劉峰舟，荊哲，劉明莉，張恩尉，寧江華，牟佼

EMRE在小鼠心肌缺血損傷中的作用及其相關機制的研究

劉峰舟，荊哲，劉明莉，張恩尉，寧江華，牟佼

目的：研究調(diào)節(jié)線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體活性所必須的蛋白（essential MCU regulator，EMRE）在小鼠心肌缺血損傷中發(fā)揮的作用及其相關機制。

方法：利用心肌點注射EMRE腺病毒（Ad-EMRE）上調(diào)心肌組織的EMRE分子表達水平，對照小鼠心肌點注射增強綠色熒光蛋白腺病毒（Ad-eGEP），48 h后，采用結(jié)扎小鼠左冠狀動脈前降支方法建立心肌梗死（MI）模型。實驗設置三組：假手術組（給予Ad-eGFP）；心肌梗死對照組（給予Ad-eGFP）；心肌梗死處理組（給予Ad-EMRE）。三周后，利用小動物超聲系統(tǒng)測定小鼠心臟功能；Western blot及免疫組化檢測EMRE分子的表達；麥胚凝集素（WGA）染色檢測心肌細胞肥大程度；馬松（MASSON）染色檢測心肌組織膠原含量；原位末端標記法（TUNEL）檢測心肌組織的細胞凋亡；Western blot檢測心肌組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）的表達；MitoSOX熒光探針檢測線粒體ROS水平。

結(jié)果：與心肌梗死對照組相比，心肌梗死處理組的心功能明顯變差,心肌肥厚明顯加重,心肌組織膠原纖維含量更高。另外，心肌梗死處理組的心肌細胞凋亡明顯增多，Caspase-3和Caspase-9表達明顯升高，線粒體活性氧簇產(chǎn)生也明顯增多。

結(jié)論：EMRE過表達可增加線粒體ROS生成，誘導心肌細胞凋亡，加重心肌缺血損傷。

線粒體轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)類；心肌缺血

(Chinese Circulation Journal,2017,32:701.)

心肌缺血損傷是心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制之一[1]，然而心肌缺血損傷的機制尚未闡明清楚。目前的研究表明，線粒體鈣超載，線粒體損傷，細胞凋亡和壞死等在心肌缺血損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[2,3]。調(diào)節(jié)線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體活性所必須的蛋白（essential MCU regulator，EMRE）位于線粒體內(nèi)膜，單次跨膜蛋白，維持線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體（ mitochondrial calcium uniporter，MCU）的正常功能，參與線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[4,5]。目前，EMRE在心肌缺血損傷中的作用鮮有報道，為了明確EMRE在心肌缺血損傷中的作用，本研究擬在小鼠心肌點注射EMRE腺病毒（Ad-EMRE）上調(diào)EMRE表達的基礎上，建立心肌梗死模型，以此來探討EMRE在心肌缺血損傷中的作用及其相關機制，期望為臨床心肌缺血損傷的防治提供新的靶點和方向。

1 材料與方法

1.1實驗材料

8周齡雄性C57BL/6小鼠30只購自第四軍醫(yī)大學動物中心，微量注射器購自瑞士漢密爾頓公司，Ad-EMRE和Ad-增強綠色熒光蛋白（eGFP）均為本實驗室已有，EMRE抗體購自美國Santa cruz公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）和β-肌動蛋白（β-actin）抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自武漢三鷹公司，電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液購自美國Advansta公司，聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）購自美國Invitrogen公司，蛋白定量、細胞總蛋白提取試劑盒，購自上海碧云天公司，麥胚凝集素（ wheat germ agglutinin，WGA）購自美國Sigma公司，原位末端標記法（TUNEL）凋亡檢測試劑盒購自瑞士羅氏公司，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核標記染料購自美國Invitrogen公司，MitoSOX Red熒光探針購自美國Invitrogen公司，PBS緩沖液（pH=7.4；主要成分：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L， KH2PO42 mmol/L）實驗室配制。

1.2方法

實驗分組及EMRE表達上調(diào)：將30只8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為三組（每組10只）：假手術組（給予Ad-eGFP）；心肌梗死對照組（給予AdeGFP）；心肌梗死處理組（給予Ad-EMRE）。經(jīng)小鼠左胸第4~5肋間暴露心臟，利用微量注射器在小鼠左心室心肌壁內(nèi)分別注射Ad-EMRE和Ad-eGFP（30 μl），然后將心臟置回并排空胸腔氣體，采用荷包法縫合傷口。48 h后，每組隨機選取3只，提取心肌組織蛋白，蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測EMRE表達水平。

