秦 楠,繆文玉,李 鑫,郝 林,*

(1.山西中醫(yī)學(xué)院制藥與食品工程學(xué)院,山西太原 030619;2.太原城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院管理工程系,山西太原 030027;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太谷 030801)

?

解淀粉芽孢桿菌HRH317抗菌蛋白發(fā)酵條件優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究

秦 楠1,繆文玉2,李 鑫3,郝 林3,*

(1.山西中醫(yī)學(xué)院制藥與食品工程學(xué)院,山西太原 030619;2.太原城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院管理工程系,山西太原 030027;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太谷 030801)

本文以抑菌圈直徑為指標(biāo),采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)解淀粉芽孢桿菌HRH317菌株產(chǎn)抗菌蛋白的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳發(fā)酵條件為:初始pH為7.0的NB培養(yǎng)液,接種量4%,37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)速為200 r/min。在此條件下抗菌蛋白的抑菌圈直徑達(dá)21.85 mm,結(jié)果表明該抗菌蛋白具有良好的抑菌效果。穩(wěn)定性研究結(jié)果表明:蛋白在40～80 ℃、pH2～11穩(wěn)定,對(duì)蛋白酶K有一定耐受性。

解淀粉芽孢桿菌,抗菌蛋白,響應(yīng)面法,穩(wěn)定性

霉菌是引起采后果蔬腐爛的重要因素之一?；瘜W(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的污染直接影響人類的健康,為了保證農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi)生和安全,利用微生物之間的寄生、拮抗作用已成為果蔬及糧食防霉的大勢(shì)所趨[1-2]。

芽孢桿菌(Bacillus.spp)是拮抗細(xì)菌中的重點(diǎn)研究對(duì)象。其生長(zhǎng)迅速,能夠產(chǎn)生諸如抗菌蛋白、肽等抑菌有效成分,對(duì)人體無(wú)毒害、不造成環(huán)境污染[3-4]。Mohamed等[5]將1-MCP與解淀粉芽孢桿菌共同防治番木瓜病害,結(jié)果表明炭疽病和霉軟腐病得到了有效的抑制,既控制了后熟,還保持了果實(shí)品質(zhì)。郝衛(wèi)寧等[6]研究了由解淀粉芽孢桿菌HC-03制備得到的菌株發(fā)酵液、菌懸液及發(fā)酵濾液,進(jìn)行橘子青、綠霉病的防腐實(shí)驗(yàn),有明顯的抑菌作用。韓玉竹等[7]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽對(duì)糧食防霉方面效果顯著。因此,芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物成為抑制真菌病害最有效的天然生物制劑[8-9]。在農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮、病原物防治及植株促生等方面表現(xiàn)出良好的前景。本實(shí)驗(yàn)以解淀粉芽孢桿菌HRH317為出發(fā)菌株,對(duì)發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH、接種量、轉(zhuǎn)速等條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),并通過(guò)方差分析從中選出影響顯著的因子進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),從而獲得抗菌蛋白的最佳發(fā)酵條件,同時(shí)對(duì)抗菌蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,為后期工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

表1 單因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Levels design of single factor

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌HRH317菌株(BacillusamyloliquefaciensHRH317)(編號(hào):CGMCC No.7314)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum) 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室;蛋白酶K(2000～5000 U/mg) solarbio公司;胰蛋白酶(2000～5000 U/mg)、胃蛋白酶(3000～3500 U/mg) 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;硫酸銨、Tris、牛肉膏、蛋白胨 均為分析純;營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)培養(yǎng)基 牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、瓊脂1.5 g、水100 mL;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 L;營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth,NB)培養(yǎng)基 牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、水100 mL;馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose broth,PDB)液體培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基中不加瓊脂。

DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京光明醫(yī)療儀器廠;YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BS210S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;HZQ-QX全溫振蕩搖床 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;DL-6MS高速離心機(jī) 成都市生科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HRH317菌株抗菌蛋白的制備 將HRH317菌株種子液接種至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中搖床培養(yǎng)獲得發(fā)酵液。轉(zhuǎn)移至EP管離心去沉淀,經(jīng)孔徑0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾,即得無(wú)菌體培養(yǎng)濾液。緩慢加入硫酸銨至50%飽和度,收集沉淀蛋白。用原1/10體積0.02 mol/L pH6.8的Tris緩沖液溶解,裝入透析袋后采用濃度相同的Tris緩沖液透析過(guò)夜,即得到抗菌蛋白[10],蛋白質(zhì)濃度測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.2 指示菌菌懸液的制備 用接種環(huán)挑取一環(huán)禾谷鐮孢病菌孢子接入裝有5 mL滅菌生理鹽水的試管中,稀釋102倍后制成濃度為1.0×106個(gè)/mL的孢子懸液,備用。

1.2.3 HRH317菌株抗菌蛋白的抑菌活性測(cè)定 采用牛津杯法[12]。

1.2.4 HRH317菌株產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素影響實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)選取不同發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH、接種量、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),各處理均在培養(yǎng)后,按照1.2.1取濃度(5.81±0.04) mg/mL的抗菌蛋白100 mL進(jìn)行抑菌活性檢測(cè),記錄抑菌圈直徑作為指標(biāo)。不同因子梯度條件見(jiàn)表1。

1.2.4.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用中心組合實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案,以發(fā)酵時(shí)間(h)、接種量(%)以及轉(zhuǎn)速(r/min)為考察因素,分別用X1、X2、X3來(lái)表示,并以+1、0、-1分別代表變量的水平,按方程xi=(Xi-X0)/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼,其中,xi表示變量的編碼值,Xi表示變量的真實(shí)值,X0表示實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)變量的真實(shí)值,ΔX表示變量的步長(zhǎng)變化,抗菌蛋白的抑菌圈直徑Y(jié)表示響應(yīng)值,見(jiàn)表2。

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)因素和水平編碼值Table 2 Independent variables and levels in Box-Behnken CCD

1.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 溫度對(duì)抗菌蛋白的影響 取100 mL抗菌蛋白分別在40、60、80、100 ℃條件下水浴熱處理30 min,121 ℃條件下熱處理15 min,以未處理的樣品作對(duì)照,以禾谷鐮孢菌為指示菌分別做抑菌實(shí)驗(yàn),測(cè)量抑菌圈直徑,每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5.2 pH對(duì)抗菌蛋白的影響 取100 mL抗菌蛋白分別置于11支離心管中,每管6 mL,用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)其pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11,最終容積保持10 mL,以加等量蒸餾水稀釋的菌液作為對(duì)照,然后37 ℃溫浴4 h,后分別調(diào)至中性(pH6.5～7.5),以禾谷鐮孢菌為指示菌分別做抑菌實(shí)驗(yàn),測(cè)抑菌圈直徑,每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5.3 蛋白酶對(duì)抗菌蛋白的影響 取100 mL抗菌蛋白分裝在1.5 mL 離心管中,分別加入5 mg/mL蛋白酶K、5 mg/mL胰蛋白酶、5 mg/mL胃蛋白酶,37 ℃水浴恒溫2 h,以未添加蛋白酶處理的樣品作為對(duì)照,以禾谷鐮孢菌為指示菌用牛津杯法做抑菌實(shí)驗(yàn),每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2003、SAS 8.0和Design-Expert(version8.0.6)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析,應(yīng)用最小差異顯著法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響 由圖1所示,發(fā)酵初期處于遲滯期,沒(méi)有代謝大量的發(fā)酵產(chǎn)物。隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長(zhǎng),抗菌蛋白粗提液抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì),發(fā)酵時(shí)間對(duì)其影響極顯著(p<0.01),并在24 h時(shí)達(dá)到最大(20.35±0.61) mm。隨時(shí)間繼續(xù)增長(zhǎng),該菌株由穩(wěn)定期進(jìn)入降速期,菌數(shù)量逐漸減少,分泌抗菌蛋白能力降低導(dǎo)致抑菌活性逐漸減弱。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.1 Effect of fermentation time on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響 由圖2所示,隨溫度升高,抑菌活性呈先上升后下降的趨勢(shì),發(fā)酵溫度對(duì)其影響顯著(p<0.05),當(dāng)升至37 ℃時(shí)抑菌活性最高,抑菌圈直徑(20.84±0.15) mm。說(shuō)明細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生隨溫度升高而減少,由此可知,溫度過(guò)高不適于菌株的生長(zhǎng)。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.3 不同pH對(duì)菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響 由圖3所示,抑菌活性隨pH提高呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì),pH對(duì)其影響顯著(p<0.05)。pH會(huì)影響細(xì)胞中代謝酶的活性,從而對(duì)其生長(zhǎng)和代謝造成影響[13]。在pH2～4之間,抗菌蛋白抑菌活性相對(duì)較弱,表明菌株不能很好利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢;在pH5～7之間,抑菌圈逐漸增大,并在pH7時(shí)抑菌活性最高,抑菌圈直徑(19.96±0.89) mm;此后,抑菌活性隨pH升高逐漸降低。結(jié)果表明該菌株對(duì)過(guò)酸和過(guò)堿的條件都比較敏感,抑菌活性受到影響。

