陳 敏，楊潔亮，呂麗霞，陳華容，唐 源

全自動(dòng)熒光原位雜交儀實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化及與手工方法的對(duì)比

陳 敏，楊潔亮，呂麗霞，陳華容，唐 源

全自動(dòng)雜交儀；熒光原位雜交；石蠟包埋組織樣本

近年來，熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)廣泛應(yīng)用于分子靶向治療、腫瘤診斷、鑒別診斷以及腫瘤預(yù)后評(píng)估方面[1]。FISH技術(shù)通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交。在熒光顯微鏡下觀察并分析細(xì)胞核內(nèi)雜交于DNA靶序列的探針信號(hào)，以獲得細(xì)胞核內(nèi)染色體(或染色體片段)上基因狀態(tài)的信息[2]。本科室自2010年開展FISH檢測(cè)臨床工作以來，每年完成約2 000例/2500項(xiàng)基因的FISH檢測(cè)工作。包括乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、軟組織腫瘤等石蠟包埋組織樣本及新鮮血液和尿液樣本。積累了較多的FISH實(shí)驗(yàn)操作和閱片經(jīng)驗(yàn)。近期，我科室引進(jìn)兩套徠卡全自動(dòng)熒光原位雜交儀Leica S600(ThermoBrite Elite, TBE)及操作系統(tǒng)。為了驗(yàn)證全自動(dòng)熒光原位雜交儀的實(shí)用性，本實(shí)驗(yàn)選取了120例石蠟包埋實(shí)體瘤組織樣本摸索TBE實(shí)驗(yàn)條件，并比較其與手工方法的差異。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2016年4月四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科存檔的浸潤(rùn)性乳腺癌組織樣本40例；肺癌、淋巴瘤、軟組織腫瘤及神經(jīng)腫瘤石蠟包埋樣本各20例，共計(jì)120例。

1.2 儀器試劑 TBE系統(tǒng)，熒光顯微鏡Leica DM600，AI 4.0采圖系統(tǒng)，Abbott ThermoBrite原位雜交儀，水浴鍋，離心機(jī)。

FISH探針包括：乳腺癌Pathvysion HER-2探針，肺癌ALK與ROS1雙色分離探針；淋巴瘤BCL-2、BCL-6、c-myc雙色分離探針；神經(jīng)腫瘤1P19Q缺失探針；軟組織腫瘤MDM2擴(kuò)增探針、SS18雙色分離探針(所有探針均購(gòu)自Abbott Vysis公司)。胃蛋白酶(購(gòu)自Sigma公司)，鹽酸，檸檬酸，SSC，NP-40，環(huán)保脫蠟劑，各濃度梯度乙醇。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 每例石蠟包埋組織連續(xù)切片，準(zhǔn)備5張4 μm厚防脫切片，其中2張進(jìn)行TBE雜交，1張手工雜交，1張常規(guī)HE染色，1張備用。65 ℃過夜烤片。

1.3.2 手工方法 (1)環(huán)保脫蠟劑脫蠟1 h，乙醇梯度復(fù)水。(2)預(yù)處理：高溫高壓4 min(電磁爐中功率加熱，噴氣后計(jì)時(shí)4 min，氣壓為2個(gè)大氣壓，鍋內(nèi)溫度120 ℃左右)。(3)消化：0.1 mg/mL胃蛋白酶37 ℃消化12～25 min。(4)0.2 mol/L鹽酸5 min，梯度乙醇脫水，自然干片。(5)雜交變性：85 ℃變性5 min，45 ℃雜交過夜。(6)清洗：0.3%NP-40/0.4×SSC 72 ℃洗片2 min；0.1%NP-40/2×SSC室溫2 min；2×SSC室溫2 min。(7)復(fù)染：滴加15 μL DAPI復(fù)染后蓋上蓋玻片，暗處放置15 min后鏡下觀察。

1.3.3 TBE方法 TBE主要參數(shù)：共分為3個(gè)小缸，每缸可放4張切片，單張可放12張切片，背靠背最多可做24張切片。放12張切片時(shí)，進(jìn)液量為164%；24張時(shí)，進(jìn)液量為200%。切片架的擺動(dòng)頻率為12次/分。常規(guī)增設(shè)管道及切片的沖洗，梯度升降溫。除人工滴加探針并進(jìn)行封片外，所有步驟均在機(jī)器上完成。胃蛋白酶及其他所有試劑的配制、變性雜交以及清洗的步驟均與手工方法一致。TBE選取兩種預(yù)處理方法，分別為蒸餾水與10 mmol/L pH 6.0檸檬酸95 ℃處理30 min。消化時(shí)間：乳腺癌消化15 min；肺癌、淋巴瘤及神經(jīng)類腫瘤消化18 min；軟組織腫瘤樣本消化25 min。

1.4 質(zhì)控及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[1]手工與TBE每輪實(shí)驗(yàn)均增加1張經(jīng)FISH驗(yàn)證的陽性對(duì)照石蠟組織。陰陽性信號(hào)正常，染色背景低，細(xì)胞核輪廓清晰可見，≥75%的細(xì)胞可見清晰的紅綠信號(hào)。采用雙盲法判讀，將雜交結(jié)果標(biāo)記為“成功”與“失敗”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