心肌梗死小鼠模型建立：小鼠心肌點注射Ad-EMRE 48 h后，在左胸同一位置暴露心臟，通過結(jié)扎左冠狀動脈（冠脈）前降支建立心肌梗死模型，術后心電圖顯示心肌出現(xiàn)缺血，即確認心梗模型成功建立。

心功能檢測：利用異氟烷麻醉小鼠，待其狀態(tài)穩(wěn)定后，采用加拿大Visual Sonics公司所產(chǎn)的Vevo 2100高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)檢測小鼠心功能變化，利用Vevo 2100系統(tǒng)分析軟件進行數(shù)據(jù)的處理分析，測量小鼠左心室射血分數(shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）。

心肌組織學分析：取小鼠心臟，用預冷的PBS緩沖液沖洗心臟，取冠脈結(jié)扎部位以下心肌組織，用10%的福爾馬林溶液固定48 h后，進行掛機，包埋，制作石蠟切片。冰凍切片則無需固定，用包埋劑處理新鮮心肌組織后，進行制片。麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）對小鼠心臟組織的冰凍切片進行染色檢測心肌細胞肥大情況，WGA可以特異性的標記心肌細胞膜，呈現(xiàn)紅色熒光，顯示心肌細胞橫截面的輪廓，共聚焦顯微鏡觀察拍照，利用Image-Pro Plus 6軟件進行數(shù)據(jù)分析計算心肌細胞的平均橫截面積[6,7]。馬松（MASSON）染色檢測心肌組織纖維化水平，光學顯微鏡下，每張切片隨機選取六個視野進行觀察拍照，Image-Pro Plus 6軟件分析心肌組織膠原纖維容積分數(shù)，膠原纖維容積分數(shù)=膠原纖維面積/視野總面積。

TUNEL熒光標記法檢測心肌細胞凋亡：按照試劑盒說明處理標本進行檢測，DAPI可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結(jié)合標記為藍色熒光，TUNEL可以特異性的將凋亡細胞中損傷斷裂的基因組DNA標記為綠色熒光，當心肌細胞核被同時標記為藍色和綠色熒光時提示該心肌細胞發(fā)生了凋亡。

心肌組織蛋白提取及Western blot 法檢測EMRE分子的表達：取左前降支結(jié)扎部位以下的心肌組織，預冷PBS緩沖液洗兩遍，勻漿器勻漿，再次PBS緩沖液清洗一遍后，離心去上清，加入裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解半小時，余步驟同細胞蛋白提取一致。隨后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，EMRE 抗體稀釋比例為1∶500，Caspase-3 抗體稀釋比例為 1∶1 000，Caspase-9 抗體稀釋比例為 1∶800，β-actin 抗體稀釋比例為 1∶3 000，采用ECL化學發(fā)光試劑盒進行檢測。

心肌細胞線粒體活性氧簇（MitoROS）檢 測：利 用 熒 光 探 針MitoSOX Red（Invitrogen）對小鼠心肌組織的石蠟切片進行染色，檢測心肌細胞線粒體的活性氧（ROS）水平。MitoSOX Red是一種特異性靶向線粒體的新型熒光染料。MitoSOX Red被超氧化物氧化，氧化之后可以與核酸結(jié)合發(fā)出紅色的熒光。因此，我們可以通過檢測紅色熒光的強弱來反映線粒體ROS的水平。紅色熒光越強，提示MitoROS水平越高，MitoSOX Red（5μmol/L）室溫避光孵育15min，PBS緩沖液洗片后，共聚焦顯微鏡拍照，并利用Image-Pro Plus 6軟件進行熒光強度的分析和處理[8]。

統(tǒng)計學方法：采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù) ± 標準差（ ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ one-way ANOVA），P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1上調(diào)EMRE對心肌梗死模型小鼠心臟功能的影響（圖1）

在C57小鼠心肌點注射Ad-EMRE腺病毒48h后，Western blot檢測心肌組織EMRE的表達水平。結(jié)果顯示，心肌梗死處理組小鼠心肌組織中的EMRE表達水平明顯高于心肌梗死對照組的小鼠（P<0.01）。心肌梗死三周后，小動物超聲結(jié)果顯示，與心肌梗死對照組相比，心肌梗死處理組的左心室射血分數(shù)明顯較弱（P<0.01），短軸縮短率較低（P<0.01），心臟功能明顯變差。