圖3 pH對(duì)菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.3 Effect of pH values on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.4 不同接種量對(duì)菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響 由圖4 所示,抑菌活性隨著接種量的增加呈現(xiàn)出不斷增大然后緩慢降低的趨勢(shì),接種量對(duì)其影響極顯著(p<0.01),并在4%時(shí)抑菌活性達(dá)到高峰,抑菌圈直徑達(dá)(20.23±0.71) mm。隨著接種量增大,抑菌活性開(kāi)始出現(xiàn)降低的趨勢(shì),這是由于在一定量培養(yǎng)基內(nèi),菌數(shù)增加產(chǎn)生空間與營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng),從而抑制菌體正常的生長(zhǎng),進(jìn)而致使抑菌物質(zhì)減少。因此,4%的接種量有利于抗菌粗蛋白的分泌和積累。

圖4 接種量對(duì)菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.4 Effect of inoculation volume on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.5 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株抗菌蛋白粗提液抑菌活性的影響 由圖5所示,抑菌活性隨著轉(zhuǎn)速的加快呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì),搖床轉(zhuǎn)速對(duì)其影響極顯著(p<0.01),在轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí),抑菌活性最高,抑菌圈直徑為(21.89±0.88) mm。搖床轉(zhuǎn)速是影響抗菌蛋白抑菌活性的主要因子,搖床發(fā)酵培養(yǎng)可增加通氣量。轉(zhuǎn)速太慢,通氣量小,不利于菌體生長(zhǎng);轉(zhuǎn)速過(guò)快,可能會(huì)導(dǎo)致菌體自溶,使生物量減少[14]。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.5 Effect of shaker rotation speed on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 如表3所示,17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中12個(gè)是析因點(diǎn),5個(gè)是零點(diǎn),析因點(diǎn)是自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn),零點(diǎn)表示區(qū)域的中心點(diǎn),其中重復(fù)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)5次,用以估算實(shí)驗(yàn)誤差。

表4 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for each item of developed quadratic regression model

注:* 代表差異顯著(p<0.05),**代表差異極顯著(p<0.01)

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及抑菌直徑Table 3 Box-Behnken CCD matrix and response values of inhibition zone diameter(IZD)

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert(version8.0.6,Stat-EaseInc.,MinneapolisN. USA)軟件對(duì)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)多元回歸擬合,獲得抑菌圈直徑(Y)對(duì)發(fā)酵時(shí)間(X1)、接種量(X2)和轉(zhuǎn)速(X3)的二次多項(xiàng)回歸模型為:

Y=20.95-1.02X1+0.67X2-0.020X3+1.13X1X2-0.45X1X3+0.19X2X3-0.761X12-1.24X22-0.70 X32

從方差分析表4中得出模型F值為5.59,對(duì)應(yīng)的p<0.05,達(dá)到顯著水平,失擬項(xiàng)的p=0.6533>0.05不顯著,說(shuō)明該模型擬合程度較好,實(shí)驗(yàn)誤差小,可以用此模型預(yù)測(cè)解淀粉芽孢桿菌HRH317抗菌蛋白發(fā)酵條件對(duì)抑菌活性的影響?；貧w方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果:X1時(shí)間的一次項(xiàng)極顯著(p<0.01),X2接種量的一次項(xiàng)及二次項(xiàng)顯著(p<0.05),交互項(xiàng)X1X2顯著(p<0.05),其他項(xiàng)均不顯著。由F值得出實(shí)驗(yàn)各因素對(duì)抑菌活性影響的主次順利為:X1>X2>X3,即時(shí)間>接種量>轉(zhuǎn)速。

根據(jù)模型方程繪制響應(yīng)面圖,分別見(jiàn)圖6～圖8。其中每個(gè)響應(yīng)面分別代表兩個(gè)變量在恒定值(取零水平值)下,另外兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用。

圖6顯示在轉(zhuǎn)速水平為0,即150 r/min時(shí),發(fā)酵時(shí)間與接種量對(duì)抑菌圈直徑的交互影響效應(yīng),二者具有顯著交互作用(p<0.05)。抑菌圈直徑隨著發(fā)酵時(shí)間逐漸延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),這是由于菌齡過(guò)大,細(xì)菌菌體可能會(huì)出現(xiàn)形態(tài)變異、自溶等現(xiàn)象,生理代謝活動(dòng)漸趨停滯,可代謝抑菌物質(zhì)的活菌數(shù)量降低,故而致使抑菌物質(zhì)抗菌蛋白產(chǎn)量減少。當(dāng)接種量范圍在3%～4%時(shí)抑菌圈直徑呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),隨著接種量的繼續(xù)加大,抑菌圈直徑逐漸下降。

圖6 發(fā)酵時(shí)間與接種量對(duì)抑菌圈直徑的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of fermentation time and inoculation volume on IZD

圖7顯示在接種量水平為0,即4%時(shí),轉(zhuǎn)速與發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的交互作用不顯著。發(fā)酵時(shí)間曲線表現(xiàn)較為平緩,在24～48 h的范圍內(nèi)變化不太明顯。轉(zhuǎn)速曲線有增長(zhǎng)趨勢(shì),表明隨著轉(zhuǎn)速的加快,搖瓶?jī)?nèi)發(fā)酵液的溶氧量不斷增加,菌株的生長(zhǎng)繁殖加快,發(fā)酵液的抑菌活性也隨之增加。

圖7 發(fā)酵時(shí)間與轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌圈直徑的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of fermentation time and shaker rotation speed on IZD

圖8顯示在發(fā)酵時(shí)間水平為0,即24 h時(shí),轉(zhuǎn)速與接種量對(duì)抑菌圈直徑的交互作用不顯著。轉(zhuǎn)速曲線表現(xiàn)較為平緩,抑菌圈直徑在100～200 r/min的范圍內(nèi)變化不太明顯。接種量范圍在3%～4%時(shí)抑菌圈直徑呈增加趨勢(shì),隨著接種量的繼續(xù)加大,抑菌圈直徑逐漸下降。

圖8 轉(zhuǎn)速與接種量對(duì)抑菌圈直徑的響應(yīng)面及等高線圖Fig.8 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of shaker rotation speed and inoculation volume on IZD