TBE與手工方法的合格率均>90%，TBE系統(tǒng)雜交背景低于手工染色(圖1、2)。TBE兩種預(yù)處理方法合格率與手工方法接近(表1)。其中去離子水預(yù)處理的合格率為90.8%(109/120)，低于檸檬酸93.3%(112/120)的結(jié)果。此兩種預(yù)處理方法的雜交效果在淋巴瘤及神經(jīng)腫瘤樣本上無差異，均全部成功。在處理乳腺癌、肺癌及軟組織腫瘤時(shí)，去離子水預(yù)處理切片的合格率稍低于檸檬酸。手工方法的合格率為91.7%，在處理乳腺癌HER-2基因及軟組織腫瘤類基因時(shí)的雜交效果優(yōu)于TBE；而在肺癌、淋巴瘤及神經(jīng)類樣本中的合格率稍低于TBE。

表1 TBE與手工方法結(jié)果對(duì)比

3 討論

FISH技術(shù)在臨床病理診斷、鑒別診斷及靶向治療方面應(yīng)用廣泛。石蠟包埋組織FISH檢測(cè)的關(guān)鍵步驟包括前期的預(yù)處理和酶消化[2-3]。預(yù)處理方法多樣，有商品化的預(yù)處理試劑盒、水煮[4]、高溫高壓[5]、檸檬酸[6]等。預(yù)處理主要是通過物理或化學(xué)作用，解除甲醛包埋過程中形成的交聯(lián)，有效的暴露細(xì)胞核，便于探針進(jìn)入。本實(shí)驗(yàn)使用TBE系統(tǒng)與手工方法對(duì)常規(guī)石蠟包埋組織乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、神經(jīng)腫瘤及軟組織腫瘤樣本行FISH實(shí)驗(yàn)。選取去離子水與10 mmol/L pH6.0檸檬酸兩種預(yù)處理方法進(jìn)行TBE機(jī)染，合格率分別為90.8%、93.3%。檸檬酸效果略優(yōu)于去離子水，可能與檸檬酸的化學(xué)和酸作用相關(guān)[6]。TBE系統(tǒng)與手工方法(91.7%)的合格率接近。手工方法使用高溫高壓去離子水煮4 min，簡(jiǎn)單易行無需配制試劑，可廣泛推廣。

在胃蛋白酶消化方面：乳腺癌、肺癌與淋巴瘤組織細(xì)胞密度大，腫瘤細(xì)胞常呈巢團(tuán)狀，比較容易消化[7]，一般消化15～18 min。軟組織腫瘤樣本如脂肪相關(guān)腫瘤，細(xì)胞密度低，常伴有脂肪空泡，黏液或者出血壞死以及鈣化等成分，比較難消化，可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，一般消化25～30 min。而TBE系統(tǒng)不能針對(duì)每一樣本單獨(dú)調(diào)節(jié)消化時(shí)間，每缸必須運(yùn)行統(tǒng)一的消化時(shí)間。手工方法可以針對(duì)每一樣本，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)結(jié)合組織形態(tài)，通過明場(chǎng)顯微鏡觀察后，選擇合適的消化時(shí)間。因而手工方法在處理軟組織腫瘤樣本的合格率高于TBE染色。

TBE前期處理時(shí)間2 h左右，每天機(jī)器可反復(fù)使用[8]，環(huán)保高效。由于FISH實(shí)驗(yàn)中探針價(jià)格昂貴，此機(jī)器未實(shí)現(xiàn)探針滴加的自動(dòng)化，必須手工滴加探針并封片，未能做到全封閉。

注意事項(xiàng)：上機(jī)前仔細(xì)檢查各試劑管道接口是否正確，試劑量是否足夠，切片是否安放正確，檢查廢液桶排空情況等。酶消化液現(xiàn)配現(xiàn)用，未使用完的酶消化液必須及時(shí)清理防止長(zhǎng)菌，污染管道。除酶外的試劑，短時(shí)間內(nèi)可常溫放置。定期保養(yǎng)和清洗管道和染色缸，以免堵塞而影響機(jī)器的正常使用。在染色過程中密切觀察機(jī)器的運(yùn)行情況，遇到問題及時(shí)解決，并用專用記錄本登記。

①A①B①C②A②B②C

圖1 TBE檸檬酸預(yù)處理c-myc基因雜交結(jié)果，分別為單通道紅色(A)、綠色(B)及重疊圖(C):可見紅綠信號(hào)背景較低，很容易區(qū)分信號(hào) 圖2 手工方法高溫高壓預(yù)處理c-myc基因雜交結(jié)果；分別為單通道紅色(A)、綠色(B)及疊加圖(C):可見手工方法紅綠信號(hào)背景較高(白色箭頭)，三通道下可見一些雜信號(hào)(黑色箭頭)，影響判讀

TBE從質(zhì)量、速度、穩(wěn)定性等諸多方面，實(shí)現(xiàn)了病理檢查結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化，為臨床診斷提供可靠的參考依據(jù)。

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四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科，成都 610041

陳 敏，女，碩士研究生。Tel: (028)85422643，E-mail: 39005388@qq.com 唐 源，女，副主任技師，通訊作者。E-mail: 1202ty@163.com

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1001-7399(2017)06-0694-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.026

接受日期：2017-02-13