圖1 過表達EMRE加重心肌損傷

2.2EMRE過表達促進心肌梗死模型小鼠心肌細胞肥大，加重心肌纖維化水平（圖2）

小鼠心肌缺血三周后，心肌組織免疫組化檢測EMRE表達水平；與其他兩組比較，EMRE在心肌梗死處理組表達水平最高（P<0.01）；Masson染色結(jié)果顯示，心肌細胞呈現(xiàn)紅色，膠原纖維呈現(xiàn)藍色，可以看出心肌梗死處理組的心肌組織膠原含量較心肌梗死對照組相比也明顯增多（P<0.01），纖維化水平升高，WGA染色結(jié)果顯示，與心肌梗死對照組比，心肌梗死處理組的心肌細胞平均橫截面積明顯增大，提示該組的心肌細胞肥大更加明顯（P<0.01）。

圖2 過表達EMRE加重心肌細胞肥大

2.3EMRE過表達對心肌細胞凋亡的影響（圖3）

TUNEL法檢測心肌組織細胞凋亡水平，DAPI染料與細胞核中的雙鏈DNA結(jié)合將心肌細胞核被標記為藍色，當心肌細胞發(fā)生凋亡時，損傷斷裂的核基因組DNA可被TUNEL標記為綠色熒光，心肌梗死處理組的心肌細胞凋亡水平明顯高于心肌梗死對照組和假手術組，提示EMRE過表達可以促進心肌細胞凋亡； Western blot檢測結(jié)果顯示，心肌梗死處理組的Caspase-3表達水平明顯高于心肌梗死對照組（P<0.01），和TUNEL檢測結(jié)果一致，Caspase-9的表達水平也明顯升高（P<0.01），提示EMRE過表達促進心肌細胞凋亡是通過線粒體途徑。

圖3 過表達EMRE促進心肌細胞凋亡

2.4EMRE過表達促進缺血導致的心肌細胞線粒體ROS生成（圖4）

利用MitoSOX Red染料對心肌組織的石蠟切片進行染色檢測線粒體ROS水平，心肌梗死處理組的紅色熒光強度明顯高于心肌梗死對照組，提示該組心肌細胞線粒體ROS生成明顯增加（P<0.01）。進一步說明EMRE過表達導致心肌細胞線粒體ROS水平增高，從而激活了線粒體途徑的細胞凋亡。

圖4 心肌組織石蠟切片染色顯示結(jié)果過表達EMRE促進心肌細胞線粒體活性氧的生成

3 討論

缺血性心臟病已成為致死和致殘的主要原因[9]。因此，深入研究心肌缺血損傷的干預靶點和治療措施是很有必要的。線粒體鈣信號參與調(diào)節(jié)細胞的多種生命活動，目前研究認為線粒體鈣穩(wěn)態(tài)與線粒體功能障礙，細胞死亡等密切相關[10,11]。線粒體功能紊亂與心肌缺血的發(fā)生及進展密切相關，是心肌缺血損傷的重要原因之一[12]。

EMRE在線粒體鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，維持線粒體功能的正常發(fā)揮。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在高糖高脂處理的H9C2細胞中，下調(diào)EMRE可以減少線粒體ROS的生成，抑制心肌細胞的凋亡[13]。但是在心肌缺血損傷中，EMRE發(fā)揮的作用及其相關機制尚不清楚，因此，我們推測EMRE通過影響線粒體功能參與了心肌缺血損傷的病理過程。

我們采用心肌點注射腺病毒方式，在小鼠心臟過表達EMRE分子，48 h后，每組隨機選擇三只小鼠，并提取心肌組織蛋白，采用Western blot方法檢測確認EMRE分子的過表達效果。在此基礎上，我們選擇結(jié)扎左前降支方式建立缺血模型，研究上調(diào)EMRE分子對心肌缺血損傷的影響。小動物超聲檢測小鼠心臟功能發(fā)現(xiàn)，過表達EMRE分子后，心肌梗死模型小鼠的左心室射血分數(shù)明顯低于對照組及假手術組，通過WGA染色和MASSON染色，我們觀察到心肌梗死處理組的小鼠的心肌細胞肥大及心肌組織的纖維化水平與心肌梗死對照組和假手術組相比有明顯的加重。進一步對心肌組織進行TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)EMRE過表達后的心肌細胞凋亡水平也明顯高于心肌梗死對照組。結(jié)果表明，上調(diào)EMRE可以明顯加重小鼠心肌缺血損傷，并且可能是通過增加心肌細胞的凋亡來參與心肌缺血損傷的病理過程。為了進一步研究相關機制，我們利用Western blot檢測了凋亡相關分子Caspase-3和Caspase-9 的表達水平，發(fā)現(xiàn)其在心肌梗死處理組的表達水平顯著高于其他組，進一步說明了上調(diào)EMRE可以引起內(nèi)源性的心肌細胞凋亡。隨后，我們利用MitoSOX Red熒光探針對線粒體的ROS水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)EMRE的上調(diào)可以明顯增加心肌細胞線粒體ROS的生成。目前的研究表明，線粒體鈣超載在心肌缺血損傷病程進展中發(fā)揮著重要作用，抑制線粒體鈣超載會減輕心肌缺血導致的損傷[3,14]，EMRE在調(diào)控線粒體鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要了作用，EMRE 的高表達致使線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體活性增高，進一步導致線粒體中鈣離子水平升高而使線粒體鈣超載，而線粒體鈣超載又是導致線粒體ROS生成增加的一個重要原因[3]。我們認為，在心肌缺血條件下，EMRE高表達進一步加重了線粒體的鈣超載，導致心肌梗死處理組的線粒體ROS水平明顯高于心肌梗死對照組，進而加重心肌缺血損傷。