2.2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert(version8.0.6)軟件分析,獲得解淀粉芽孢桿菌HRH317產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵工藝的最適條件為:發(fā)酵時(shí)間24.4 h,接種量4.05%,轉(zhuǎn)速219 r/min,所得抗菌蛋白對(duì)禾谷鐮孢菌抑菌作用強(qiáng)?？紤]實(shí)際操作的方便性,將最適發(fā)酵參數(shù)修正為:發(fā)酵時(shí)間24 h,接種量4%,轉(zhuǎn)速200 r/min,在最適條件下進(jìn)行了3組重復(fù)性實(shí)驗(yàn),平均抑菌圈直徑為21.85 mm,與預(yù)測(cè)值22.05 mm擬合度良好,無(wú)顯著性差異(p>0.05),表明實(shí)驗(yàn)確定的模型條件可以用于預(yù)測(cè)實(shí)際值,此方程有效可靠。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 溫度對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響 如圖9所示,該抗菌蛋白熱穩(wěn)定性良好。在40～60 ℃下處理30 min后,其抑菌效果變化不大,表明穩(wěn)定性較好;溫度升至80 ℃下處理30 min,與對(duì)照相比其抑菌活性下降了30.9%,穩(wěn)定性受到影響;在100 ℃處理30 min抑菌活性顯著下降。結(jié)果表明,該抗菌蛋白在40～80 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖9 溫度對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.9 Effect of temperature on inhibitive activity of antifungal protein注:柱子上方不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)。圖10同。

2.3.2 pH對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響 如圖10所示,抗菌蛋白對(duì)酸、堿具有很好的穩(wěn)定性。與對(duì)照相比,在pH7～8 范圍內(nèi)抑菌活性基本不變,在pH2和pH11時(shí)仍分別保留原有活性的63.6%、71.4%。結(jié)果表明該抗菌蛋白pH范圍較寬,同時(shí)說(shuō)明其具有良好的酸堿穩(wěn)定性。因此實(shí)際應(yīng)用中該抗菌蛋白可適應(yīng)酸性、中性、堿性的條件。

圖10 pH對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.10 Effect of pH value on inhibitive activity of antifungal protein

表5 蛋白酶對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響Table 5 Effect of the protease on inhibitive activity of antifungal protein

注:抑菌圈直徑數(shù)據(jù)后的小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(p<0.05)。2.3.3 蛋白酶對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響 由表5可見(jiàn),蛋白酶K與對(duì)照相比差異不顯著(p>0.05),表明抗菌蛋白對(duì)其有一定耐受性;經(jīng)胰蛋白酶及胃蛋白酶處理,與對(duì)照相比,活性顯著下降,表明抗菌蛋白對(duì)二者敏感,即抗菌蛋白可被人體消化系統(tǒng)中的蛋白酶消化掉,不會(huì)對(duì)腸道內(nèi)有益微生物菌群造成影響,同時(shí)也不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不利的影響。因此該抗菌蛋白在食品果蔬防腐及生防中將會(huì)有很好的應(yīng)用。

3 討論與結(jié)論

菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)能力的高低對(duì)微生物相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)起著決定性的作用,然而微生物的發(fā)酵條件優(yōu)化恰恰又是一個(gè)關(guān)鍵步驟。響應(yīng)面法所需實(shí)驗(yàn)次數(shù)少,而且可以預(yù)測(cè)因素之間的相互作用,此方法進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[15-16]。郝秋娟等[17]采用分段控溫工藝優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌BS5582產(chǎn)蛋白,得到最佳條件:接種量6.67%、轉(zhuǎn)速500 r/min,發(fā)酵溫度35 ℃、經(jīng)過(guò)27 h發(fā)酵后溫度降至32 ℃繼續(xù)發(fā)酵,蛋白酶活在47.75 h達(dá)到9838 U/mL。方傳記[18]對(duì)ES-2-4產(chǎn)脂肽類抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的發(fā)酵條件采用Plackett-Burman Design 方法進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳條件,葡萄糖42 g/L、L-谷氨酸鈉14 g/L、溫度27 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、接種量4%、裝液量50 mL、搖床培養(yǎng)36 h,此條件下脂肽類抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量為6.76 g/L。本實(shí)驗(yàn)采用單因素與響應(yīng)面法對(duì)解淀粉芽孢桿菌HRH317產(chǎn)抗菌蛋白的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究,研究結(jié)果表明,發(fā)酵時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速及接種量是影響抗菌蛋白產(chǎn)量的主要因素,其中,接種量與發(fā)酵時(shí)間有顯著的交互作用。最佳條件為:在初始pH為7.0的NB培養(yǎng)液,接種量4%,37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)速為200 r/min,在此條件下抗菌蛋白的抑菌圈直徑達(dá)21.85 mm。

