of gelatin was 4 g/100 mL(w/v),however the gelatin films possessed the highest elongation at break as the addition of gelatin was 6 g/100 mL(w/v). The water vapor permeabilities of gelatin films increased with increasing the gelatin additions. The results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)indicated that the low molecular weight of protein fraction formed protein-protein cross-linking which resulted in the highest tensile strength as the gelatin addition was 4 g/100 mL(w/v). FT-IR results showed that amide A band moved to high wave number as the gelatin addition was 4 g/100 mL(w/v),which indicated that glycerol molecules didn’t react with N-H group of peptides. A greater interaction occurring between gelatin functional groups to form a unique network structure conversely. Furthermore,curve-fitting of amideⅠband showed that there were more stable structure in the film matrix as the gelatin addition was 4 g/100 mL(w/v),so the films possessed greater stability and film-forming properties.

rabbit skin;gelatin films;gelatin addition;structure

2016-12-27

楊暉(1991-),女,碩士研究生,研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)，E-mail:365363469@qq.com。

*通訊作者:張宇昊(1978-),男,博士,教授,研究方向：蛋白和生物活性肽，E-mail:Zhy1203@163.cn。

國家自然科學(xué)基金-青年科學(xué)基金項目(31301425);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費重大項目(XDJK2015A015);中國博士后科學(xué)基金面上項目(2014M562267);中國博士后科學(xué)基金特別資助項目(2015T80951);重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究專項重點項目(cstc2015jcyjBX0116);第四批重慶市高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃項目。

TS201.1

A

1002-0306(2017)13-0220-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.042