總之，EMRE是近年來新發(fā)現(xiàn)的線粒體鈣攝取相關蛋白，在線粒體鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[4]，我們通過上調(diào)小鼠心肌組織中的EMRE表達水平發(fā)現(xiàn)，EMRE高表達可以通過誘導線粒體ROS水平升高，促進心肌細胞凋亡，從而加重心肌缺血損傷。本研究的局限性在于，我們只是觀察了EMRE高表達水平下心肌損傷的變化過程，并沒有對EMRE下調(diào)或者缺失條件下的心肌缺血損傷做進一步的研究，我們將在后續(xù)研究中，利用敲除動物模型對EMRE分子在小鼠心肌缺血損傷的作用機制進行更深層次的研究，期望對心肌缺血損傷的防治提供新的治療靶點和方向。

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Preliminary Research for the Effect of EMRE on Myocardial Ischemia Injury in Experimental Mice

LIU Feng-zhou, JING Zhe, LIU Ming-li, ZHANG En-wei, NING Jiang-hua, MOU Jiao.

Department of Cardiology, Xijing Hospital of Forth Military Medical University, Xi’an (710032), Shaanxi, China

MOU Jiao, Email: fzzxmj@126.com

Objective: To study the effect of essential MCU regulator (EMRE) on myocardial ischemia injury in experimental mice with underlining mechanism.

Methods: Myocardial EMRE expression was up-regulated by EMRE adenovirus (Ad-EMRE) injection in mice myocardium tissue. Our research included in 3 groups: Sham operation group, sham mice received myocardium injection of eGFP adenovirus (Ad-eGFP); Myocardial infarction (MI) control group, the mice received Ad-eGFP injection and 48 hours later had coronary LAD ligation to establish MI model; MI treatment group, MI mice received Ad-EMRE injection. All animals were treated in 3 weeks. Mice cardiac function was examined by ultrasound; cardiomyocyte hypertrophy was evaluated by wheat germ agglutinin (WGA) staining, collagen fibrosis was measured by Masson staining, cell apoptosis was determined by TUNEL assay, protein expressions of EMRE, caspase-3 and caspase-9 were detected by Western blot analysis and mitochondrial reactive oxygen species (ROS) was assayed by MitoSOX fluorescence probe.

Results: Compared with MI control group, MI treatment group showed the worse cardiac function, aggravated cardiac hypertrophy and elevated collagen fibrosis; in addition, MI treatment group had obviously increased cardiomyocyte apoptosis and increased protein expressions of Caspase-3, Caspase-9 and more mitochondrial ROS production.

Conclusion: Over expressed EMRE can increase mitochondrial ROS production, induce cardiomyocyte apoptosis and therefore, aggravate myocardial ischemia injury in experimental mice.

Mitochondrial transporter proteins; Myocardial ischemia

2016-11-29）

（編輯：許菁）

陜西省自然科學基礎研究計劃資助項目（2015JM8479）

710032 陜西省西安市，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科（劉峰舟、荊哲）；中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院 骨科（張恩尉）；西安市中心醫(yī)院（牟佼）；空軍94195部隊衛(wèi)生隊（劉峰舟、寧江華）；解放軍蘭州總醫(yī)院 心內(nèi)科（荊哲）；寶雞市第二中醫(yī)醫(yī)院 呼吸內(nèi)分泌科 （劉明莉）

劉峰舟 碩士研究生 主要研究方向：糖尿病心肌病及心肌缺血損傷防治 Email: liufengzhou1986@163.com 通訊作者:牟佼

Email: fzzxmj@126.com

R54

A

1000-3614（2017）07-0701-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.07.019