目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于芽孢桿菌抗菌蛋白的研究仍處于探索抗菌混合物基本特性的階段,很多研究成果是有關(guān)脂肽類抗菌素,抗菌蛋白的報(bào)道相對(duì)較少[19-21]。芽孢桿菌抗菌蛋白一般具有抗真菌和細(xì)菌等特性,其抗菌譜廣、穩(wěn)定性高、對(duì)熱、酶不敏感[22]。本研究中,實(shí)驗(yàn)菌株所產(chǎn)抗菌蛋白在40～80 ℃熱穩(wěn)定性良好,在100 ℃與121 ℃下分別處理30 min與15 min,抑菌活性顯著下降。這與學(xué)者劉永峰[23]研究枯草芽孢桿菌Bs-916胞外抗菌蛋白在120 ℃時(shí)仍具有一定的抑菌活性一致。所產(chǎn)抗菌蛋白有較寬的pH范圍,說(shuō)明耐酸堿性好。對(duì)蛋白酶K不敏感,這與學(xué)者張寶俊[24]和王軍華[25]研究的解淀粉芽孢桿菌LP-5抗菌蛋白和解淀粉芽孢桿菌Q-12抗菌蛋白均對(duì)蛋白酶K不敏感相同,但對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶較敏感這一方面有區(qū)別。這說(shuō)明該抗菌蛋白能被人體蛋白酶所降解,這對(duì)其在果蔬和食品防腐領(lǐng)域應(yīng)用具有重要意義。

[1]梁泉峰. 間型假比酵母菌對(duì)果蔬采后腐敗霉菌拮抗作用的研究[D]. 泰安:山東大學(xué),2002.

[2]Zheng Y,Chen YS,Lu HS. Screening for antibacterial and antifungal activities in some marine algaefrom the Fu-jian coast of China[J]. China Oceanol Limnol,2001,19(4):326-331.

[3]黃春萍,張宏,張曉喻. 植物抗真菌蛋白的分類及抗菌機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè),2007,28(4):167-171.

[4]Yuan Bo,Wang Zhe,Qin Sheng,et al. Study of the anti-sapstain fungus activity of Bacillus amyloliquefaciens CGMCC 5569 associated with Ginkgo biloba and identification of its active components[J]. Bioresource Technology,2012,114:536-541.

[5]Mohamed S O,Dharini S,Lise K. 生物抑制劑解淀粉芽孢桿菌結(jié)合1-甲基環(huán)丙烯處理在果實(shí)采后病害控制及品質(zhì)保持中的作用效果[J]. 保鮮與加工,2011(2):56-56.

[6]郝衛(wèi)寧,李輝,胡美英,等. 柑桔綠霉病拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定及其抑制效果[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào),2011,27(2):284-288.

[7]韓玉竹,鄧釗,張寶,等. 解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件優(yōu)化和提取方法比較研究[J]. 食品科學(xué),2015,36(15):135-141.

[8]Zhao Zhenzhen,Wang Qiushuo,Wang Kaimei,et al. Study of the antifungal activity of Bacillus vallismortisZZ185invitroand identification of its antifungal components[J]. Bioresource Technology,2010,101:292-297.

[9]Slavokhotova A A,Rogozhin E A,Musolyamov A K,et al. Novel antifungal a-hairpinin peptide from Stellaria media seeds:structure,biosynthesis,gene structure and evolution[J]. Plant Molecular Biology,2014,84:189-202.

[10]胡劍,林心怡,張九一,等. 拮抗菌BS-98 分泌抗菌蛋白的條件及其發(fā)酵液特性[J].微生物學(xué)通報(bào),1996,23(6):323-326.

[11]洪鵬,安國(guó)棟,胡美英,等. 解淀粉芽抱桿菌HF-01發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào),2013,29(4):569-578.

[12]楊橋,韓文菊,張文俊,等. 產(chǎn)Maerolactin A抗生素海洋解淀粉芽孢桿菌的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 藥物生物技術(shù),2009,16(4):311-315

[13]辛媛媛,侯美玲,郝志敏,等. 一株拮抗細(xì)菌HJ5高產(chǎn)抗菌物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(4):70-74.

[14]周映華,李秋云,曾艷,等. 益生菌蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵條件及培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 飼料研究,2007(10):56-58.

[15]黃海蟬,裘娟萍. 枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(3):213-215.

[16]汪燕,羅水忠,蔡靜,等.響應(yīng)面法優(yōu)化茂源鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵條件[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(16):203-207.

[17]郝秋娟,李樹(shù)立,陳穎. 溫度對(duì)淀粉液化芽孢桿菌5582產(chǎn)蛋白酶的影響[J]. 中國(guó)釀造,2008(11):37-39.

[18]方傳記. 陸兆新,孫力軍. 淀粉液化芽孢桿菌抗菌脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(2):533-539.

[19]Claude P,Selitemnikoff. Antifungal Proteins[J]. Applied and Environmental Microbiology,2001,67(7):283-289.

[20]高學(xué)文,姚仕義,Huongpham,等. 基因工程菌枯草芽抱桿菌GEB3產(chǎn)生的脂肽類抗生素及其生物活性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36(12):1496-1501.

[21]SL Wang,YH Yen,GC Tzeng,et al. Production of antifungal material by bioconversion of shellfish wastes fermented by Pseudomonas fluorescensK-188[J]. Enzyme and Microbial Technology,2005,36:49-56.

[22]Ongena M,Jacques P. Bacillus lipoeptides:versatile weapons for plant disease biocontrol[J]. Trends in Microbiology,2008,6(3):115-125.

[23]劉永峰. 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Bs-916胞外抗菌蛋白質(zhì)的純化及其鑒定[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[24]張寶俊,張家榕,韓巨才,等.內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌LP-5抗菌蛋白的分離純化及特性[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2010,37(2):143-147.

[25]王軍華,權(quán)春善,徐洪濤,等. 解淀粉芽孢桿菌Q-12 抗真菌特性的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(6):47-50.

Optimization and stabilization of antifungal proteinfromBacillusamyloliquefaciensstrain HRH317

QIN Nan1,MIAO Wen-yu2,LI Xin3,HAO Lin3,*

(1.College of Pharmaceutical and Food Engineering,Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030619,China;2.Department of Management Engineering,Taiyuan City Vocational College,Taiyuan 030027,China;3.College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

This paper is concerned with the antifungal protein extraction from the strainsBacillusamyloliquefaciensHRH317. The inhibitive circle diameter as evaluating indicator,the fermentation condition were optimized by single factor experiments and response surface methodology(RSM). The results showed the optimized extraction parameters were that the initial pH value of nutrient broth medium(NB)was 7,inoculation volume of 4%,37 ℃,and the shaker rotation speed 200 r/min. The inhibitive circle diameter was up to 21.85 mm. The results indicated that the antifungal protein was proved to have strong inhibition effect. The antifungal protein was tested to have strong tolerant to proteinase K,which could be steady with 40～80 ℃ and pH2～11.

Bacillusamyloliquefaciens;antifungal protein;response surface methodology;stability

2016-12-23

秦楠(1981-),男,博士,講師,研究方向:食品微生物及功能食品加工,E-mail:bszy6688@163.com。

*通訊作者:郝林(1957-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物與發(fā)酵技術(shù),E-mail:sxhaolin2014@163.com。

山西省衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(201601115);山西中醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金資助；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD38B07)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0130-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.024